Name: a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells
Uploaded: 2020-03-04T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Biz Yardım için Yale Kök Hücre Çekirdeği (YSCC) ve Yale Kanser Merkezi (YCC) teşekkür ederiz. Dr. Jung Kim'e nöropatoloji incelemesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Connecticut Rejeneratif Tıp Araştırma Fonu, Dimes Mart ve NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), Yale Kanser Merkezi ve Yale Kanser Biyolojisi Eğitim Programı NCI CA193200 (E.B.) ve Joseph cömert bir sınırsız hediye ve tarafından desteklendi ve Lucille Madri.

1. Kök Hücre Bakımı
<ol><li>Büyüme faktörü azaltılmış bodrum membran matris bir tabaka üzerinde H9 hESCs korumak (Malzemeler Tablosubakınız , bundan böyle sadece matris olarak anılacaktır) üreticinin talimatlarına göre.<ol>
<li>Bir 6-iyi plaka veya bir 10 cm çanak kaplamak için, buz gibi Dulbecco'nun modifiye Eagle orta (DMEM)/F12 medya 5,9 mL ile matris 100 μL birleştirir. Plakaları parafin filmine sarın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Aşırı matris/ortam aspire edildik...

<ol>
	<li>Northcutt, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+vertebrate+brain+evolution.">Understanding vertebrate brain evolution.</a> Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).</li><li>Roth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).</li><li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+brain+in+numbers:+a+linearly+scaled-up+primate+brain.">The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain.</a> Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).</li><li>Roth, G., Dicke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+brain+and+intelligence.">Evolution of the brain and intelligence.</a> Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).</li><li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals.">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+telencephalic+precursors+from+embryonic+stem+cells.">Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells.</a> Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).</li><li>Kadoshima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-organization+of+axial+polarity,+inside-out+layer+pattern,+and+species-specific+progenitor+dynamics+in+human+ES+cell-derived+neocortex.">Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+motoneurons+from+human+embryonic+stem+cells.">Specification of motoneurons from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).</li><li>Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+differentiation+of+transplantable+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells.">In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).</li><li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture.">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrigel:+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture.">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Region-Specific+Organoids+Using+Mini-bioreactors+for+Modeling+ZIKV+Exposure.">Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure.</a> Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).</li><li>Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+assembly+of+human+brain+region-specific+three-dimensional+cultures.">Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures.</a> Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).</li><li>Kelava, I., Lancaster, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Models+of+Human+Brain+Development.">Stem Cell Models of Human Brain Development.</a> Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).</li><li>Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minocycline+mitigates+the+effect+of+neonatal+hypoxic+insult+on+human+brain+organoids.">Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids.</a> Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).</li><li>Bergmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain-barrier+organoids+for+investigating+the+permeability+of+CNS+therapeutics.">Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).</li><li>Mansour, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+functional+and+vascularized+human+brain+organoids.">An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids.</a> Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).</li><li>Pham, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+vascularized+brain+organoids.">Generation of human vascularized brain organoids.</a> Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).</li><li>Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+specification+of+telencephalic+glutamatergic+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells.">The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).</li></ol>

Diğer organoid modellere benzer şekilde, bu çeşitli uyarılar ile birlikte gelen yapay bir sistemdir. Genel ifade düzeyleri açısından toplu olarak çok az parti olmasına rağmen, bireysel organoidler farklılıklar sergiledi. Örneğin, Sox-2 pozitif alanların yeri her organoidde aynı değildi (Şekil 3). QPCR hücre toplu genel değişiklikleri aramak için uygun olsa da, tek hücreli RNAseq gibi ek teknikler hücre bazında daha fazla bilgi toplamak için gelecekteki çalışmalarda kullanı...

Sayısız pratik ve etik sınırlamalar nedeniyle, insan beynini incelemekte büyük bir zorluk olmuştur. Kemirgenler kullanan çalışmalar insan beyninin anlayışı için kritik olmuştur iken, fare beyin birçok farklılıklar vardır1,2. İlginçtir, fareler primatbeyin3,4en az 7 kat daha az bir nöronal yoğunluğu var. Primatlar insanlara evrimsel açıdan kemirgenlerden daha yakın olsalar da, çoğu araştırmacının onlarla çalışması pratik değildir. Bu protokolün amacı, beyin hücresi çeşitliliği ve hücresel örgütlenmeyi korurken heterolog bir bazal membran matrisine veya eksojen büyüme faktörlerine gerek kalmadan basitleştirilmiş ve daha ucuz bir yöntem kullanarak insan beyninin birçok önemli özelliğini özetlemekti.
Sasai laboratuarından biçimlendirici çalışma sinyalize embriyonik kök hücrelerden iki ve üç boyutlu nöronal hücre tipleri oluşturmak için embriyoid organların serum ücretsiz kültür (SFEBq) yöntemi kullanılır (ESCs)5,6. Birçok insan beyin organoid yöntemleri sinyalize ESCs nispeten benzer bir yol izlemiştir7,8. Buna karşılık, bu protokol müstakil insan ESCs kümeleri ile başlar (hESCs), kaplama adımları önce Thomson ve Zhang laboratuvarlarının seminal çalışmanın ilk adımları benzer9,10 yanı sıra eksojen büyüme faktörlerinin eklenmesinden önce Pasca laboratuvarının beyin organoid protokolünün ilk adım11. Bazal membran matrisler (örneğin, matrigel) birçok beyin organoid protokolleri kullanılmıştır ve etkili bir iskele olduğu gösterilmiştir8. Ancak, en sık kullanılan bazal membran matrisler onlar üretim sırasında toplu değişkenlik için toplu büyüme faktörlerinin bilinmeyen miktarlarda co-arındırmak gibi komplikasyonlar olmadan gelmez12. Buna ek olarak, bu matrisler görüntülemekarmaşık ve kontaminasyon ve maliyet riskini artırabilir.
İnsan beyin organoidler birçok soruya cevap için kullanılabilir iken, akılda tutulması gereken bazı sınırlamalar vardır. İlk olarak, embriyonik kök hücrelerden başlayarak, organoidler daha yakından yaşlı beyinlere göre olgunlaşmamış beyinler benzer ve bu nedenle yaşlılıkta meydana gelen hastalıklar için ideal modeller olmayabilir, Alzheimer hastalığı gibi. İkinci olarak, protokolümüz de konserde birden fazla beyin bölgesinden hücreler üzerinde bir tedavi veya hastalığın etkisini incelemek için yararlı olan ön beyin, orta beyin ve arka beyin gelişimi belirteçleri bulundu, diğer protokoller belirli beyin bölgeleri üzerinde konsantre takip edilebilir13,14. Son olarak, organoid modellerin bir diğer sınırlama boyutu, bir insan beyninin ortalama uzunluğu ise yaklaşık 167 mm, ajitasyon kullanımı ile yapılan beyin organoidler kadar büyümek 4 mm8 ve bu protokol tarafından oluşturulan organoidler 10 hafta 1-2 mm büyür. Yine de, bu protokol insan beyin dokusu ve birden fazla hücre tiplerinin etkileşimi incelemek için önemli bir araç sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-mouse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>A11035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>Life Technologies, Carlsbad, CA, USA</td>
			<td>PHG0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>A9647</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX43 microscope</td>
			<td>Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI stain</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>07913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010023" target="_blank">10010023</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluroSave</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>345789</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFAP antibody</td>
			<td>NeuroMab, Davis, CA</td>
			<td>N206A/8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix)</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H9 hESCs</td>
			<td>WiCell, Madison, WI, USA</td>
			<td>WA09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>9041-08-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iQ SYBR Green Supermix</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1708891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>M6145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTESR media</td>
			<td>STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 NeuroPlex</td>
			<td>Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA</td>
			<td>400-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td>
			<td>ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Gibco, Waltham, MA, USA</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum (NDS)</td>
			<td>ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA</td>
			<td><a href="https://www.jacksonimmuno.com/catalog/products/017-000-121" target="_blank">017-000-121</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT</td>
			<td>Sakura Finetek, Torrance, CA, USA</td>
			<td>25608-930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA</td>
			<td>RT15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR machine</td>
			<td>Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA</td>
			<td>1855196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy kit</td>
			<td>Qiagen, Hilden, Germany</td>
			<td>74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sox2</td>
			<td>MilliporeSigma, Burlington, MA</td>
			<td>AB5603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMS-F microscope</td>
			<td>Nikon, Melville, NY, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-low attachment T75 flasks</td>
			<td>Corning, Corning, NY, USA</td>
			<td>3814</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a static self-directed method for generating brain organoids from human embryonic stem cells

Embriyonik kök hücrelerden farklı laşan insan beyin organoidleri, üç boyutlu bir sistemde birden fazla hücre türünün karmaşık etkileşimlerini incelemek için eşsiz bir fırsat sunar. Burada beyin organoidleri verimleri nispeten basit ve ucuz bir yöntem salıyoruz. Bu protokolde insan pluripotent kök hücreleri tek hücreler yerine küçük kümelere ayrılır ve heterolog bir bazal membran matrisi veya eksojen büyüme faktörleri olmaksızın temel ortamda büyütülür ve içsel gelişimsel ipuçlarının organoid in büyümesi. Bu basit sistem glial ve mikroglial hücreler de dahil olmak üzere beyin hücresi türlerinin bir çeşitlilik üretir, kök hücreler, ve ön beyin nöronlar, orta beyin, ve arka beyin. Bu protokolden üretilen organoidler ayrıca brightfield görüntüleri, histolojisi, immünororesans ve gerçek zamanlı kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ile gösterilen uygun zamansal ve mekansal organizasyonun işaretlerini de göstermektedirler ( qRT-PCR). Bu organoidler beynin çeşitli bölgelerinden hücre tipleri içerdiğinden, çok sayıda hastalığın incelenmesinde kullanılabilirler. Örneğin, yakın zamanda yayınlanan bir makalede, hipoksinin insan beyni üzerindeki etkilerini incelemek için bu protokolden üretilen organoidlerin kullanımını gösterdik. Bu yaklaşım, nörogelişimsel handikaplar, genetik bozukluklar ve nörolojik hastalıklar gibi başka türlü zor koşulları araştırmak için kullanılabilir.

Şekil 1, protokolün farklı aşamalarında hücrelerin/organoidlerin nasıl göründüğünü göstermek için birkaç zaman noktasının temsili parlak alan görüntülerini gösterir. HESC'ler doku kültür plakasından çıkarıldı, küçük parçalara ayrıldı ve küreler oluşturdukları T75 ultra-düşük ek şişesine yerleştirildi. Bu hücrelerin parlak ve benzer boyutlarda, karanlık olmadan, bu kümelerin merkezlerinde ölmekte olan hücreler bakmak dikkat etmek önemlidir. H?...

Watch this Scientific Journal Video about A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

A Static Self-Directed Method for Generating Brain Organoids from Human Embryonic Stem Cells

Bu protokol, beyin hücresi tiplerinin çeşitliliğini ve hücresel organizasyonun birçok özelliğini korurken, dışsal büyüme faktörleri veya bazal membran matrisi olmadan basitleştirilmiş, düşük maliyetli bir şekilde beyin organoidleri üretmek için bir araç olarak oluşturulmuştur.

İnsan Embriyonik Kök Hücrelerinden Beyin Organoidleri Üretmek için Statik Kendi Kendini Yöneten Bir Yöntem

Human brain organoids differentiated from embryonic stem cells offer the unique opportunity to study complicated interactions of multiple cell types in a ...

İnsan beyin organoidleri kolayca manipüle ve bir insan ayarı ve birden fazla hücre türlerinin uygun etkileşim birleştiren bir sistemde hastalık çalışma için önemli bir araçtır. Bu teknik nörogelişimsel bozukluklar, toksik hakaretler ve beyinde kanser büyüme ve tedavisi de dahil olmak üzere beynin çok sayıda hastalıkları, çalışma için uygulanabilir. Bu protokolün en büyük avantajı nöronal hücre tipleri geniş bir yelpazede son derece tekrarlanabilir beyin organoidler oluşturmak için yeteneğidir.Bu, çoğu laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir çok basit bir iş akışı kullanılarak yapılır. Ve bu çok basit ve maliyet etkin bir sistem yapma özel büyüme faktörleri veya tanımsız matrisetkisi olmadan geçici uygun bir şekilde üretilmektedir. Başlamak için, 15 mililitrelik konik bir tüpte 5,9 mililitre buz gibi donanması Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta veya F12 ortamı ile 100 mikrolitre matrisi birleştirin.Her kuyuyu altı kuyulu bir tabakta, bir mililitre membran matrisi ile kaplayın. Plakayı parafin filmine sarın ve bir gecede dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, her kuyudan fazla ortam aspire, F12 ile kuyuları durulayın ve iyi başına iki mililitre mTeSR1 medya toplam hacminde H9 hESCS ekleyin.Kültür haftadan haftaya hücreleri. Günlük iki mililitre mTeSR1 ortam verin ve plakayı %5 oksijen ve %5 karbondioksit içeren 37 derece düşük oksijenli bir kuvöze yerleştirin. Pasajlar arasındaki kültürden ayırt edici hücreleri saymak için cam aletler kullanın.Ortamı günlük olarak yenileyin. Hücreler organoid üretimi için H9 hücrelerini kullanmadan dört ila altı gün önce geçmelidir. Hücreleri geçiş için, DMEM F12 media ile durulayarak ve aşırı sıvı yıkarak başlayın.Durulama sonra, proteaz çözeltisi ekleyin ve koloniler kuyu içinde yüzen için 40 dakika boyunca hücreleri kuluçkaya yat. Daha sonra, DMEM F12 kullanarak hücreleri üç kez yıkayın ve gerekirse parçaları daha küçük yapmak için titre. Daha sonra hücreleri dört altı kuyulu plakanın üzerinde yaklaşık bir-sekiz oranında dağıtın ve plakaları kuvöze yerleştirin ve günlük besleyin.Dört ila altı gün sonra, hücreler yaklaşık% 80 birleşim ulaşır. Onları normal bir kuluçka makinesine geçirin. Her altı kuyuluk hESCS plakası başına beş mililitre DMEM veya F12 ortamına bir mililitre stok çözeltisi ekleyerek proteaz stok çözeltisini çalışma konsantrasyonuna seyreltin.Aspire ve hücre kültürü medya kaldırmak, sonra proteaz çözeltisi ile hESCS kapağı. 10 ila 15 dakika boyunca kuvözde plakaları yerleştirin veya kolonilerin kenarları yuvarlak kadar ve matris ayrı başlar ama tamamen yuvarlanmadan önce. Plakayı yatırın, proteaz çözeltisini aspire edin ve hücreleri her üç kez iki mililitre DMEM veya F12 ile nazikçe yıkayın.Kolonilerin matrise bağlı kaldığından emin olun. Bu yüzden ES hücrelerinin parçalarının uygun boyutta olması çok önemlidir, bu yüzden uygun süre boyunca yok olmadıklarından emin olun. Eğer orada çok kısa bir süre kalıyorlarsa, onları sifonu çekip ayırmak çok zor olabilir.Ve eğer orada çok uzun süre kalırsalar, yıkama merdivenlerinde çıkabilirler. Her kuyuya yaklaşık 1 ila 1,5 mililitre taze mTeSR ortam ekleyin ve nazik pipetleme kullanarak plakadaki hücreleri 50 mililitrelik konik bir tüpe boşaltın. Aspire edin ve hESCS'yi orijinal boyutlarının yaklaşık 1/30'una ulaşana kadar plaka içinde dağıtın.Koloni kümeleri 250 ila 350 mikrometre boyutundaki parçalara benziyor. Hücreleri, bFGF olmadan 30 mililitre mTeSR ortam içeren tek bir ultra düşük eki T75 şişesine aktarın. Ertesi gün, şişeyi köşede canlı hücreler biriktisi gibi yatırın.Şişenin altına yapışmış çok sayıda hücre varsa, hücreleri yeni bir şişeye aktarmak için 10 mililitrelik pipet kullanın. İlk birkaç gün için ölü hücrelerin yüksek bir nüfusa sahip bekliyoruz. Hücreler yerleştikten sonra, canlı hücreleri içeren yaklaşık 10 mililitre medya bırakarak medya ve ölü hücreleri aspire ve bFGF mililitre başına 30 nanogram ile desteklenen düşük bFGF medya 20 mililitre ekleyin.İki gün sonra hücreleri kontrol edin. Hücrelerin çoğu sağlıklı ve parlak görünmelidir. Ancak, hücrelerin üçte birinden fazlası koyu görünürse, şişeyi yatırın ve 20 mililitre lik ortamı 20 mililitre düşük bFGF medya ile değiştirin ve mililitre başına 20 nanogram bFGF ile destekleyin.Üçüncü gün, ortamın yarısını çıkarın ve 15 mililitre hESC medya ile birlikte bFGF mililitre başına 10 nanogram ile değiştirin. Beşinci günde, medyanın yarısını 15 mililitre nöral indüksiyon media ile değiştirin. Bundan sonra, her gün, nöral indüksiyon ortamı ile orta yarısını değiştirin.Kültürde üç hafta sonra, istenirse 1X son konsantrasyonunda medyaya 100X Penisilin-Streptomisin ekleyin. Her gün ortamın yarısını yenileyin. Bu protokolde, oluşan beyin organoidleri bu kümelerin merkezlerinde karanlık ölüm hücreleri olmadan parlak ve benzer boyutlarda görünüyordu.Hücreler yavaş yavaş bFGF kapalı kesildi. Beşinci gün, nöral indüksiyon ortamına yerleştirildiler ve kültür dönemi boyunca bu medyada kaldılar. Organoidler zamanla daha büyük ve böylece koyu olmasına rağmen, nöral rozet benzeri yapılar nöral farklılaşmanın başlangıcını gösterir ve embriyonik nöral tüpün özelliklerini içeren genişledi.Hücrelerdeki gen ekspresyonuna daha derinlemesine bakmak için qPCR analizi yapıldı. Glutamat taşıyıcı VLGUT1 iki buçuk hafta ifade edildi, beş hafta arttı, ve kültür beş ay boyunca tutarlı kaldı. Bir önbeyin belirteci Foxg1 kültür beş hafta kadar düşük seviyelerde ifade edildi.Derin tabaka belirteci Tbr1 yaklaşık beş hafta doruğa ulaştı ve daha sonra azaldı. Üst tabaka belirteç Satb2 ifadesi ise, ventral marker Eng1, arka beyin omurilik marker Hoxb4, yanı sıra oligodendrocyte marker Olig2 tüm zamanla arttı. Buna karşılık, kök hücre belirteci Sox2 zaman içinde azalmıştır.Glial marker GFAP beş hafta zirveye ve daha sonra nispeten sabit kaldı. Onlar antibiyotik olmadan yetiştirilen konum ve aynı zamanda programa göre beslenmeyi unutmayın gibi kontaminasyonu önlemek için erken evre organoidler ES hücreleri ele yaparken azami dikkat etmeyi unutmayın. Bu prosedürü takiben, gen ekspresyonu için kantitatif RT-PCR ve protein ekspresyonu ve lokalizasyon için immünofloresans gibi teknikleri kullanarak organoidleri değerlendirebilirsiniz.Bu tekniği kullanarak, hipoksi odasında modellenen insan neonatal hipoksik yaralanma yönlerini hafifletmek için küçük bir molekülün yeteneğini incelemek başardık. Bu insan beyin organoidlerinin in vivo fare deneylerine benzer şekilde olması önemlidir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generating CRISPR/Cas9 Mediated Monoallelic Deletions to Study Enhancer Function in Mouse Embryonic Stem Cells

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

Enhancers control cell identity by regulating tissue-specific gene expression in a position and orientation independent manner. These enhancers are often ...

Gelişim Biyolojisi

A Quick and Efficient Method for the Purification of Endoderm Cells Generated from Human Embryonic Stem Cells

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Yaratılan Endoderm Hücrelerinin Saflaştırılması Hızlı ve Etkin Yöntem

The differentiation capabilities of pluripotent stem cells such as embryonic stem cells (ESCs) allow a potential therapeutic application for cell ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

Hızlı, yönlendirilmiş farklılaşma insan embriyonik veya İndüklenmiş Pluripotent kök hücrelerinden retina Pigment epitel hücrelerinin

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Transplantasyonu uygun Retina Pigment epitel doku mühendisliği insan embriyonik kök hücrelerden türetilmiş

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Yetişkin Fare Tadı Kök Hücrelerinden Elde Edilen Lingual Organoidlerin Üretimi ve Kültürü

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Böbrek Organoidleri Üretmek için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

İnsan Dişinden Organoidlerin Mekanik Araştırma ve Rejeneratif Terapiye Doğru Güçlü Bir Araç Olarak Kurulması

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...