Name: generation of multicellular human primary endometrial organoids
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

تم تمويل هذه الدراسة من قبل NIHS/المعاهد القومية للصحة/NCATS UG3 غرانت (ES029073) وشمال غرب مدرسه Feinberg كليه الطب جسر الصندوق (JJK). نود ان نعترف بالمرفق الأساسي لعلم الامراض الشمالية الغربية لمعالجه العضوية الثابتة لتضمين البارافين. نود ان نعترف بالفريق UG3 بأكمله بما في ذلك وودروف ، Burdette ، ومختبرات اوربريك للمناقشات الثاقبة والتعاون.

تم جمع عينات بطانة الرحم من النساء قبل انقطاع الطمث التي خضعت لعمليه استئصال الرحم الروتينية لظروف رحميه حميده في مستشفي النساء بجامعه نورث وسترن ، وفقا لبروتوكول وافق عليه مجلس المراجعة المؤسسية. وتم الحصول علي موافقه خطيه من جميع النساء المشمولات بالدراسة.
1. اعداد قوالب ا...

<ol>
	<li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation.">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li><li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidualization+of+the+human+endometrium:+mechanisms,+functions,+and+clinical+perspectives.">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li><li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure.">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2.">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li><li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progesterone+receptor+regulates+implantation,+decidualization,+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network.">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium.">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li><li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis.">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li><li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+action+in+endometrial+cancer,+endometriosis,+uterine+fibroids,+and+breast+cancer.">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li><li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS/MS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay.">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li><li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome.">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. , (2019).</li></ol>

وقد ولدت لدينا الإنسان العضوي بطانة الرحم تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة الخارجية. في حين انه قد تم بالفعل تبين ان الخلايا الظهاريه بطانة الرحم الاوليه يمكن ان تشكل organoids6,7, وقد تم تضمين هذه الخلايا في مصفوفة الجيلا?...

بطانة الرحم البشرية التجويف الرحمي وتعمل كاول اتصال للجنين اثناء الغرس. وتتكون بطانة الرحم من الخلايا الظهاريه المضيءه والغديه ، والخلايا الليفية الداعمة للورم ، والخلية البطانية والخلايا المناعية. معا, هذه الأنواع الخلية تشكل انسجه بطانة الرحم التي هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه لهرمونات الستيرويد الجنس1. التغييرات التي تحدث خلال كل دوره الحيض ملفتة للنظر. مطلوب النمو المناسب وأعاده تشكيل بطانة الرحم للسماح لزرع الاجنه ان يحدث. الاستجابة الشاذة للاستروجين والبروجستيرون يمكن ان يؤدي إلى بطانة الرحم الحرارية التي لا تسمح للنجاح في إنشاء الحمل ويمكن ان يؤدي حتى في الامراض بما في ذلك أورام بطانة الرحم.
من أجل دراسة الاستجابات الهرمونية والتغييرات الاساسيه التي تحدث في بطانة الرحم ، تم نشر الخلايا من انسجه بطانة الرحم التي تم استئصالها من المرضي اثناء الجراحة أو خزعة بطانة الرحم في ثقافة الخلايا. تنتشر الخلايا اللحمية لبطانة الرحم بشكل تفضيلي وتنتشر بسهوله ، ويمكن تلخيص عمليه التمايز التي يسببها البروجسترون في المختبر. ونتيجة لذلك ، تم تعلم الكثير خلال عمليه التفريق هذه ، التي سميت ديسيدواليزيشن2،3. نوع الخلية الرئيسية الأخرى في بطانة الرحم ، والخلايا الظهاريه التلالؤ والغديه ، ومع ذلك ، لا تنمو بشكل جيد كما أحادي الطبقات التقليدية ، وفقدان القطبية ، وتصبح السكون ، ووجود إمكانات محدوده التكاثري. ونتيجة لذلك ، فان اقل ما يعرف عن علم الاحياء ودورها في بطانة الرحم البشرية. وبما ان العديد من الأورام تنشا من الخلايا الظهاريه ، تظل أليات المرتبطة بفرط التنسج أو التحول إلى الخلايا السرطانية محدده بالبالكامل. وعلاوة علي ذلك, وقد وضعت دراسات ان الاستجابة هرمون ينطوي علي الإجراءات الحميمة paracrine بين الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم4,5.
في الاونه الاخيره ، تم تاسيس الثقافة العضوية ثلاثية الابعاد (3d) من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم من قبل مجموعتين مستقلتين6،7، والتي هي التقارير الاولي من العضوية التي تشكلت من انسجه بطانة الرحم. وتتالف هذه العضوية من الخلايا الظهاريه بطانة الرحم جزءا لا يتجزا من مصفوفة البروتين (جدول المواد) ولم تشمل مقصوره استجابه الهامه هرمونيا من بطانة رحم بطانة الرحم ، والليفية اللحمية. كما يمكن ان تختلف البروتينات مصفوفة من الكثير إلى الكثير ، ويمكن ان تؤدي إلى مسارات الإشارات التي لا تحدث بالضرورة في الانسجه ، فانه سيكون من المثالي لاستبدال البروتينات مصفوفة مع مكونات بطانة الرحم. في الدراسة الحالية ، يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل العضوي الخالي من السقالات من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. وجود الخلايا اللحمية لا يوفر فقط الدعم للخلايا الظهاريه ولكنه يوفر أيضا الإجراءات الضرورية paracrine التي تم إنشاؤها لتكون مهمة لاستجابه هرمون بطانة الرحم4,8,9 .
العضوية الجديدة لبطانة الرحم متعددة الخلايا تقدم نظاما نموذجيا لبطانة الرحم التي هي بسيطه لتوليد والتي تتضمن كلا من الخلايا الظهاريه واللحمية. ويمكن استخدام هذه العضوية لدراسة التغيرات الهرمونية علي المدى الطويل والاحداث المبكرة من الامراض مثل التورم بسبب عدم التوازن الهرموني أو الشتائم الخارجية. ويمكن في نهاية المطاف توسيع تعقيد هذه الاشكال العضوية لتشمل أنواع الخلايا الأخرى ، بما في ذلك الخلايا البطانية والمناعية مع الخلايا العضلية ربما إلى تقليد حقا فسيولوجيا الانسجه البشرية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Agarose HS, molecular biology grade</td>
			<td style="width:229px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:112px;">CA3510-6</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose molds</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z764043</td>
			<td>(https://www.microtissues.com/)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:229px;">Amresco</td>
			<td style="width:112px;">0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Estradiol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">E2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dispase</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNase I</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eosin Stain</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:112px;">95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RM-9101-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">21-022-CV</td>
			<td>1x without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hematoxylin Stain Solution</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">3530-32</td>
			<td>Modified Harris formulation, mercury free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07980</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrocortisone stock solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07925</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Organoid media - Mammocult</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">05620</td>
			<td>supplemented with 2 &#181;L/mL heparin and 5 &#181;L/mL hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde, 16% solution</td>
			<td style="width:229px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:112px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant</td>
			<td style="width:229px;">Agilent Technologies</td>
			<td>M356801-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protein matrix - Matrigel</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Purified mouse anti-E-cadherin antibody</td>
			<td style="width:229px;">BD Biociences</td>
			<td style="width:112px;">610181</td>
			<td>Clone 36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA lysis and isolation kit</td>
			<td style="width:229px;">Zymo Research</td>
			<td>R2060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Testosterone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Trichrome Stain</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab150686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Wax film - Parafilm</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of multicellular human primary endometrial organoids

بطانة الرحم البشرية هي واحده من الانسجه الأكثر استجابه هرمونيا في الجسم وضروري لأقامه الحمل. هذا النسيج يمكن أيضا ان تصبح مريضه وتسبب الاعتلال وحتى الموت. واقتصرت النظم النموذجية لدراسة بيولوجيا بطانة الرحم البشرية علي نظم الاستزراع الأنبوبي لأنواع الخلايا المفردة. الاضافه إلى ذلك ، فان الخلايا الظهاريه ، واحده من أنواع الخلايا الرئيسية لبطانة الرحم ، لا تنتشر بشكل جيد أو الاحتفاظ بصفاتها الفسيولوجية في الثقافة ، التالي فهمنا لعلم الاحياء بطانة الرحم لا يزال محدودا. لقد ولدت ، للمرة الاولي ، الهيكل التنظيمي لبطانة الرحم التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية من بطانة الرحم البشرية. هذه العضوية لا تتطلب اي مواد سقالة الخارجية وتنظيم علي وجه التحديد بحيث الخلايا الظهاريه تشمل الهيكل الشبيه كروي وتصبح مستقطبه مع الخلايا اللحمية في المركز الذي ينتج وتفرز الكولاجين. يتم التعبير عن الاستروجين ، البروجسترون ومستقبلات الاندروجين في الخلايا الظهاريه واللحمية والعلاج مع المستويات الفسيولوجية من الاستروجين والتستوستيرون تعزيز تنظيم الهيكل التنظيمي. ويمكن استخدام هذا النظام نموذج جديد لدراسة البيولوجيا بطانة الرحم العادية والمرض بطرق لم تكن ممكنة من قبل.

ويرد في الشكل 1وصف تخطيطي للبروتوكول. تم الحصول علي انسجه الرحم من الجراحة بعد فحصها من قبل اخصائيي الامراض. وفصل بطانة الرحم من الورم العضلي عن طريق الكشط وتم هضم انسجه بطانة الرحم انزيمي إلى الخلايا كما هو موضح في البروتوكول. وأضيفت الخلايا الظهاريه واللحمية إلى ميكروويل...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

يتم تقديم بروتوكول لتوليد الهيكل الأساسي لبطانة الرحم البشرية الاوليه التي تتكون من الخلايا الظهاريه واللحمية والاحتفاظ بخصائص نسيج بطانة الرحم الأصلي. يصف هذا البروتوكول الطرق من اكتساب انسجه الرحم إلى المعالجة النسيجية لهيكل بطانة الرحم.

توليد العضوية متعددة الخلايا الإنسان الاساسيه بطانة الرحم

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

بطانة الرحم هو الأنسجة التي تتغير كل شهر استجابة للهرمونات. يمكن أن يؤدي اختلال التوازن الهرموني إلى منع تعلق الأجنة ويسبب أمراضًا مثل السرطان. بروتوكولنا يعيد بناء بطانة الرحم بحيث يمكن دراستها خارج جسم المرأة بطريقة فسيولوجية.الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يوفر بنية ثلاثية الأبعاد من الخلايا التي تتألف من نوعين من الخلايا المستجيبة للهرمونات ، وخلايا الظهارية والستروما التي تنظم وتتصرف بشكل خاص كما تفعل في الجسم. منذ organoids يمكن أن تحاكي أفضل سلوك الأنسجة، فإنها يمكن أن تستخدم في نهاية المطاف لاختبار المخدرات المختلفة. يمكن استخدام الأعضاء بطانة الرحم لدراسة الآثار المباشرة لعوامل الخطر المعروفة حاليا للسرطان، بما في ذلك السمنة ومتلازمة المبيض المتعدد الكيسات.تؤكد العضيات على أهمية أعمال الباراكرين بين نوعين من الخلايا. من المهم البدء بكمية كافية من الأنسجة. يمكن الحصول على كثافة الحق من الخلايا الظهارية والسترومال تكون خادعة.أيضا ، و organoids صغيرة جدا ، ويمكن أن يكون من الصعب تصور مع تلطيخ IHC. التصور من هذا الإجراء مهم لأن هناك بعض الخطوات التي سوف يكون من الأسهل بكثير لفهم بعد رؤيتها. وتشمل هذه الحصول على طبقة الأنسجة الصحيحة من الرحم، والحصول على الكثافة الصحيحة للخلايا إلى الجمع، وبذر قوالب agarose.قبل بدء عزل الخلية، يلقي وتكاوز 1.5٪ agarose القوالب الصغيرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإيواء organoids. في خزانة السلامة البيولوجية، استخدم تقنيات معقمة لإعداد محلول إنزيم عند 37 درجة مئوية وتصفية معقمة الحل باستخدام مرشح حقنة ميكرومتر 0.2 في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. باستخدام مشرط، كشط قبالة بطانة الرحم من الخزعات الرحمية و mince الأنسجة إلى قطع صغيرة جدا.ضع الأنسجة المفرومة الطازجة في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على محلول الإنزيم. أغلق الغطاء ولف الجزء العلوي من الأنبوب بـ فيلم شمع لمنع التلوث. ضع الأنبوب في حمام مائي أو حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع اهتزاز بلطف.بعد هذا، كومة مصفاة خلية 100 ميكرون على رأس مصفاة خلية 20 ميكرون على أنبوب مخروطي 50 ملليلتر. تصفية الحل من خلال اثنين من مصافي. شطف أنبوب مخروطي 15 ملليلتر مع HBSS ووضع هذا الغسيل من خلال مصفاة لضمان أن يتم جمع جميع الخلايا.ثم، عكس مصفاة الخلايا 20 ميكرون على أنبوب مخروطي جديد 50 ملليلتر وغسل الخلايا الظهارية قبالة مصفاة مع 20 ملليلتر من وسائل الإعلام العضوية تكمل مع 1٪ البنسلين وstreptomycin. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب المخروطية في 500 G لمدة خمس دقائق. للخلايا السترومال التي تم جمعها، وإزالة عظمى و resuspend بيليه في 10 ملليلتر من خلايا الدم الحمراء العازلة.احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي هذه الخلايا في 500 G لمدة خمس دقائق. إزالة عظمى و resuspend بيليه مع 200 إلى 300 ميكرولترات من وسائل الإعلام organoid.للخلايا الظهارية التي تم جمعها، وإزالة فائقة و resuspend بيليه في 100 ميكرولترات من وسائل الإعلام organoid. بعد توازن قوالب agarose 1.5٪، وإزالة الوسائط العضوية على السطح الخارجي لقوالب agarose وإمالة لوحة ثقافة الأنسجة بحيث المتوسطة من خلية بذور غرفة من أطباق agarose يمكن أيضا أن تتم إزالتها بعناية. عرض تعليق الخلايا الظهارية والسترومال تحت المجهر وإضافة المزيد من الوسائط العضوية إلى التعليقات، والتأكد من إضافة فقط 100 ميكرولترات في وقت واحد بحيث تعليق متساو تقريبا في الكثافة.ثم الجمع بين جزء واحد من الخلايا التهيّم مع ثلاثة أجزاء من الخلايا الظهارية من حيث الحجم. Pipette 50 ميكرولترات من تعليق الخلية مجتمعة في غرفة البذر الخلية من قالب agarose. مرة واحدة يتم تعبئة قوالب agarose مع الخلايا، إضافة بعناية 400 ميكرولترات من وسائل الإعلام العضوية الطازجة في آبار لوحة 24-جيدا.احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون، والتأكد من تغيير المتوسطة كل يوم الثاني مع 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام organoid. بعد سبعة أيام، تغيير المتوسطة إلى واحدة التي تستكمل مع إستراديول نانومولر 0.1 و 0.8 نانومولر التستوستيرون لتعزيز تنظيم الخلايا الظهارية والسترومال. أولا ، حل 1.5 ٪ agarose في برنامج تلفزيوني عن طريق الغليان.ضع الأنغروز السائل في منقار من الماء الساخن واسمح له بأن يبرد إلى ما يقرب من 50 درجة مئوية. تحت مجهر تشريح، إمالة لوحة 24 جيدا والماصة بعناية من المتوسطة من خارج قالب agarose. ثم الماصات بعناية من المتوسطة من الجزء الداخلي من قالب agarose لتجنب تعطيل organoids.إضافة بعناية بين 70 و 75 ميكرولترات من الحارة، 1.5٪ agarose في غرفة طبق agarose، مع الحرص على عدم إزعاج organoids. دع اللوحة تبرد عند أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. بعد هذا، إضافة 4٪ شبهformaldehyde في كل بئر من لوحة 24-جيدا وإصلاح كامل مختومة agarose العفن بين عشية وضحاها في أربع درجات مئوية.في اليوم التالي، تخزين لوحة في 70٪ الإيثانول في أربع درجات مئوية حتى جاهزة لمعالجة لالبارافين تضمين. لبدء عزل الحمض النووي الريبي، عرض لوحة تحت مجهر تشريح. إمالة لوحة والميصة بعناية من المتوسطة من غرفة قالب agarose.بقوة ماصة واحدة ملليلتر من المتوسطة العضوية الطازجة مباشرة في قالب agarose بحيث يتم مسح organoids من microwells، مع الحرص على عدم خلق فقاعات كثيرة جدا. كرر هذه العملية الأنابيب قوية مرة واحدة باستخدام نفس المتوسطة. بعد ذلك، جمع كل من المتوسطة التي تحتوي على organoids.جهاز طرد مركزي في 500 G لجمع organoids، والشروع في استخراج الحمض النووي الريبي. في هذه الدراسة ، يتم إنشاء الأجهزة العضوية endometrial البشرية التي تتكون من الخلايا الظهارية والمائية من بطانة الرحم دون استخدام مواد سقالة خارجية. للمعالجة النسيجية، يتم ختم قوالب agarose التي تحتوي على organoids بطانة الرحم مع agarose، تليها التثبيت مع 4٪ شبهformaldehyde بين عشية وضحاها.تتم معالجة هذه القوالب لبارافين القياسية تضمين مقطعة وملطخة لل نفس الأنسجة، المناعةfluorescence، أو الكيمياء المناعية. يكشف الهماتوسلين في تلطيخ إيوسين عن بنية تشبه الزفير مع طبقة واحدة من الخلايا التي تبطن السطح الخارجي والخلايا في المركز. تكشف العلامات الخاصة بالخلايا للخلايا ذات بطانة الرحم والظهارية واللُخلى الظهارية عن الخلايا الظهارية المحيطة بالأعضاء مع الخلايا اللزجة في الوسط.علامات علم وظائف الأعضاء بطانة الرحم تؤكد أن organoids بطانة الرحم احتفظت خصائص معينة من الأنسجة الأصلية. ثلاثي الكروم تلطيخ، الذي يلطخ الكولاجين الأزرق والخلايا الحمراء، ويظهر وجود الكولاجين داخل المركز حيث الخلايا القوية يقيم، مما يدل على الإنتاج النشط وإفراز الكولاجين من قبل الخلايا السترومية مماثلة للأنسجة الأصلية. بالإضافة إلى ذلك، يكشف التلطيخ المناعي الكيميائي عن وجود مستقبلات الإستروجين، مستقبلات الاندروجين، ومستقبلات البروجسترون في كل من الخلايا الظهارية والوماضة.من المهم أن نجهز الخلايا بكثافة بحيث يكون لدينا ما يكفي من الأعضاء لتجارب المصب. هذا سوف يستغرق بعض الممارسة. يمكن استزراع العضيات بطانة الرحم في ظل ظروف مختلفة ومن ثم حصادها لتجارب مثل الكيمياء المناعية أو تلطيخ المناعة لدراسة التعبير البروتيني أو حصادها للرنا لدراسة التعبير الجيني.يحقق مختبرنا في كيفية استجابة بطانة الرحم لمستويات الهرمونات المتغيرة، والتي يمكن أن تؤدي إلى تضخم بطانة الرحم والسرطان. يمكننا استخدام هذه الأعضاء لعلاجات طويلة الأجل من الهرمونات وإضافة الظروف المرضية مثل التستوستيرون الزائد الموجود في متلازمة المبيض المتعدد الكيسات، أو إشارات من الخلايا الشحمية لدراسة التغيرات بطانة الرحم الناجمة عن السمنة. وتعتبر الأنسجة البشرية لتكون الخطر البيولوجي، وسيكون من المهم اتخاذ الاحتياطات المناسبة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

جيل واستزراع من الخلايا الكيراتينيه البشرية الأساسية من الجلد الكبار

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

قياس النفاذية الحاجز الظهارية في أورجانويدس المعوية البشرية في الوقت الحقيقي

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

الهندسة الوراثية للأجهزة المعوية الماوس الأولية باستخدام الجسيمات النانوية المغناطيسية تحويل ناقلات الفيروسية للتقسيم المجمدة

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

عزل الخلايا اللحمية الرحم البشرية في المختبر ديسيدواليزيشن

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

جيل من الأرغن مامري الفسيفساء عن طريق التربسينات التفاضلية

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

إضافية الخلوية مصفوفة المستندة إلى و اضافية الخلية مصفوفة خالية جيل من الخصية مورين

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

جيل وثقافة Organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...