Name: generation of multicellular human primary endometrial organoids
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

Denne undersøgelse blev finansieret af NIEHS/NIH/NCATS UG3 Grant (ES029073) og Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge Fund (JJK). Vi vil gerne anerkende den nordvestlige patologi kerne facilitet til behandling af de faste organoider for paraffin indlejring. Vi vil gerne anerkende hele UG3-teamet, herunder Woodruff, Burdette og Urbanek Labs, for de indsigtsfulde diskussioner og samarbejder.

Endometriale prøver blev indsamlet fra præmenopausale kvinder, der gennemgår rutinemæssig hysterektomi for godartede livmoder sygdomme på Northwestern University Prlokke kvinders Hospital, i henhold til en institutionel revision Board-godkendt protokol. Der blev indhentet skriftligt samtykke fra alle kvinder, som indgik i undersøgelsen.
1. fremstilling af Agopstået skimmelsvampe
<ol><li>Før celle isolation påbegyndes, støbt og ækvibrere 1,5% agopstået mikro forme (tabel o...

<ol>
	<li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation.">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li><li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidualization+of+the+human+endometrium:+mechanisms,+functions,+and+clinical+perspectives.">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li><li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure.">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2.">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li><li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progesterone+receptor+regulates+implantation,+decidualization,+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network.">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium.">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li><li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis.">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li><li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+action+in+endometrial+cancer,+endometriosis,+uterine+fibroids,+and+breast+cancer.">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li><li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS/MS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay.">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li><li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome.">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. , (2019).</li></ol>

Vi har genereret humane endometriale organoider bestående af epiteliale og stromale celler i endometriet uden brug af eksogene stilladset materialer. Selv om det allerede er blevet påvist, at primære endometriale epitelceller kan danne organoider6,7, disse celler blev indlejret i en gelatinøse matrix af proteiner udskillet af mus sarkom celler (Se tabel over materialer) for at hjælpe form spheroid-lignende strukturer. Desuden var endometrial...

Den menneskelige endometriet linjer livmoderhulen og fungerer som den første kontakt for embryonet under implantation. Endometriet består af luminale og glandulære epiteliale celler, støttende stromale fibroblaster, endotelceller og immunceller. Sammen, disse celletyper udgør den endometriale væv, som er en af de mest lydhør væv til sex steroid hormoner1. De ændringer, der opstår under hver menstruationscyklus er slående. Passende vækst og Remodeling af endometriet er nødvendig for at gøre det muligt for embryo implantation at forekomme. Afvigende respons på østrogen og progesteron kan resultere i en refraktær endometriet, der ikke giver mulighed for en vellykket etablering af graviditet og kan endda resultere i sygdomme, herunder endometriecancer neoplasi.
For at studere hormon respons og væsentlige ændringer, der opstår i endometriet, celler fra endometriale væv exciseret fra patienter under kirurgi eller endometriecancer biopsi er blevet formeret i cellekultur. Endometriale stromale celler fortrinsvis formere sig og udbrede let, og processen med differentiering induceret af progesteron kan rekapitulere in vitro. Som et resultat, meget er blevet lært i løbet af denne differentiering proces, kaldet decidualization2,3. Den anden store celletype i endometriet, luminale og glandulære epiteliale celler, dog ikke vokser godt som traditionelle monolayers, mister polaritet, bliver senescent, og har begrænset proliferativ potentiale. Som et resultat, mindre er kendt af deres biologi og deres rolle i den menneskelige endometrium. Da mange neoplasi stammer fra epitelialcellerne, er mekanismerne i forbindelse med hyperplasi eller omdannelse til kræftceller stadig fuldt definerede. Endvidere, undersøgelser har fastslået, at hormon respons involverer de intime paracrine handlinger mellem epiteliale og stromale celler i endometriet4,5.
For nylig blev en tredimensionel (3D) organoid kultur af endometriale epitelceller etableret af to uafhængige grupper6,7, som er de første rapporter af organoider dannet af endometriale væv. Disse organoider bestod af endometriale epiteliale celler indlejret i en protein matrix (tabel over materialer) og omfattede ikke et vigtigt hormonelt responsivt rum af endometriecancer endometrium, stromale fibroblaster. Da matrix proteinerne kan variere fra lot til Lot og kan udløse signalerings veje, der ikke nødvendigvis forekommer i vævet, ville det være ideelt at udskifte matrix proteinerne med komponenterne i endometriet. I den nuværende undersøgelse, en protokol til at generere stilladset-fri humane endometriale organoider af epitelial og stromale celler i den menneskelige endometriet er præsenteret. Tilstedeværelsen af stromale celler ikke kun giver støtte til epiteliale celler, men også giver de nødvendige paracrine handlinger, der er blevet etableret for at være vigtige for endometriale hormon respons4,8,9 .
Den nye multicellulære endometriale organoid tilbyder et model system af endometriet, der er enkel at generere, og som inkorporerer både epiteliale og stromale celler. Disse organoider kan bruges til at studere langsigtede hormonelle forandringer og tidlige hændelser af sygdom som tumor på grund af hormonel ubalance eller eksogene fornærmelser. Kompleksiteten af disse organoider kunne i sidste ende udvides til at omfatte andre celletyper, herunder endotelog immunceller med muligvis myometriale celler til virkelig efterligne humant væv fysiologi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Agarose HS, molecular biology grade</td>
			<td style="width:229px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:112px;">CA3510-6</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose molds</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z764043</td>
			<td>(https://www.microtissues.com/)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:229px;">Amresco</td>
			<td style="width:112px;">0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Estradiol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">E2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dispase</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNase I</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eosin Stain</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:112px;">95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RM-9101-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">21-022-CV</td>
			<td>1x without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hematoxylin Stain Solution</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">3530-32</td>
			<td>Modified Harris formulation, mercury free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07980</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrocortisone stock solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07925</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Organoid media - Mammocult</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">05620</td>
			<td>supplemented with 2 &#181;L/mL heparin and 5 &#181;L/mL hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde, 16% solution</td>
			<td style="width:229px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:112px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant</td>
			<td style="width:229px;">Agilent Technologies</td>
			<td>M356801-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protein matrix - Matrigel</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Purified mouse anti-E-cadherin antibody</td>
			<td style="width:229px;">BD Biociences</td>
			<td style="width:112px;">610181</td>
			<td>Clone 36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA lysis and isolation kit</td>
			<td style="width:229px;">Zymo Research</td>
			<td>R2060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Testosterone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Trichrome Stain</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab150686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Wax film - Parafilm</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of multicellular human primary endometrial organoids

Den menneskelige endometriet er en af de mest hormonelt lydhør væv i kroppen og er afgørende for etablering af graviditet. Dette væv kan også blive syg og forårsage sygelighed og endda død. Model systemer til undersøgelse af menneskets endometriebiologi har været begrænset til in vitro-kultur systemer af enkelt celletyper. Hertil kommer, at epiteliale celler, en af de store celletyper af endometrium, ikke udbrede godt eller bevare deres fysiologiske træk i kulturen, og dermed vores forståelse af endometriecancer biologi fortsat begrænset. Vi har for første gang genereret endometriale organoider, der består af både epiteliale og stromale celler i den menneskelige endometrium. Disse organoider kræver ikke nogen eksogene stilladser materialer og specifikt organisere, således at epiteliale celler omfatter spheroid-lignende struktur og blive polariseret med stromale celler i midten, der producerer og udskiller kollagen. Østrogen, progesteron og androgenreceptorer er udtrykt i epitelial og stromale celler og behandling med fysiologiske niveauer af østrogen og testosteron fremme organiseringen af organoider. Dette nye model system kan bruges til at studere normal endometriecancer biologi og sygdom på måder, der ikke var muligt før.

En skematisk af protokollen er afbildet i figur 1. Uterin væv blev opnået fra kirurgi, efter at det blev undersøgt af patologer. Endometriecancer foring blev adskilt fra myometrium ved skrabning og endometrievævet blev enzymatisk fordøjet til celler som skitseret i protokollen. Epiteliale og stromale celler blev tilsat til mikrobrønde i de agopstået forme. Efter 7 dage i kulturen blev organoider behandlet med E og T i yderligere 7 − 14 dage.
Til histologi...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

En protokol til at generere humane primære endometriale organoider, der består af epiteliale og stromale celler og bevarer karakteristika af det indfødte endometrievæv præsenteres. Denne protokol beskriver metoder fra erhvervelse af uterin væv til histologisk behandling af endometriale organoider.

Generation af flercellede humane primære Endometriale Organoider

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Endometriet er et væv, der ændrer sig hver måned som reaktion på hormoner. Hormon ubalance kan forhindre embryo vedhæftet fil og også forårsage sygdomme som kræft. Vores protokol genopbygger endometriet, så det kan studeres uden for kvindens krop på en fysiologisk måde.Den største fordel ved denne teknik er, at det giver en 3D-struktur af celler, der består af to hormonalt lydhøre celletyper, epitel og stroma celler, der specifikt organiserer og opfører sig som de gør i kroppen. Da organoids bedre kan efterligne væv adfærd, de kan i sidste ende bruges til at teste forskellige lægemidler. Endometrie organoider kan bruges til at studere direkte virkninger af aktuelt kendte risikofaktorer for kræft, herunder fedme og polycystisk ovariesyndrom.Vores organoider understrege betydningen af parakrine handlinger mellem to celletyper. Det er vigtigt at starte med en tilstrækkelig mængde væv. Kom den rigtige tæthed af epitel og stromale celler kan være vanskelig.Også, de organoids er ganske lille og kan være svært at visualisere med IHC farvning. Visualisering af denne procedure er vigtig, fordi der er nogle trin, der vil være meget lettere at forstå efter at have set dem. Disse omfatter at få det rigtige væv lag af livmoderen, at få den rigtige tæthed af celler til at kombinere, og såning agarose forme.Før begyndelsen celleisolering, støbt og ligevægt 1,5% agarose mikro-forme i henhold til producentens anvisninger til at huse organoids. I et biosikkerhedsskab skal du bruge aseptiske teknikker til at forberede en enzymopløsning ved 37 grader Celsius og sterilt filtrere opløsningen ved hjælp af et 0,2 mikrometer sprøjtefilter i et 15 milliliter konisk rør. Ved hjælp af en skalpel, skrabe endometrium fra livmoderen biopsier og hakke vævet i meget små stykker.Det nyslåede væv anbringes i det koniske 15 milliliterrør, der indeholder enzymopløsningen. Luk hætten og pak toppen af røret med en voksfilm for at forhindre forurening. Rør i et vandbad eller en kuvøse anbringes ved 37 grader Celsius i 30 minutter med forsigtigt omrystning.Efter dette, stak en 100-mikron celle si på toppen af en 20-mikron celle si på en 50-milliliter konisk rør. Opløsningen filtreres gennem de to syler. Skyl det koniske rør på 15 milliliter med HBSS, og vask denne vask gennem s sien for at sikre, at alle celler indsamles.Derefter vende 20-mikron celle si på en ny 50-milliliter konisk rør og vaske epitelceller fra si med 20 milliliter organoid medier suppleret med 1% penicillin og streptomycin. Centrifuge de koniske rør ved 500 G i fem minutter. For de indsamlede stromale celler fjernes supernatanten og pelleten opslænnes igen i 10 milliliter lysisbuffer for røde blodlegemer.Inkubere ved 37 grader Celsius i 10 til 15 minutter. Centrifuge disse celler ved 500 G i fem minutter. Fjern supernatanten og opsplit pellet med 200 til 300 mikroliter af organoid medier.For indsamlede epitelceller fjernes supernatanten og pelleten opslænnes igen i 100 mikroliter af organoidmedier. Efter 1,5% agarose forme er ligevægt, fjerne organoid medier på ydersiden af agarose forme og vippe væv kultur plade, således at mediet fra celle såning kammer af agarose retter også kan fjernes omhyggeligt. Se epitel- og stromalcellesuspensioner under et mikroskop og tilsæt flere organoidmedier til suspensionerne, og sørg for kun at tilføje 100 mikroliter ad gangen, så suspensionen er nogenlunde lige i tæthed.Derefter kombinere en del af de stromale celler med tre dele af epitelceller efter volumen. Pipette 50 mikroliter af den kombinerede celle suspension i celle såning kammer af agarose skimmel. Når agaroseforme er fyldt med celler, skal du forsigtigt tilføje 400 mikroliter af friske organoidmedier i brøndene på 24-brøndpladen.Inkubere ved 37 grader Celsius med 5% kuldioxid, og sørg for at ændre mediet hver anden dag med 500 mikroliter af organoid medier. Efter syv dage, ændre mediet til en, der er suppleret med 0.1 nanomolar estradiol og 0.8 nanomolar testosteron til at fremme organiseringen af epitel og stromale celler. Først opløses 1,5% agarose i PBS ved kogning.Placer væsken agarose i et bæger af varmt vand og lad det køle af til ca 50 grader Celsius. Under en dissekerende mikroskop, vippe 24-brønd plade og omhyggeligt pipette ud mediet fra ydersiden af agarose skimmel. Derefter omhyggeligt pipette ud mediet fra det indre af agarose formen for at undgå at forstyrre organoids.Tilsæt forsigtigt mellem 70 og 75 mikroliter af varm, 1,5% agarose ind i kammeret af agaroseskålen, og pas på ikke at forstyrre organoiderne. Lad pladen køle af ved fire grader Celsius i fem minutter. Efter dette, tilsæt 4% paraformaldehyd i hver brønd af 24-brøndpladen og fastgør hele forseglet agaroseform natten over ved fire grader Celsius.Den næste dag, opbevare pladen i 70% ethanol ved fire grader Celsius indtil klar til at behandle for paraffin indlejring. For at begynde RNA isolation, se pladen under en dissekerende mikroskop. Vip pladen og forsigtigt pipette ud mediet fra kammeret af agarose skimmel.Kraftigt pipette en milliliter frisk organoid medium direkte ind i agarose formen, således at organoids skylles ud af mikrobrønde, være omhyggelig med ikke at skabe for mange bobler. Gentag denne kraftige pipetteringsproces én gang ved hjælp af det samme medie. Efter dette, indsamle alle de medium, der indeholder organoids.Centrifuge ved 500 G for at indsamle organoider, og gå videre til RNA ekstraktion. I denne undersøgelse genereres humane endometrieorganoider, der består af epitel- og stromale celler i endometriet, uden brug af udefrakommende stilladsmaterialer. Til histologisk behandling forsegles de agaroseforme, der indeholder endometrieorganoiderne, med agarose efterfulgt af fiksering med 4% paraformaldehyd natten over.Disse forme behandles til standard paraffin indlejring sektionsopdelet og farves for histologi, immunfluorescens, eller immunohistochemistry. Den hæmatoxylin i eosin farvning afslører en sfæroid-lignende struktur med et enkelt lag af celler foring ydersiden og celler i midten. Cellespecifikke markører for endometrie-, epitel- og stromale celler afslører epitelceller omkring organoid med stromale celler i midten.Markører for endometriefysiologi bekræfter, at endometrieorganoiderne bevarede visse karakteristika ved det oprindelige væv. Tri-krom farvning, som pletter kollagen blå og celler rød, viser tilstedeværelsen af kollagen i midten, hvor stromale celler boede, demonstrere aktiv produktion og sekretion af kollagen af stromale celler svarende til den indfødte væv. Desuden, immunohistokemiske farvning afslører tilstedeværelsen af østrogen receptorer, androgen receptorer, og progesteron receptorer i både epitel og stromale celler.Det er vigtigt at plade cellerne tæt, så vi har nok organoids til downstream eksperimenter. Dette vil tage nogle praksis. Endometrieorganoider kan dyrkes under forskellige forhold og derefter høstes til forsøg som immunhisistokemi eller immunfluorescensfarvning for at studere proteinudtryk eller høstet for RNA at studere genekspression.Vores laboratorium undersøger, hvordan endometriet reagerer på ændrede hormonniveauer, hvilket kan føre til endometriehyperplasi og kræft. Vi kan bruge disse organoider til langsigtede behandlinger af hormoner og tilføje patologiske tilstande såsom overskydende testosteron findes i polycystisk ovariesyndrom, eller signaler fra adipocytter at studere fedme-induceret endometrie ændringer. Humane væv anses for at være biofarlige, og det vil være vigtigt at tage passende forholdsregler.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Generation af iPSC-afledte menneskelige hjerne organoider til Model Tidlig forstyrrelser i nervesystemets

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation af standardiserede og reproducerbare forhjernen-type Cerebral Organoids fra menneskelige induceret pluripotente stamceller

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Generation og dyrkning af primære humane keratinocytter fra voksen hud

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Real-time måling af epitel barriere permeabilitet i menneskelige tarm Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Genteknologi af primære mus intestinale Organoider ved hjælp af magnetisk nanopartikel Transduktionsvirale vektorer for frosne skæring

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering af menneskelige endometrie stromale celler til In vitro- Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation af Organoids fra mus ekstrahepatisk galdeveje

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Generation af Mosaic Mammary Organoids af Differential Trypsinization

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ekstra Cellulær Matrix-baseret og ekstra cellulær matrix-fri generation af Murine testikel organoider

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Generation og kultur af lingualorganoider afledt af voksne musesmag stamceller

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...