Name: generation of multicellular human primary endometrial organoids
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00
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이 연구는 NIEHS/NIH/NCATS UG3 교부금(ES029073)과 노스웨스턴 페인버그 의과 대학 기금(JJK)에 의해 지원되었습니다. 우리는 파라핀 포함을 위한 고정된 오르가노이드를 처리하기 위한 노스웨스턴 병리학 핵심 시설을 인정하고 싶습니다. 우드럽, 버데트, 어반크 연구소를 포함한 UG3 팀 전체가 통찰력 있는 토론과 협업을 위해 인정하고 싶습니다.

자궁 내막 샘플은 노스 웨스턴 대학 프렌티스 여성 병원에서 양성 자궁 조건에 대한 일상적인 자군 절제술을 겪고 폐경 전 여성에서 수집되었다, 기관 검토 위원회 승인 프로토콜에 따르면. 연구에 포함된 모든 여성으로부터 서면 동의를 얻었다.
1. 아가로즈 금형의 준비
<ol><li>세포 분리를 시작하기 전에, 제조사의 지시에 따라 오르가노이드를보관하기 위해 1.5%...

<ol>
	<li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation.">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li><li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidualization+of+the+human+endometrium:+mechanisms,+functions,+and+clinical+perspectives.">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li><li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure.">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2.">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li><li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progesterone+receptor+regulates+implantation,+decidualization,+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network.">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium.">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li><li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis.">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li><li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+action+in+endometrial+cancer,+endometriosis,+uterine+fibroids,+and+breast+cancer.">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li><li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS/MS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay.">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li><li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome.">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. , (2019).</li></ol>

우리는 외인성 스캐폴드 물질을 사용하지 않고 자궁 내막의 상피 및 기질 세포로 구성된 인간 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 1차 자궁내막 상피 세포가 오르가노이드6,7을형성할 수 있다는 것이 이미 나타났지만, 이들 세포는 마우스 육종 세포에 의해 분비된 단백질의 젤라틴 매트릭스에 내장되었다(재료 표참조). 형성 스페로이?...

인간 자궁 내막은 자궁 구멍을 일렬로 세게 하고 이식 도중 태아를 위한 첫번째 접촉으로 봉사합니다. 자궁 내막은 발광 및 선 상피 세포, 지지성 기질 섬유아세포, 내피 세포 및 면역 세포로 구성됩니다. 함께, 이러한 세포 유형은 성 스테로이드 호르몬에 가장 반응 조직 중 하나입니다 자궁 내막 조직을 구성1. 각 생리 주기 동안 발생 하는 변화는 눈에 띄는. 자궁 내적의 적절한 성장 및 리모델링은 배아 이식이 발생할 수 있도록 하는 데 필요합니다. 에스트로겐과 프로게스테론에 대한 비정상적인 반응은 임신의 성공적인 설립을 허용하지 않는 내화 자궁 내막을 초래할 수 있으며 자궁 내막 신생물을 포함한 질병을 초래할 수도 있습니다.
자궁 내막에서 발생하는 호르몬 반응 및 필수 변화를 연구하기 위해, 수술 또는 자궁 내막 생검 동안 환자로부터 절제 된 자궁 내막 조직에서 세포는 세포 배양에서 전파되었습니다. 자궁내막 기질 세포는 우선적으로 증식하고 쉽게 전파되며, 프로게스테론에 의해 유도된 분화 과정은 시험관 내에서 재흡수될 수 있다. 그 결과, 이러한 분화 과정에서 많은 것을 배웠으며,2,3. 자궁 내막에 있는 그밖 중요한 세포 모형은, 발광 및 선 상피 세포, 그러나, 전통적인 단층으로 잘 성장하지 않으며, 극성을 잃고, 노화되고, 및 제한된 증식 잠재력을 가진. 그 결과, 그들의 생물학및 인간 자궁 내적에서그들의 역할의 더 적은 알려지다. 많은 신생아가 상피 세포에서 유래하는 것처럼, 증식 또는 암세포에 의한 형질전환과 관련된 메커니즘은 완전히 정의될 수 있습니다. 게다가, 연구 결과는 호르몬 반응이 자궁 내막의 상피 세포와 기질 세포 사이 친밀한 paracrine 활동을 관련시키는 것을설치했습니다4,5.
최근, 자궁내막 상피 세포의 3차원(3D) 오르가노이드 배양은 자궁내막 조직에서 형성된 오르가노이드의 첫 번째 보고인 2개의 독립적인 그룹6,7에의해 확립되었다. 이들 오르가노이드는 단백질 매트릭스(Tableof Materials)내에 내장된 자궁내막 상피 세포로 구성되었으며 자궁내막 자궁내막, 기질 섬유아세포의 중요한 호르몬 반응 구획을 포함하지 않았다. 매트릭스 단백질은 로트마다 다를 수 있고 조직에서 반드시 발생하지 않는 신호 경로를 트리거 할 수 있으므로 매트릭스 단백질을 자궁 내적의 구성 요소로 대체하는 것이 이상적입니다. 현재 연구에서는, 인간 자궁내막의 상피 및 기질 세포의 비계가 없는 인간 자궁내막 오르가노이드를 생성하는 프로토콜이 제시된다. 기질 세포의 존재는 상피 세포에 대한 지원을 제공 할뿐만 아니라 자궁 내막 호르몬반응에중요하도록 설립 된 필요한 paracrine 작업을 제공합니다4,8,9 .
새로운 다세포 자궁내막 오르가노이드는 생성이 간단하고 상피 세포와 기질 세포를 모두 통합하는 자궁 내막의 모형 시스템을 제공합니다. 이 organoids는 호르몬 불균형 또는 외인성 모욕 때문에 종양 발생과 같은 질병의 장기 호르몬 변경 그리고 초기 사건을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 organoids의 복잡성은 결국 진정으로 인간 조직 생리학을 모방하기 위하여 가능하게 근심 세포와 내피 및 면역 세포를 포함하여 그밖 세포 모형을 포함하도록 확장될 수 있었습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Agarose HS, molecular biology grade</td>
			<td style="width:229px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:112px;">CA3510-6</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose molds</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z764043</td>
			<td>(https://www.microtissues.com/)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:229px;">Amresco</td>
			<td style="width:112px;">0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Estradiol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">E2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dispase</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNase I</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eosin Stain</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:112px;">95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RM-9101-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">21-022-CV</td>
			<td>1x without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hematoxylin Stain Solution</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">3530-32</td>
			<td>Modified Harris formulation, mercury free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07980</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrocortisone stock solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07925</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Organoid media - Mammocult</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">05620</td>
			<td>supplemented with 2 &#181;L/mL heparin and 5 &#181;L/mL hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde, 16% solution</td>
			<td style="width:229px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:112px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant</td>
			<td style="width:229px;">Agilent Technologies</td>
			<td>M356801-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protein matrix - Matrigel</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Purified mouse anti-E-cadherin antibody</td>
			<td style="width:229px;">BD Biociences</td>
			<td style="width:112px;">610181</td>
			<td>Clone 36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA lysis and isolation kit</td>
			<td style="width:229px;">Zymo Research</td>
			<td>R2060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Testosterone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Trichrome Stain</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab150686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Wax film - Parafilm</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of multicellular human primary endometrial organoids

인간 자궁 내부증은 바디에 있는 가장 호르몬 반응하는 조직 의 한개이고 임신의 설치를 위해 필수적입니다. 이 조직은 또한 병에 걸린 될 수 있고 이환율및 죽음조차 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 인간 자궁내막 생물학을 연구하는 모델 시스템은 단일 세포 유형의 체외 배양 시스템으로 제한되었다. 또한, 자궁 내막의 주요 세포 유형 중 하나인 상피 세포는 잘 전파되거나 배양에서 생리적 특성을 유지하지 못하므로 자궁내막 생물학에 대한 우리의 이해는 제한적입니다. 우리는 처음으로 인간 자궁 내막의 상피 세포와 기질 세포로 구성된 자궁 내막 오르가노이드를 생성했습니다. 이러한 오르가노이드는 어떤 외인성 스캐폴드 물질을 필요로 하지 않으며 상피 세포가 스페로이드와 같은 구조를 포괄하고 콜라겐을 생성하고 분비하는 중심에 있는 기질 세포와 편광되도록 특별히 조직한다. 에스트로겐, 프로게스테론 및 안드로겐 수용체는 상피 및 기질 세포및 에스트로겐 및 테스토스테론의 생리적 수준으로 치료하여 오르가노이드의 조직을 촉진한다. 이 새로운 모형 체계는 전에 가능하지 않은 방법으로 일반적인 자궁내막 생물학 및 질병을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

프로토콜의 회로도는 그림 1에설명되어 있습니다. 자궁 조직은 병리학자에 의해 검사 된 후 수술에서 얻어졌습니다. 자궁내막은 스크레이핑에 의해 근막으로부터 분리되었고, 자궁내막 조직은 프로토콜에 설명된 바와 같이 세포에 효소적으로 소화되었다. 상피 및 기질 세포를 아가로스 몰드의 마이크로웰에 첨가하였다. 배양 7일 후, 오르가노이드를 추가로 7-14일 동안 E 및 ...

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Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

상피 및 기질 세포로 구성되는 인간 1 차 자궁내막 오르가노이드를 생성하고 네이티브 자궁내막 조직의 특성을 유지하는 프로토콜이 제시된다. 이 프로토콜은 자궁 조직 획득에서 자궁 내막 오르가노이드의 조직학적 처리에 이르는 방법을 설명합니다.

다세포 인간 1 차 자궁 내막 오르가노이드의 생성

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

내멧은 호르몬에 응하여 매달 변경되는 조직입니다. 호르몬 불균형은 배아 부착을 방지하고 또한 암 같이 질병을 일으키는 원인이 될 수 있습니다. 우리의 프로토콜은 생리적인 방법으로 여자의 바디의 외부에서 공부될 수 있도록 내메트리움을 재건합니다.이 기술의 주요 장점은 두 개의 호르몬 반응 세포 유형, 특히 조직하고 신체에서처럼 행동하는 상피 및 기질 세포로 구성된 세포의 3D 구조를 제공한다는 것입니다. 오르가노이드는 조직 행동을 더 잘 모방 할 수 있기 때문에 결국 다른 약물을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 자궁내막 기관지성 비만 및 다낭성 난소 증후군을 포함하여 암을 위한 현재 알려진 위험 요소의 직접적인 효력을 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다.우리의 오르가노이드는 두 세포 모형 사이 파라크리노 행동의 중요성을 강조합니다. 적절한 양의 조직으로 시작하는 것이 중요합니다. 상피 및 기질 세포의 올바른 밀도를 얻는 것은 까다로울 수 있습니다.또한 오르가노이드는 매우 작으며 IHC 염색으로 시각화하기가 어려울 수 있습니다. 이 절차의 시각화는 이 절차를 본 후 이해하기 가 훨씬 쉬울 몇 가지 단계가 있기 때문에 중요합니다. 이들은 자궁의 적당한 조직 층을 얻고, 결합할 세포의 적당한 조밀도를 얻고, 아가로즈 몰드를 종자하는 것을 포함합니다.세포 격리를 시작하기 전에, 제조 업체의 지시에 따라 1.5 %의 아가로즈 마이크로 몰드를 주조하고 평형화하여 오르가노이드를 보관합니다. 생물 안전 캐비닛에서 무균 기술을 사용하여 섭씨 37도에서 효소 용액을 준비하고 0.2 마이크로미터 주사기 필터를 사용하여 용액을 15 밀리리터 원유형 튜브에 멸균하십시오. 메스를 사용하여 자궁 생검에서 자궁 내막을 긁어 내고 조직을 매우 작은 조각으로 다진다.효소 용액을 함유한 15밀리리터 원내 튜브에 갓 다진 조직을 배치합니다. 캡을 닫고 오염을 방지하기 위해 왁스 필름으로 튜브의 상단을 감쌉니다. 튜브를 수조 또는 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에 부드럽게 흔들리며 30분간 튜브를 넣습니다.그 후, 50 밀리리터 원내 튜브에 20 미크론 세포 스트레이너 위에 100 미크론 세포 스트레이너를 쌓습니다. 두 스트레이너를 통해 솔루션을 필터링합니다. HBSS로 15 밀리리터 원원관을 헹구고 모든 세포가 수집되도록 여과기를 통해 세척합니다.그런 다음, 새로운 50 밀리리터 원추형 튜브에 20 미크론 세포 스트레이너를 반전하고 1 %페니실린과 연쇄 절제술로 보충 오르가노이드 미디어의 20 밀리리터와 스트레이너 떨어져 상피 세포를 씻어. 원심 분리는 500 G에서 원심 관을 5 분 동안 분리합니다. 수집된 기질 세포의 경우, 상체를 제거하고 적혈구 용해 완충제의 10 밀리리터에서 펠릿을 재보펜한다.섭씨 37도에서 10~15분간 배양하세요. 원심 분리는 5 분 동안 500 G에서 이 세포를 합니다. 상체를 제거하고 200 ~ 300 마이크로 리터의 오르가노이드 미디어로 펠릿을 다시 분리하십시오.수집된 상피 세포의 경우, 상체세포를 제거하고 100마이크로리터의 오르가노이드 미디어에서 펠릿을 재보아보세요. 1.5%의 아가로즈 몰드가 평형화된 후, 아가로즈 몰드 의 외부에 있는 오르가노이드 배지를 제거하고 조직 배양판을 기울여 아가로즈 접시의 세포 파종실에서 배지를 신중하게 제거할 수 있도록 한다. 현미경의 밑에 상피 및 기질 세포 현탁액을 보고 현탁액에 더 많은 오르가노이드 매체를 추가하여 현탁액이 밀도에서 대략 동일하도록 한 번에 100 마이크로리터만 추가하십시오.그런 다음 기질 세포의 한 부분을 상피 세포의 3개의 부분을 부피별로 결합합니다. 배피테 50 마이크로리터결합셀 현탁액을 아가로즈 몰드의 세포 파종 챔버로 내다. 아가로즈 금형이 세포로 채워지면 24웰 플레이트의 우물에 신선한 오르가노이드 미디어 400 마이크로리터를 조심스럽게 넣습니다.이산화탄소 5%를 37도에 배양하여 2일마다 500마이크로리터의 오가노이드 미디어를 사용하여 배지를 변경해야 합니다. 7 일 후, 상피 및 기질 세포의 조직을 촉진 하기 위해 0.1 나노 몰러 estradiol 및 0.8 나노 몰러 테스토스테론으로 보충 되는 하나에 매체를 변경. 첫째, 끓여서 PBS에 1.5%의 아가로즈를 녹입니다.액체 아가로오스를 뜨거운 물 비커에 넣고 약 섭씨 50도까지 식힙니다. 해부 현미경으로 24웰 플레이트를 기울이고 아가로즈 몰드 의 외부에서 배지를 조심스럽게 피펫합니다. 그런 다음 유기체를 방해하지 않도록 아가로즈 몰드 의 내부에서 배지를 조심스럽게 피펫합니다.70~75마이크로리터의 따뜻한 1.5%아가로즈를 아가로즈 접시의 챔버에 조심스럽게 추가하여 오르가노이드를 방해하지 않도록 주의하십시오. 접시를 섭씨 4도에서 5분간 식힙니다. 그 후, 24웰 플레이트의 각 우물에 4%의 파라포름알데히드를 넣고 밀봉된 아가로즈 몰드 전체를 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 고정합니다.다음 날, 파라핀 포함 을 처리 할 준비가 될 때까지 4 섭씨에 70 %에탄올에 접시를 저장합니다. RNA 격리를 시작하려면 해부 현미경으로 플레이트를 봅니다. 접시를 기울이고 아가로즈 몰드의 챔버에서 배지를 조심스럽게 피펫합니다.오가노이드가 마이크로웰에서 플러시되도록 신선한 오르가노이드 배지의 1 밀리리터를 암기로 직접 피펫하여 너무 많은 거품을 만들지 않도록 주의하십시오. 동일한 매체를 사용하여 이 강력한 파이펫 팅 프로세스를 한 번 반복합니다. 그 후, 오르가노이드를 함유하는 모든 배지를 수집한다.500 G에서 원심분리기는 오르가노이드를 수집하고 RNA 추출을 진행한다. 이 연구에서는, 자궁 내막의 상피 및 기질 세포로 구성된 인간 자궁 내막 오르가노이드는 외인성 비계 물질을 사용하지 않고 생성된다. 조직학적 처리를 위해 자궁내막 오르간노이드를 함유한 아가로즈 몰드가 아가로즈로 밀봉되고, 그 다음으로 하룻밤 사이에 4%의 파라포름알데히드로 고정된다.이러한 금형은 히스토로지, 면역형광 또는 면역히스토케작용을 위해 단면화및 염색된 표준 파라핀 포함을 위해 가공된다. 에오신 염색에 있는 헤마톡클린은 중앙에 있는 외부 및 세포를 일렬로 세우는 세포의 단 하나 층을 가진 스페로이드 같이 구조물을 제시합니다. 자궁내막, 상피 및 기질 세포를 위한 세포 특이적 마커는 중앙에 기질 세포와 함께 오르가노이드를 둘러싼 상피 세포를 드러낸다.자궁내막 생리학의 마커는 자궁내막 유기체가 네이티브 조직의 특정 특성을 유지한다는 것을 확인합니다. 콜라겐 블루와 세포를 적색으로 얼룩지게 하는 트라이 크롬 염색은 기질 세포가 있는 중앙 내의 콜라겐의 존재를 나타내며, 토착 조직과 유사한 기질 세포에 의한 콜라겐의 활성 생산 및 분비를 입증합니다. 또한, 면역조직화학염색은 상피 세포와 기질 세포 모두에서 에스트로겐 수용체, 안드로겐 수용체 및 프로게스테론 수용체의 존재를 드러낸다.우리가 다운스트림 실험을 위한 충분한 오르가노이드를 갖도록 세포를 조밀하게 플레이트하는 것이 중요합니다. 이것은 몇 가지 연습이 걸릴 것입니다. 자궁내막 기간구는 상이한 조건하에서 배양한 다음 면역조직화학 또는 면역형염염색과 같은 실험을 위해 수확하여 단백질 발현을 연구하거나 RNA를 위해 수확하여 유전자 발현을 연구할 수 있다.우리의 실험실은 자궁 내막 증식 및 암으로 이끌어 낼 수 있는 변경한 호르몬 수준에 자궁 내막이 어떻게 반응하는지 조사합니다. 우리는 호르몬의 장기 치료에 대 한 이러한 organoids를 사용 하 고 다 낭 성 난 소 증후군에서 발견 하는 과잉 남성 호르몬 등 병 적인 조건을 추가할 수 있습니다., 또는 비만 유발 된 자궁 내막 변화를 공부 하는 adipocytes에서 신호. 인간 조직은 생물위험으로 간주되며 적절한 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

IPSC 파생 된 인간의 두뇌 Organoids의 세대는 초기 신경 발달 장애를 모델링하기

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

연구

발생학

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

인간의 장 Organoids에 상피 장벽 침투성의 실시간 측정

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

냉동 절편을 위한 자기 나노입자 전착 바이러스성 벡터를 사용하여 1 차적인 마우스 장 오르가노이드의 유전 공학

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

생체 외에서 Decidualization에 대 한 인간의 자궁내 막 기질 세포의 고립

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

차동 시도에 의한 모자이크 유방 오르가노이드 생성

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

추가 세포 매트릭스 기반 및 추가 세포 매트릭스 -Murine 고환 오르가노이드의 추가 세포 매트릭스 없는 생성

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...