Name: generation of multicellular human primary endometrial organoids
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

Это исследование было профинансировано NIEHS/NIH/NCATS UG3 грант (ES029073) и Северо-Западной Школы Фейнберга медицины мост фонда (JJK). Мы хотели бы отметить Северо-Западной патологии Основной фонд для обработки фиксированных органоидов для встраивания парафина. Мы хотели бы отметить всю команду UG3, включая лаборатории Woodruff, Burdette и Urbanek, за глубокие дискуссии и сотрудничество.

Образцы эндометрия были собраны у женщин в предменопаузе, проходящих рутинную гистерэктомию для доброкачественных заболеваний матки в Северо-Западном университете Prentice Women's Hospital, в соответствии с институциональным обзором Совета утвержденных протокола. Письменное согласие было пол?...

<ol>
	<li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation.">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li><li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidualization+of+the+human+endometrium:+mechanisms,+functions,+and+clinical+perspectives.">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li><li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure.">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2.">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li><li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progesterone+receptor+regulates+implantation,+decidualization,+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network.">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium.">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li><li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis.">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li><li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+action+in+endometrial+cancer,+endometriosis,+uterine+fibroids,+and+breast+cancer.">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li><li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS/MS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay.">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li><li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome.">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. , (2019).</li></ol>

Мы создали органоиды эндометрия человека, состоящие из эпителиальных и стромальных клеток эндометрия без использования экзогенных эшафотных материалов. Хотя уже было показано, что первичные эпителиальные клетки эндометрия могут образовывать органоиды6,7<...

Эндометрий человека выстраивал полость матки и служит первым контактом для эмбриона во время имплантации. Эндометрий состоит из светящихся и железистых эпителиальных клеток, поддерживающих стромальных фибробластов, эндотелиальных клеток и иммунных клеток. Вместе, эти типы клеток составляют ткани эндометрия, которая является одним из наиболее отзывчивых тканей для половых стероидных гормонов1. Изменения, которые происходят во время каждого менструального цикла поразительны. Надлежащий рост и реконструкция эндометрия необходимы для проведения имплантации эмбриона. Аномальная реакция на эстроген и прогестерон может привести к огнеупорной эндометрия, что не позволяет для успешного установления беременности и может даже привести к заболеваниям, включая неоплазию эндометрия.
Для того, чтобы изучить гормональные реакции и существенные изменения, которые происходят в эндометрии, клетки из тканей эндометрия, вырезанные из пациентов во время операции или биопсии эндометрия были распространены в клеточной культуре. Эндометрия стромальные клетки преимущественно размножаться и распространяться легко, и процесс дифференциации индуцированных прогестерона можно резюмировать в пробирке. В результате, многое было изучено в ходе этого процесса дифференциации, называется decidualization2,3. Другой основной тип клеток в эндометрии, светящиеся и железистые эпителиальные клетки, однако, не растут хорошо, как традиционные монослои, теряя полярность, становясь старческим, и имеющие ограниченный пролиферативный потенциал. В результате, меньше известно об их биологии и их роли в эндометрии человека. Поскольку многие неоплазии происходят из эпителиальных клеток, механизмы, связанные с гиперплазией или преобразованием в раковые клетки, еще предстоит полностью определить. Кроме того, исследованияустановили,что гормональный ответ включает в себя интимные действия паракрина между эпителией и стромальными клетками эндометрия4,5.
Недавно трехмерная (3D) органоидная культура эпителиальных клеток эндометрия была установлена двумя независимыми группами6,7,которые являются первыми сообщениями о органоидациях, образованных из ткани эндометрия. Эти органоиды состояли из эндометриальных эпителиальных клеток, встроенных в белковую матрицу(Таблица Материалов)и не включали в себя важный гормонально отзывчивый отсек эндометрия эндометрия, стромальных фибробластов. Поскольку матричные белки могут варьироваться от партии к партии и могут вызвать сигнальные пути, которые не обязательно происходят в тканях, было бы идеально заменить матричные белки компонентами эндометрия. В текущем исследовании представлен протокол для создания бесхозных эндометрийских органоидов эпителии и стромальных клеток эндометрия человека. Наличие стромальных клеток не только обеспечивает поддержку эпителиальных клеток, но и обеспечивает необходимые действия паракринных, которые были установлены, чтобы быть важным для реакции гормона эндометрия4,8,9 .
Новый многоклеточный органоид эндометрия предлагает модельную систему эндометрия, которая проста в генерации и которая включает в себя как эпителиальные, так и стромальные клетки. Эти органоиды могут быть использованы для изучения долгосрочных гормональных изменений и ранних событий болезни, такие как опухолевый из-за гормонального дисбаланса или экзогенных оскорблений. Сложность этих органоидов в конечном итоге может быть расширена, чтобы включить другие типы клеток, в том числе эндотелиальных и иммунных клеток с возможно миометрийных клеток, чтобы действительно имитировать физиологии тканей человека.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Agarose HS, molecular biology grade</td>
			<td style="width:229px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:112px;">CA3510-6</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose molds</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z764043</td>
			<td>(https://www.microtissues.com/)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:229px;">Amresco</td>
			<td style="width:112px;">0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Estradiol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">E2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dispase</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNase I</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eosin Stain</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:112px;">95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RM-9101-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">21-022-CV</td>
			<td>1x without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hematoxylin Stain Solution</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">3530-32</td>
			<td>Modified Harris formulation, mercury free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07980</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrocortisone stock solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07925</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Organoid media - Mammocult</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">05620</td>
			<td>supplemented with 2 &#181;L/mL heparin and 5 &#181;L/mL hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde, 16% solution</td>
			<td style="width:229px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:112px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant</td>
			<td style="width:229px;">Agilent Technologies</td>
			<td>M356801-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protein matrix - Matrigel</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Purified mouse anti-E-cadherin antibody</td>
			<td style="width:229px;">BD Biociences</td>
			<td style="width:112px;">610181</td>
			<td>Clone 36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA lysis and isolation kit</td>
			<td style="width:229px;">Zymo Research</td>
			<td>R2060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Testosterone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Trichrome Stain</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab150686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Wax film - Parafilm</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of multicellular human primary endometrial organoids

Эндометрий человека является одним из самых гормональны реагировать тканей в организме и имеет важное значение для установления беременности. Эта ткань также может стать больной и вызвать заболеваемость и даже смерть. Модельные системы для изучения биологии эндометрия человека были ограничены системами культуры in vitro одного типа клеток. Кроме того, эпителиальные клетки, один из основных типов клеток эндометрия, не распространяются хорошо или сохранить свои физиологические черты в культуре, и, таким образом, наше понимание биологии эндометрия остается ограниченным. Мы впервые создали органоиды эндометрия, которые состоят как из эпителиальных, так и из стромальных клеток эндометрия человека. Эти органоиды не требуют каких-либо экзогенных материалов эшафот и специально организовать так, что эпителиальные клетки охватывают сфероидной структуры и становятся поляризованными с стромальных клеток в центре, которые производят и выделяют коллаген. Эстроген, прогестерон и андрогенные рецепторы выражаются в эпителиальных и стромальных клетках и лечение физиологическими уровнями эстрогена и тестостерона способствуют организации органоидов. Эта новая модель системы может быть использована для изучения нормальной биологии эндометрия и болезней таким образом, что не было возможно раньше.

Схема протокола изображена на рисунке 1. Ткань матки была получена после операции после того, как была обследована патологоанатомами. Эндометрия подкладка была отделена от миометрия путем соскабливания и ткани эндометрия была ферментативно переваривается в клетки, ка?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Представлен протокол для генерации первичных органов эндометрия, которые состоят из эпителиальных и стромальных клеток и сохраняют характеристики родной ткани эндометрия. Этот протокол описывает методы от приобретения тканей матки до гистологической обработки эндометрийных органоидов.

Поколение многоклеточных органов эндометрия человека

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Эндометрий является тканью, которая меняется каждый месяц в ответ на гормоны. Гормональный дисбаланс может предотвратить вложение эмбриона, а также вызвать такие заболевания, как рак. Наш протокол восстанавливает эндометрий так, чтобы его можно было изучать вне тела женщины физиологически.Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает 3D структуру клеток, состоящий из двух гормонально отзывчивых типов клеток, эпителиальных и стромных клеток, которые специально организуют и ведут себя так, как они делают в организме. Так как органоиды могут лучше имитировать поведение тканей, они могут в конечном итоге быть использованы для тестирования различных препаратов. Органоиды эндометрия могут быть использованы для изучения прямого воздействия известных в настоящее время факторов риска развития рака, включая ожирение и синдром поликистозных яичников.Наши органоиды подчеркивают важность паракринных действий между двумя типами клеток. Важно начать с достаточного количества тканей. Получение правильной плотности эпителиальных и стромальных клеток может быть сложно.Кроме того, органоиды довольно малы и может быть трудно визуализировать с IHC окрашивания. Визуализация этой процедуры важна, потому что есть некоторые шаги, которые будет гораздо легче понять, увидев их. К ним относятся получение правильного слоя ткани матки, получение правильной плотности клеток, чтобы объединить, и посева агарозы формы.Перед началом изоляции клеток, литые и эквилибрировать 1,5%agarose микро-формы в соответствии с инструкциями производителя для дома органоидов. В кабинете биобезопасности используйте асептические методы для подготовки ферментного раствора при 37 градусах Цельсия и стерильного фильтра раствора с помощью фильтра шприца 0,2 микрометра в 15-миллилитровую коническую трубку. Используя скальпель, соскребать эндометрий из биопсии матки и фарш ткани на очень мелкие кусочки.Поместите свежевырубленную ткань в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую ферментный раствор. Закройте крышку и оберните верхнюю часть трубки восковой пленкой, чтобы предотвратить загрязнение. Поместите трубку в ванну для воды или инкубатор при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут с нежно встряхивания.После этого сложите 100-микрон-клеточный ситечко поверх 20-микрон-клеточного ситечко на 50-миллилитровую коническую трубку. Фильтр раствор через два ситечко. Промыть 15-миллилитровую коническую трубку с HBSS и положить эту мыть через ситечко, чтобы убедиться, что все клетки собраны.Затем переверните 20-микрон-клеточный ситечко на новую 50-миллилитровую коническую трубку и смойте эпителиальные клетки с ситечком с 20 миллилитров органоидных средств, дополненных 1%пенициллином и стрептомицином. Центрифуга конических труб при 500 Г в течение пяти минут. Для собранных стромальных клеток удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в 10 миллилитров буфера лиза красных кровяных телец.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 10-15 минут. Центрифуга этих клеток при 500 Г в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы с 200 до 300 микролитров органоидных средств массовой информации.Для собранных эпителиальных клеток удалите супернатант и повторно наполните гранулы в 100 микролитров органоидных средств массовой информации. После 1.5%agarose формы equilibrated, удалить органоидные средства массовой информации на внешней стороне агарозы формы и наклона ткани культуры пластины так, что среда из камеры посева клеток блюда агарозы также могут быть тщательно удалены. Просмотр эпителиальных и стромальных клеточных суспензий под микроскопом и добавить больше органоидных средств массовой информации для суспензий, убедившись, что добавить только 100 микролитров в то время, так что подвеска примерно равны по плотности.Затем объединить одну часть стромальных клеток с тремя частями эпителиальных клеток по объему. Пипетка 50 микролитров комбинированной клеточной подвески в камеру посева клетки агарозной формы. После того, как агароза формы заполнены клетками, осторожно добавить 400 микролитров свежих органоидных средств массовой информации в колодцы 24-хорошо пластины.Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с 5%углекислого газа, убедившись, что изменить средний каждый второй день с 500 микролитров органоидных средств массовой информации. Через семь дней, изменить средний до одного, который дополняется 0,1 наномолярного эстрадиола и 0,8 наномолярного тестостерона для содействия организации эпителиальных и стромальных клеток. Во-первых, растворить 1.5%agarose в PBS путем кипячения.Поместите жидкую агарозу в стакан горячей воды и дайте ей остыть примерно до 50 градусов по Цельсию. Под рассечением микроскопа, наклонить 24-хорошо пластины и тщательно пипетки из среды с внешней стороны формы агарозы. Затем осторожно пипетка из среды из интерьера формы агарозы, чтобы избежать нарушения органоидов.Аккуратно добавьте от 70 до 75 микролитров теплого, 1,5%агарозы в камеру блюда агарозы, будьте осторожны, чтобы не беспокоить органоиды. Дайте пластине остыть при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. После этого, добавить 4%paraformaldehyde в каждый колодец из 24-хорошо пластины и исправить всю запечатанную форму агарозы на ночь при четырех градусах по Цельсию.На следующий день, хранить пластины в 70% этанола при четырех градусах по Цельсию, пока не готовы к обработке для встраивания парафина. Чтобы начать изоляцию РНК, просмотрите пластину под рассеченным микроскопом. Наклоните пластину и тщательно пипетка из среды из камеры агарозы формы.Насильно пипетка один миллилитр свежей органоидной среды непосредственно в агаросовую форму так, чтобы органоиды вымылись из микроуровн, будучи осторожными, чтобы не создавать слишком много пузырьков. Повторите этот силовой процесс пипетки один раз с помощью той же среды. После этого соберите все среды, содержащие органоиды.Центрифуга на 500 Г, чтобы собрать органоиды, и приступить к экстракции РНК. В этом исследовании органоиды эндометрия человека, состоящие из эпителиальных и стромальных клеток эндометрия, генерируются без использования экзогенных эшафотовых материалов. Для гистологической обработки, агароза формы, содержащие органоиды эндометрия запечатаны агарозой, а затем фиксации с 4%paraformaldehyde ночь.Эти формы обрабатываются для стандартного встраивания парафина секционированы и окрашены для гистологии, иммунофторесценции, или иммуногистохимии. Гематоксилин в окрашивании эозином показывает сфероидную структуру с одним слоем клеток, выстилающих внешнюю сторону и клетки в центре. Клеточные маркеры для эндометрия, эпителиальных и стромальных клеток показывают эпителиальные клетки, окружающие органоиды с стромальными клетками в центре.Маркеры физиологии эндометрия подтверждают, что органоиды эндометрия сохранили определенные характеристики родной ткани. Трихомральное окрашивание, которое окрашивает коллагеновый синий цвет и клетки красного цвета, показывает наличие коллагена в центре, где проживали стромальные клетки, демонстрируя активное производство и секрецию коллагена стромальными клетками, похожими на родную ткань. Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание выявляет наличие рецепторов эстрогена, рецепторов андрогенов и рецепторов прогестерона как в эпителиальных, так и в стромальных клетках.Важно плотно потрохать клетки так, чтобы у нас было достаточно органоидов для экспериментов ниже по течению. Это займет некоторую практику. Органоиды эндометрия могут быть выучены в различных условиях, а затем собраны для экспериментов, таких как иммуногистохимия или иммунофлуоресценция окрашивания для изучения экспрессии белка или собраны для РНК для изучения экспрессии генов.Наша лаборатория исследует, как эндометрий реагирует на измененные уровни гормонов, что может привести к гиперплазии эндометрия и раку. Мы можем использовать эти органоиды для долгосрочного лечения гормонов и добавить патологических состояний, таких как избыток тестостерона в синдроме поликистозных яичников, или сигналы от адипоцитов для изучения ожирения индуцированных изменений эндометрия. Человеческие ткани считаются биологически случайными, и важно принять соответствующие меры предосторожности.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

Генерация IPSC, полученные из органоидов человеческого мозга Модели раннего развития нервной системы Расстройства

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Поколение стандартизированных и воспроизводимые переднего мозга тип мозгового Organoids от человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Поколение и культивирование первичных человеческие кератиноциты от взрослых кожи

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Реальном времени измерения проницаемости эпителиальных барьер в человека кишечные Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Генетическая инженерия первичных маучек кишечных органоидов использование магнитных наночастиц Трансдукции Вирусные векторы для замороженных секций

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Изоляции человека эндометрия стромальных клеток In Vitro Decidualization

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Поколение Organoids от мыши внепеченочных желчных протоков

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Поколение мозаичных органоидов дифференциальной трипсинизации

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Дополнительные сотовые матрицы на основе и экстра сотовой матрицы свободного поколения Murine яичка органоидов

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Генерация и культивация лингвальных органоидов, полученных из стволовых клеток вкуса взрослой мыши

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...