Name: generation of multicellular human primary endometrial organoids
Uploaded: 2019-10-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

Bu çalışma NIEHS/NIH/NCATS UG3 hibe (ES029073) ve Northwestern Feinberg School of Medicine Bridge fund (JJK) tarafından finanse edilmiştir. Biz parafin katıştırma için sabit organoidler işleme için Northwestern Patoloji Çekirdek Tesisi kabul etmek istiyorum. Woodruff, Burdette ve Urbanek laboratuvarları da dahil olmak üzere tüm UG3 ekibini anlayışlı tartışmalar ve işbirlikleri için kabul etmek istiyoruz.

Endometrial örnekler Northwestern Üniversitesi Prentice Kadın Hastanesi'nde benign rahim koşulları için rutin histerektomi geçiren premenopozal kadınlardan alındı, Kurumsal İnceleme Kurulu onaylı protokole göre. Çalışmaya dahil olan tüm kadınlardan yazılı izin alındı.
1. Agarose Kalıplarının Hazırlanması
<ol><li>Hücre izolasyonuna başlamadan önce, organoidleri üreticinin talimatlarına göre barındırmak için %1,5 agarose mikro kalıpları(Malzeme Tab...

<ol>
	<li>Henriet, P., Gaide Chevronnay, H. P., Marbaix, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endocrine+and+paracrine+control+of+menstruation.">The endocrine and paracrine control of menstruation.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 358 (2), 197-207 (2012).</li><li>Gellersen, B., Brosens, I. A., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidualization+of+the+human+endometrium:+mechanisms,+functions,+and+clinical+perspectives.">Decidualization of the human endometrium: mechanisms, functions, and clinical perspectives.</a> Seminars in Reproductive Medicine. 25 (6), 445-453 (2007).</li><li>Gellersen, B., Brosens, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+decidualization+of+the+human+endometrium+in+reproductive+health+and+failure.">Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure.</a> Endocrine Reviews. 35 (6), 851-905 (2014).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antiproliferative+action+of+progesterone+in+uterine+epithelium+is+mediated+by+Hand2.">The antiproliferative action of progesterone in uterine epithelium is mediated by Hand2.</a> Science. 331 (6019), 912-916 (2011).</li><li>Wetendorf, M., DeMayo, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+progesterone+receptor+regulates+implantation,+decidualization,+and+glandular+development+via+a+complex+paracrine+signaling+network.">The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 357 (1-2), 108-118 (2012).</li><li>Boretto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+organoids+from+mouse+and+human+endometrium+showing+endometrial+epithelium+physiology+and+long-term+expandability.">Development of organoids from mouse and human endometrium showing endometrial epithelium physiology and long-term expandability.</a> Development. 144 (10), 1775-1786 (2017).</li><li>Turco, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term,+hormone-responsive+organoid+cultures+of+human+endometrium+in+a+chemically+defined+medium.">Long-term, hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium.</a> Nature Cell Biology. 19 (5), 568-577 (2017).</li><li>Kurita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+progesterone+receptors+mediate+the+inhibitory+effects+of+progesterone+on+estrogen-induced+uterine+epithelial+cell+deoxyribonucleic+acid+synthesis.">Stromal progesterone receptors mediate the inhibitory effects of progesterone on estrogen-induced uterine epithelial cell deoxyribonucleic acid synthesis.</a> Endocrinology. 139 (11), 4708-4713 (1998).</li><li>Kim, J. J., Kurita, T., Bulun, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+action+in+endometrial+cancer,+endometriosis,+uterine+fibroids,+and+breast+cancer.">Progesterone action in endometrial cancer, endometriosis, uterine fibroids, and breast cancer.</a> Endocrine Reviews. 34 (1), 130-162 (2013).</li><li>Bui, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+serum+testosterone+during+the+menstrual+cycle+evaluated+by+daily+measurements+with+an+ID-LC-MS/MS+method+and+a+2nd+generation+automated+immunoassay.">Dynamics of serum testosterone during the menstrual cycle evaluated by daily measurements with an ID-LC-MS/MS method and a 2nd generation automated immunoassay.</a> Steroids. 78 (1), 96-101 (2013).</li><li>Wiwatpanit, T., Murphy, A. R., Lu, Z., Urbanek, M., Burdette, J. E., Woodruff, T. K., Kim, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaffold-free+endometrial+organoids+respond+to+excess+androgens+associated+with+polycystic+ovarian+syndrome.">Scaffold-free endometrial organoids respond to excess androgens associated with polycystic ovarian syndrome.</a> The Journal of Clinical Endocrinology &amp; Metabolism. , (2019).</li></ol>

Ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ürettik. Birincil endometrial epitel hücrelerininorganoidler6,7oluşturabildiği gösterilmiş olsa da, bu hücreler fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan jelatinimsi bir protein matrisine gömülmüştür (bkz. Malzemeler Tablosu) spheroid benzeri yapılar oluşturur. Buna ek olarak, endometrial stromal hüc...

İnsan endometrium hatları rahim boşluğu ve implantasyon sırasında embriyo için ilk temas olarak hizmet vermektedir. Endometrium luminal ve glandüler epitel hücreleri, destekleyici stromal fibroblastlar, endotel hücreleri ve bağışıklık hücrelerinden oluşur. Birlikte, Bu hücre tipleri seks steroid hormonları için en duyarlı dokulardan biri olan endometrial doku makyaj1. Her adet döngüsü sırasında meydana gelen değişiklikler çarpıcı. Embriyo implantasyonunun gerçekleşmesi için uygun büyüme ve endometriumun yeniden şekillendirilmesi gereklidir. Östrojen ve progesteron anormal yanıt gebeliğin başarılı kurulması için izin vermez ve hatta endometrial neoplazi de dahil olmak üzere hastalıklara neden olabilir refrakter bir endometrium neden olabilir.
Endometriumda oluşan hormon yanıtlarını ve temel değişiklikleri incelemek için ameliyat veya endometrial biyopsi sırasında hastalardan alınan endometrial dokulardan alınan hücreler hücre kültüründe yayılımkonusu olmuştur. Endometrial stromal hücreler tercihen çoğalır ve kolayca yayılır, ve progesteron tarafından indüklenen farklılaşma süreci in vitro recapitulated olabilir. Sonuç olarak, desidualizasyon2,3olarak adlandırdığı bu farklılaşma sürecinde çok şey öğrenilmiştir. Endometrium diğer önemli hücre tipi, luminal ve glandüler epitel hücreleri, ancak, polarite kaybetme, yaşlanma, yaşlanmak, ve sınırlı çoğaltıcı potansiyele sahip, geleneksel monolayers olarak iyi büyümek yok. Sonuç olarak, daha az biyoloji ve insan endometrium onların rolü bilinmektedir. Birçok neoplazi epitel hücrelerinden kaynaklandığı gibi, hiperplazi veya kanser hücrelerine dönüşüm ile ilişkili mekanizmalar tam olarak tanımlanmış olmaya devam etmektedir. Ayrıca, çalışmalar hormon yanıtı endometriumepitelve stromal hücreler arasında samimi parakrin eylemleri içerdiğini kurduk4 ,5.
Son zamanlarda, endometrial epitel hücrelerinin üç boyutlu (3D) organoid kültürü iki bağımsız grup tarafından kurulmuştur6,7, endometrial dokudan oluşan organoidlerin ilk raporları. Bu organoidler bir protein matrisi(Malzeme Tablosu)içine gömülü endometrial epitel hücrelerinden oluşuyordu ve endometrial endometriumun hormonal olarak duyarlı önemli bir bölmesi olan stromal fibroblastları içermiş. Matris proteinler çok dan çok değişebilir ve mutlaka dokuda meydana gelmez sinyal yolları tetikleyebilir gibi, endometrium bileşenleri ile matris proteinleri yerine ideal olacaktır. Mevcut çalışmada, insan endometriumunun epitel ve stromal hücrelerinin iskelesiz insan endometrial organoidlerinin oluşturulmasına bir protokol sunulmuştur. Stromal hücrelerin varlığı sadece epitel hücreleri için destek sağlamakla kalmıyor, aynı zamanda endometriyal hormon yanıtı için önemli olduğu tespit edilen gerekli parakrin eylemleri de sağlar4,8,9 .
Yeni multisellüler endometriyal organoid oluşturmak için basit ve hem epitel hem de stromal hücreleri içeren endometrium bir model sistemi sunuyor. Bu organoidler hormonal dengesizlik veya eksojen hakaretler nedeniyle tümörigenez gibi hastalığın uzun süreli hormonal değişiklikleri ve erken olaylarını incelemek için kullanılabilir. Bu organoidlerin karmaşıklığı sonunda diğer hücre tipleri içerecek şekilde genişletilebilir, endotel ve bağışıklık hücreleri muhtemelen miyomsal hücreleri ile de dahil olmak üzere gerçekten insan doku fizyolojisi taklit etmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:981px;" width="981">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Agarose HS, molecular biology grade</td>
			<td style="width:229px;">Denville Scientific</td>
			<td style="width:112px;">CA3510-6</td>
			<td style="width:320px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agarose molds</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z764043</td>
			<td>(https://www.microtissues.com/)</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:229px;">Amresco</td>
			<td style="width:112px;">0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Estradiol</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">E2257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Collagenase, Type II, powder</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">17101015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Dispase</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">DNase I</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">EDTA</td>
			<td style="width:229px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">BP120-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Eosin Stain</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td style="width:112px;">95057-848</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Estrogen Receptor (SP1), rabbit monoclonal antibody</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>RM-9101-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Fluoroshield with DAPI, histology mounting medium</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:229px;">Corning</td>
			<td style="width:112px;">21-022-CV</td>
			<td>1x without calcium, magnesium, and phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hematoxylin Stain Solution</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:112px;">3530-32</td>
			<td>Modified Harris formulation, mercury free</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Heparin solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07980</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Hydrocortisone stock solution</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">07925</td>
			<td>added to MammoCult media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Organoid media - Mammocult</td>
			<td style="width:229px;">STEMCELL Technologies</td>
			<td style="width:112px;">05620</td>
			<td>supplemented with 2 &#181;L/mL heparin and 5 &#181;L/mL hydrocortisone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Paraformaldehyde, 16% solution</td>
			<td style="width:229px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:112px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin-Streptomycin</td>
			<td style="width:229px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phosphate buffered saline, pH 7.4</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">P3813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Progesterone Receptor, PgR 1294, unconjugated, culture supernatant</td>
			<td style="width:229px;">Agilent Technologies</td>
			<td>M356801-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">protein matrix - Matrigel</td>
			<td style="width:229px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:112px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Purified mouse anti-E-cadherin antibody</td>
			<td style="width:229px;">BD Biociences</td>
			<td style="width:112px;">610181</td>
			<td>Clone 36</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:320px;">Recombinant anti-vimentin antibody [EPR3776]</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab92547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNA lysis and isolation kit</td>
			<td style="width:229px;">Zymo Research</td>
			<td>R2060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:320px;">Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:112px;">S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Testosterone</td>
			<td style="width:229px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>86500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Trichrome Stain</td>
			<td style="width:229px;">Abcam</td>
			<td style="width:112px;">ab150686</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Wax film - Parafilm</td>
			<td style="width:229px;">VWR</td>
			<td>52858-000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of multicellular human primary endometrial organoids

İnsan endometrium vücutta ki en hormonal duyarlı dokulardan biridir ve gebeliğin kurulması için gereklidir. Bu doku da hastalıklı olabilir ve morbidite ve hatta ölüme neden olabilir. İnsan endometrial biyolojisini inceleyen model sistemler, tek hücreli in vitro kültür sistemleri ile sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, endometriumun en önemli hücre tiplerinden biri olan epitel hücreleri, kültürdeki fizyolojik özelliklerini iyi yaymaz veya korumaz ve böylece endometriyal biyoloji anlayışımız sınırlı kalmaktadır. İlk defa insan endometriumunun hem epitel hem de stromal hücrelerinden oluşan endometrial organoidler oluşturduk. Bu organoidler herhangi bir ekzojen iskele malzemeleri gerektirmez ve özellikle epitel hücreleri küresel benzeri yapıyı kapsayacak şekilde düzenlemek ve üretmek ve kollajen salgılayan merkezinde stromal hücreleri ile polarize olur. Östrojen, progesteron ve androjen reseptörleri epitel ve stromal hücrelerde ifade edilir ve östrojen ve testosteron fizyolojik düzeyleri ile tedavi organoidlerin organizasyonu teşvik. Bu yeni model sistemi, normal endometriyal biyoloji ve hastalıkları daha önce mümkün olmayan şekillerde incelemek için kullanılabilir.

Protokol şeması Şekil 1'degösterilmiştir. Komindoku patologlar tarafından incelendikten sonra ameliyatla elde edildi. Endometriyal astar kazınarak miyometriumdan ayrılmış ve endometriyal doku enzimatik olarak protokolde belirtildiği gibi hücrelere sindirilmiştir. Epitel ve stromal hücreler agarose kalıplarında mikrowelllere eklendi. Kültürde 7 gün kaldıktan sonra organoidler 7−14 gün daha E ve T ile tedavi edildi.
Histolojik işlemler için,...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids at JoVE.com

Generation of Multicellular Human Primary Endometrial Organoids

Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

The human endometrium is one of the most hormonally responsive tissues in the body and is essential for the establishment of pregnancy. This tissue can ...

Endometrium hormonlara yanıt olarak her ay değişen bir dokudur. Hormon dengesizliği embriyo bağlanmasını önleyebilir ve aynı zamanda kanser gibi hastalıklara neden olabilir. Protokolümüz endometrium'u yeniden inşa ediyor, böylece kadının vücudunun dışında fizyolojik bir şekilde incelenebilir.Bu tekniğin en büyük avantajı, hormonal olarak duyarlı iki hücre tipinden oluşan 3Boyutlu bir hücre yapısı sağlamasıdır, epitel ve stroma hücreleri özellikle vücutta yaptıkları gibi organize ve davranışta bulunurlar. Organoidler doku davranışını daha iyi taklit edebildiklerinden, sonunda farklı ilaçları test etmek için kullanılabilirler. Endometrial organoidler kanser için şu anda bilinen risk faktörlerinin doğrudan etkilerini incelemek için kullanılabilir, obezite ve polikistik over sendromu da dahil olmak üzere.Organoidlerimiz iki hücre tipi arasındaki parakrin eylemlerin önemini vurgularlar. Yeterli miktarda dokuyla başlamak önemlidir. Epitel ve stromal hücrelerin doğru yoğunluğu elde etmek zor olabilir.Ayrıca, organoidler oldukça küçük ve IHC boyama ile görselleştirmek zor olabilir. Bu yordamın görselleştirilmesi önemlidir, çünkü gördükten sonra anlaşılması çok daha kolay olan bazı adımlar vardır. Bu rahim doğru doku tabakası alma, birleştirmek için hücrelerin doğru yoğunluğu nu elde ve agarose kalıpları tohumlama içerir.Hücre izolasyonuna başlamadan önce, organoidleri barındırmak için üreticinin talimatlarına göre %1,5 agarose mikro kalıpları atar ve dengeler. Bir biyogüvenlik kabininde, 37 santigrat derecede bir enzim çözeltisi hazırlamak için aseptik teknikler kullanın ve 15 mililitrelik konik tüpe 0,2 mikrometreşon filtre kullanarak çözeltiyi steril filtreleyin. Neşter kullanarak rahim biyopsilerinden endometrium kazıyın ve dokuyu çok küçük parçalara ayırın.Taze kıyılmış dokuyu enzim çözeltisini içeren 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. Kapağı kapatın ve kontaminasyonu önlemek için bir balmumu filmi ile tüpün üst sarın. Tüpü 37 derecede su banyosuna veya kuvöze yerleştirin.Bundan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüp üzerinde 20 mikron hücreli süzgeç üstüne 100 mikron hücreli süzgeç yığını. Çözümü iki süzgeç arasından filtreleyin. HBSS ile 15 mililitrelik konik tüp durulayın ve tüm hücrelerin toplanması sağlamak için süzgeç aracılığıyla bu yıkama koymak.Daha sonra, yeni bir 50 mililitrekonik tüp üzerine 20 mikron hücreli süzgeç ters ve organoid medya 20 mililitre ile süzgeç kapalı epitel hücreleri yıkayın 1% penisilin ve streptomisin ile takviye. Konik tüpleri 500 G'de beş dakika santrifüj edin. Toplanan stromal hücreler için, supernatant çıkarın ve kırmızı kan hücresi lisis tampon 10 mililitre pelet resuspend.37 derecede 10-15 dakika kuluçkaya yat. Bu hücreleri 500 G'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve organoid medya 200 ila 300 mikrolitre ile pelet resuspend.Toplanan epitel hücreleri için, supernatant kaldırmak ve organoid medya 100 mikrolitre pelet resuspend. %1.5 agarose kalıpları dengeledikten sonra, agarose kalıplarının dışındaki organoid ortamı çıkarın ve doku kültür plakasını yatırın, böylece agarose yemeklerinin hücre tohumlama odasından orta da dikkatlice çıkarılabilir. Epitel ve stromal hücre süspansiyonlarını mikroskop altında görüntüleyin ve süspansiyonlara daha fazla organoid ortam ekleyin, böylece süspansiyonun kabaca yoğunlukta eşit olmasını sağlayarak bir seferde sadece 100 mikrolitre eklemeyi unutmayın.Sonra hacim olarak epitel hücrelerinin üç bölümden stromal hücrelerin bir kısmını birleştirin. Pipet 50 mikrolitre kombine hücre süspansiyonu agarose kalıbının hücre tohumlama odasına. Agarose kalıpları hücrelerle doldurulduktan sonra, 24 kuyulu plakanın kuyularına 400 mikrolitre taze organoid ortam ekleyin.%5 karbondioksit ile 37 derecede kuluçka, organoid medya 500 mikrolitre ile her iki günde bir orta değiştirmek için emin olun. Yedi gün sonra, epitel ve stromal hücrelerin örgütlenmesini teşvik etmek için 0.1 nanomolar estradiol ve 0.8 nanomolar testosteron ile desteklenen bir orta değiştirin. İlk olarak, kaynatılarak PBS%1.5 agarose eritin.Sıcak su bir kabı içine sıvı agarose yerleştirin ve yaklaşık 50 santigrat dereceye soğumasını bekleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, 24-iyi plaka yatırın ve dikkatle agarose kalıp dışından orta pipet. Daha sonra organoidleri bozmamak için agarose kalıbının içinden ortayı dikkatlice çıkarın.Dikkatlice 70 ve 75 mikrolitre sıcak, 1.5% agarose çanak odasına agarose ekleyin, organoidler rahatsız etmemeye dikkat. Plaka dört santigrat derecede beş dakika soğumasını bekleyin. Bundan sonra, 24-iyi plaka her kuyuiçine% 4 paraformaldehit ekleyin ve dört santigrat derece bir gecede tüm mühürlü agarose kalıp düzeltmek.Ertesi gün, parafin gömme işlemi için hazır olana kadar plakayı dört santigrat derecede %70 etanolde saklayın. RNA izolasyonuna başlamak için, plakayı bir kesme mikroskobu altında görüntüleyin. Tabağı yatırın ve agarose kalıbının odasından orta yı dikkatlice pipetle dışarı atın.Zorla pipet taze organoid orta doğrudan agarose kalıp içine böylece organoidler mikrowells dışarı atılır, çok fazla kabarcıklar oluşturmak için dikkatli olmak. Aynı ortamı kullanarak bu güçlü pipetleme işlemini bir kez tekrarlayın. Bundan sonra, organoidler içeren tüm orta toplamak.Organoidleri toplamak için 500 G'de santrifüj edin ve RNA ekstraksiyonuna devam edin. Bu çalışmada, endometriumun epitel ve stromal hücrelerinden oluşan insan endometriyal organoidleri ekzojen iskele malzemeleri kullanılmadan üretilmiştir. Histolojik işlemler için, endometriyal organoidleri içeren agarose kalıpları agarose ile kapatılır, ardından bir gecede %4 paraformaldehit ile fiksasyon yapılır.Bu kalıplar histoloji, immünoresans veya immünohistokimya için standart parafin gömme ve lekeli olarak işlenir. Eozin boyama hematoksilin hücre dışında ve merkezinde hücreleri astar tek bir tabaka ile küresel benzeri bir yapı ortaya koymaktadır. Endometrial, epitel ve stromal hücreler için hücrespesifik belirteçler merkezde stromal hücreler ile organoid çevreleyen epitel hücreleri ortaya.Endometrial fizyolojinin belirteçleri endometrial organoidlerin doğal dokunun bazı özelliklerini koruduğunu doğrulamaktadır. Kollajen mavisi ve hücreleri kırmızı lekeler üç krom boyama, stromal hücrelerin yaşadığı merkezi içinde kollajen varlığını gösterir, aktif üretim ve stromal hücreler tarafından kollajen salgılanması gösteren yerli doku benzer. Buna ek olarak, immünohistokimyasal boyama östrojen reseptörlerinin varlığını ortaya koymaktadır, androjen reseptörleri, ve progesteron reseptörleri hem epitel hem de stromal hücrelerde.Hücreleri yoğun bir şekilde kaplamak önemlidir, böylece akıntı deneyleri için yeterli organoidimiz olur. Bu biraz pratik alacak. Endometrial organoidler farklı koşullar altında kültürlenebilir ve daha sonra protein ekspresyonunu incelemek için immünohistokimya veya immünofloresan boyama gibi deneyler için hasat edilebilir veya gen ekspresyonunu incelemek için RNA için hasat edilir.Laboratuarımız endometriumun değişmiş hormon düzeylerine nasıl tepki verebileceğini araştırır, bu da endometrial hiperplazi ve kansere yol açabilir. Biz hormonların uzun vadeli tedaviler için bu organoidler kullanabilirsiniz ve polikistik over sendromu bulunan aşırı testosteron gibi patolojik koşullar eklemek, ya da obezite kaynaklı endometrial değişiklikleri incelemek için adipositlerden sinyalleri. İnsan dokuları biyolojik olarak tehlikeli olarak kabul edilir ve uygun önlemlerin alınması önemlidir.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation of iPSC-derived Human Brain Organoids to Model Early Neurodevelopmental Disorders

iPSC türetilmiş İnsan Beyin Organoids oluşturulması Erken Nörogelişimsel Bozuklukları Model

The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Standart ve tekrarlanabilir ön türü beyin Organoids insan nesil Pluripotent kök hücreler indüklenen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

Oluşturma ve birincil insan lenfositi yetişkin cilt, kültür

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Genetic Engineering of Primary Mouse Intestinal Organoids Using Magnetic Nanoparticle Transduction Viral Vectors for Frozen Sectioning

Primer fare bağırsak Organoidlerin genetik mühendisliği dondurulmuş bölümleme için Manyetik Nano madde dönüştürücü viral vektörler kullanma

Intestinal organoid cultures provide a unique opportunity to investigate intestinal stem cell and crypt biology in vitro, although efficient approaches to ...

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Vitro Decidualization için insan endometrium Stromal hücre izolasyon

The differentiation of human endometrial stromal cells (HESC) from fibroblast-like appearance into secretory decidua is a transformation required for ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Organoids fare Extrahepatic safra kanalları üzerinden nesil

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Generation of Mosaic Mammary Organoids by Differential Trypsinization

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Organoids offer self-organizing, three-dimensional tissue structures that recapitulate physiological processes in the convenience of a dish. The murine ...

Extra Cellular Matrix-Based and Extra Cellular Matrix-Free Generation of Murine Testicular Organoids

Ekstra Hücresel Matris Tabanlı ve Ekstra Hücresel Matrissiz Murine Testiküler Organoidlerin Üretimi

Testicular organoids provide a tool for studying testicular development, spermatogenesis, and endocrinology in vitro. Several methods have been developed ...

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Yetişkin Fare Tadı Kök Hücrelerinden Elde Edilen Lingual Organoidlerin Üretimi ve Kültürü

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...