Name: generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة/NICHD HD091068 إلى الدكتورة أينا Dobrinski.

ملاحظه: تم الحصول علي الخصيتين من الخنازير التي تبلغ من العمر أسبوعا واحدا من مزرعة خنازير تجاريه كمنتج ثانوي من خصاء الخنازير التجارية. تمت الموافقة علي مصادر الخصيتين من قبل لجنه الرعاية الحيوانية في جامعه كالغاري.
1. اعداد حلول الانزيم لهضم الانسجه
ملاحظه: ?...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+testicular+organoid:+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger.">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li><li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis.">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li><li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system.">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li><li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties.">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li><li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates.">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li><li>Gonz&#225;lez, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Mouse+Monopoly:+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models.">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes.">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li><li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development.">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li></ol>

لقد انشانا طريقه بسيطه تسمح للجيل متسقة وقابله للتكرار من اعداد كبيره من organoids الخصية مع الهندسة المعمارية الانسجه التي تشبه الخصية في الجسم المجري12. في حين تم تطوير النهج باستخدام خلايا الخصية الخنازير ، فانه ينطبق علي نطاق أوسع أيضا علي الماوس ، الرئيسيات غير البشرية والخص?...

في السنوات الاخيره ، كان هناك تجدد الاهتمام في ثلاثي الابعاد (3D) الهيكل التنظيمي. وقد تم اشتقاق أجهزه مختلفه مثل الأمعاء1، المعدة2، البنكرياس3،4، الكبد5، والدماغ6 بنجاح إلى أنظمه organoid 3d. هذه العضوية لديها أوجه التشابه المعمارية والوظيفية للأعضاء في الجسم الحيوي وأكثر اهميه بيولوجيا لدراسة البيئة المجهرية الانسجه من النظم الثقافية أحاديه الطبقة7. ونتيجة لذلك ، وقد بدات organoids الخصية لكسب الفائدة كذلك8،9،10،11،12. معظم الطرق المبلغ عنها حتى الآن هي معقده, غير عاليه الانتاجيه10 وتتطلب أضافه البروتينات ECM8,10. هذا التعقيد يؤدي أيضا إلى مشاكل مع استنساخ. وهناك حاجه إلى طريقه بسيطه وقابله للاستنساخ التي تسمح للجيل من الخصية العضوية مع الجمعيات الخلية التي هي مثل الخصية في الجسم الفيفو.
وقد أبلغنا مؤخرا عن نظام لمعالجه هذه المتطلبات12. باستخدام خنزير كنموذج ، استخدمنا الطرد المركزي القسري نهج التجميع في نظام microwell. في ال [ميكروسس] نظامه, يحتوي كل بئر [ا لرج نومبر] من متماثلة صغيره ميكروويلس13. هذا يسمح للجيل من يتعدد خزان من حجم متسقة. وقد مكن نظام microwell من توليد اعداد كبيره من الهيكل التنظيمي الموحد مع بنيه خاصه بالخصية. النظام بسيط ولا يتطلب أضافه بروتينات ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm ultra low attachment tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#CLS3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrwell 400</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#34411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5138</td>
			<td>referred as Collagenase IV S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV Worthington</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>#LS004189</td>
			<td>referred as Collagenase IV W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 70 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 40 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine testicular tissue</td>
			<td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture

Organoids هي ثلاثه هياكل الابعاد تتالف من أنواع الخلايا المتعددة التي هي قادره علي تلخيص هندسه الانسجه ووظائف الأعضاء في الجسم المجري. وقد فتحت تشكيل الهيكل التنظيمي سبلا مختلفه للبحوث الاساسيه والانتقالية. في السنوات الاخيره ، وقد حصلت organoids الخصية الاهتمام في مجال البيولوجيا الانجابيه الذكور. الخصية العضوية تسمح للدراسة من التفاعلات خليه الخلية ، وتطوير الانسجه ، والخلية الجرثومية البيئة الدقيقة المتخصصة وتسهيل الانتاجيه العالية المخدرات والسمية الفرز. وهناك حاجه إلى طريقه موثوق بها والتكرار توليد العضوية الخصية مع الهيكل الانسجه المحددة الخصية. يحتوي نظام الثقافة microwell علي مجموعه كثيفه من ميكروويلس علي شكل هرم. خلايا الخصية المستمدة من الخصيتين قبل البلوغ طرد في هذه الميكروويلس ومثقف لتوليد organoids الخصية مع البنية الانسجه الخاصة بالخصية والجمعيات الخلية. يمكن توليد آلاف من العضويات المتجانسة عبر هذه العملية. سيكون البروتوكول المذكور هنا موضع اهتمام واسع للباحثين الذين يدرسون تكاثر الذكور.

الخلايا المعزولة من الخصيتين الخنازير القديمة التي تم استزراعها في الميكروويلس المنظم ذاتيا في خزان (الشكل 1ا، الشكل 2) ، مع الخارجية المحددة والمتميزة (ظهاره اللاهوتية) والمقصورات الداخلية ( انترستيتيوم) (الشكل 1(...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

هنا ، نقدم بروتوكولا للجيل القابل للاستنساخ من الخصية الوركية مع بنيه نسيجيه خاصه بالخصية باستخدام نظام الاستزراع المجهري المتوفر تجاريا.

جيل من الخنازير الخصيتين مع الهندسة المعمارية الخاصة بالخصية باستخدام الثقافة Microwell

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لتوليد organoids الخصية، والتي يمكن استخدامها كمنصة لدراسة morphogenesis الخصية و لارتفاع الأدوية تروبو والفحوصات السمية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها قابلة للاستنساخ للغاية، وتتطلب عدداً منخفضاً نسبياً من الخلايا، ويمكن استخدامها لتوليد عدد كبير من الأعضاء الخصية مع بنية الخصية المحددة. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة أنظمة أخرى، مثل الخلايا الجذعية متعددة القدرات أو خلايا جزر البنكرياس مع التحسينات اللازمة.مما يدل على إجراء الهضم الانزيمية الأنسجة الخصية سيكون آنا فويغت، طالبة دكتوراه من مختبري. جمع الخصية في منقار عقيمة ويغسل مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ ستريبتوميسين البنسلين. بعد غسل نقل الخصية إلى 100 ملليمتر طبق زراعة الأنسجة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ من البنسلين ستريبتوميسين.استخدام مقص autoclaved والملقط لإزالة tunica المهبل وepdidymis. نقل الخصية المعزولة إلى طبق جديد 100 ملليمتر وغسلها جيدا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ البنسلين ستريبتوميسين. قطع الخصية على طول المحور الطولي مباشرة تحت tunica.ثم قشر الخصية من tunica باستخدام اثنين من ملقط ووضعها في طبق جديد 100 ملليمتر تحتوي على 1 ملليلتر من DMEM مع 1٪ ستيربتوميسين البنسلين. اِنُمَمُق الخصيتين المقشرة بمقص معقمة إلى قطعة من الأنسجة إلى 2 ملليمتر. بعد التقطيع استخدام ملقط العقيمة لإزالة شظايا بيضاء من النسيج الضام.نقل قطع الأنسجة المفروم إلى حل A في أنبوب 50 ملليلتر وأعلىه تصل إلى 50 ملليلتر مع DMEM للحصول على تركيز 0.4 ملليغرام لكل ملليلتر لكولاجيناز 4S وتركيز 0.8 ملليغرام لكل ملليلتر لكولاجيناز 4W. ضع الأنبوب الذي يحتوي على قطع الأنسجة في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عكس بلطف أنبوب كل خمس دقائق.بعد 30 دقيقة، الطرد المركزي الأنبوب في 90 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. تجاهل supernatant، 40 ملليلتر من حل B، وأعلى تصل إلى 50 ملليلتر مع DMEM للحصول على تركيز 1.2 ملليغرام لكل ملليلتر من الكولاجيناز 4W. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وعكس الأنبوب بلطف كل خمس دقائق.جهاز طرد مركزي الأنبوب في 90 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. بعد ذلك تجاهل supernatant، وغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني مع 1٪ البنسلين ستريبتوميسين. جمع بعناية الأنابيب من أعلى ومكان في أنبوب جديد 50 ملليلتر.أعلى أنبوب مع برنامج تلفزيوني يصل إلى 50 ملليلتر. جهاز طرد مركزي الأنابيب في 90 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة 1.5 دقيقة. تجاهل supernatant وإضافة برنامج تلفزيوني جديد لغسل مرتين إضافيتين.بعد غسل برنامج تلفزيوني الماضي إزالة فائقة وإعادة تعليق الأنابيب seminiferous في خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. ثم، إضافة 15 ملليلتر من 0.25٪ تريبسين EDTA إلى الأنابيب. ضع الأنبوب في حمام مائي 37 درجة مئوية وعكسه بلطف كل دقيقتين.بعد خمس دقائق تقييم الهضم الأنزيمي من الأنابيب إلى خلايا واحدة تحت المجهر مع 10 ميكرولترات من عينة على لوحة ثقافة الأنسجة. كل دقيقتين ضع العينة تحت المجهر لمراقبة. إذا كان في الغالب يمكن الكشف عن خلايا واحدة وقف التفاعل مع خمسة ملليلتر من FBS وتصفية من خلال شبكة 70 ميكرون ومن ثم من خلال شبكة 40 ميكرون.أجهزة الطرد المركزي الخلايا الفردية في 500 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إعادة تعليق في 50 ملليلتر من متوسطة التخصيب، وعد عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس الهيموسيت. نقل 20 مليون من هذه الخلية بدءا من كل من اثنين من مرفق منخفضة للغاية 100 ملليمتر أطباق بيتري واحتضان في حاضنة الأنسجة والثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 21٪ الأكسجين لمدة يومين.Cede 20 إلى 25 مليون خلية من الخلايا المتبقية بدءا من كل 100 ملليمتر طبق زراعة الأنسجة في حجم إجمالي قدره ثمانية ملليلتر من متوسط التخصيب. ضع الطبق في حاضنة وبعد 1.5 ساعة تأكد من أن معظم خلايا سيرتولي متصلة باللوحة. إمالة قليلا اثنين من لوحات لجمع والجمع بين عظمى في لوحة واحدة جديدة 100 ملليمتر ووضعها مرة أخرى في الحاضنة.بعد ساعة واحدة، مرة أخرى الجمع بين عظمى من اثنين من لوحات إلى لوحة جديدة 100 ملليمتر. ضع اللوحات مرة أخرى في الحاضنة بين عشية وضحاها. ثم جمع الخلايا الجرثومية المخصب في شقين، غير المنضمين جزء وجزء انتصـر قليلا.جمع المناط ككسر غير الملتزم. لكسر مُلتَمَى قليلاً يغسل الأطباق بلطف مع برنامج تلفزيوني ويعامل بمليلترين من 1 إلى 20 تخفيف 0.25٪ تريبسين EDTA لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. وقف رد الفعل عن طريق إضافة مليلترين من متوسطة التخصيب وجمع في أنبوب كسر غير الملتزم.الجمع بين إعداد خلية البداية والخلايا الجرثومية المخصب في أنبوب للحصول على إعداد خلية العمل التي تحتوي على 25٪ من الخلايا الجرثومية. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. تخلص من الخلايا المُتسرّعة وإعادة تعليقها في 20 ملليلترًا من تشكيلات أعضاءية متوسطة للوصول إلى تركيز 2.4 مليون خلية لكل ملليلتر.في أنبوب جديد إضافة ملليلتر واحد من الحل الذي يحتوي على خلايا. إضافة 0.5 ملليلتر من محلول الشطف السطحي لكل بئر في لوحة صغيرة. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء في البئر.لإزالة فقاعات الهواء الطرد المركزي لوحة في 2،000 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين. مراقبة لوحة تحت المجهر المقلوب التكبير المنخفض للتحقق من أن فقاعات قد أزيلت من الآبار الصغيرة. غطي الطبق بغطاء ويحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.بعد العلاج هو كامل إزالة محلول الشطف وعلى الفور غسل لوحة مع الماء المعقم أو برنامج تلفزيوني. إضافة 0.5 ملليلتر من تشكيل الجهاز المتوسط لكل بئر والطرد المركزي في 2، 000 مرات G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة دقيقتين لإزالة أي فقاعات الهواء المحاصرين. مراقبة البئر تحت المجهر المقلوب التكبير المنخفض للتحقق من أن فقاعات الهواء قد أزيلت.إضافة 0.5 ملليلتر من تعليق الخلية العاملة ومزيج بلطف عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا. جهاز طرد مركزي في 500 مرة G مع فواصل في 25 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. استخدم مجهر مقلوب للتحقق من أن الخلايا قد تجمعت داخل الآبار الدقيقة.نقل لوحة في حاضنة ثقافة الخلية والثقافة لمدة خمسة أيام. تغيير نصف المتوسط كل يومين. لاسترداد organoids استخدام ماصة واسعة الفم إلى ماصة بلطف المتوسطة صعودا وهبوطا.وهذا يسمح organoids للخروج من الآبار الصغيرة. جمع organoids، وإصلاح وتنفيذ الكيمياء المناعية لعلامة الخلية الجرثومية، علامة الخلية Sertoli، علامة الخلية المايويد peritubular وعلامة خلية Leydig وتصور تحت مجهر confocal. في هذه الدراسة عزل الخلايا من الخصيات porcine لمدة أسبوع واحد التي كانت مثقفة في الآبار الصغيرة ذاتية التنظيم في spheroids مع المقصورات الخارجية والداخلية المبينة والمميزة.تم فصل المقصورتين من قبل الكولاجين الرابع غشاء الطابق السفلي إيجابية. وكانت خلايا سيرتولي الإيجابية والخلايا الجرثومية الإيجابية UCHL1 في المقصورة الخارجية على غشاء الطابق السفلي. aSMA إيجابية خلايا myoid محيط أنبوبي كانت مترجمة على طول داخل غشاء الطابق السفلي بينما كانت خلايا CYP450 Leydig إيجابية في وسط الخلية.هذا الهيكل مشابه لظروف في الموقع ، حيث تقع خلايا Leydig ، الخلايا myoid حول أنبوبي ، في الخلية ، في المقصورة الخلالية والخلايا الجرثومية ، تقع خلايا سيرتولي في ظهارة شبهية. من المهم التأكد من أن الخلايا المستخدمة لتوليد الأعضاء لديها نوعية مثالية. وينبغي إيلاء اهتمام دقيق خلال مرحلة التربسينية من الهضم الأنزيمي.بعد هذا الإجراء يمكن أن تكون organoids مثقفا على المدى الطويل لدراسة تمايز الخلايا الجرثومية أو تحليل للتعبير الجيني والبروتينات أو الهرمونات المفرزة. القدرة على خلق organoids مع الخصية المحددة اقترانات الخلايا يوفر رواية في المختبر نظام لدراسة التفاعلات الخلية الخلية الهامة لتطوير الخصية ووظيفة الخلية الجرثومية.

Research

JoVE Journal

Medicine

Teratoma Generation in the Testis Capsule

الجيل مسخي في كبسولة الخصية

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

تقنية المشتريات الكبد الخنازير وزرع مثلي باستخدام أحدث بورتو الأجوف التحويلة

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

العزلة وثقافة توسيع ورم محددة الخلايا البطانية

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

A غليوبلاستوما الإنسان أورغانوتيبيك نموذج شريحة شريحة لدراسة هجرة الخلايا السرطانية والآثار الخاصة بالمريض من الأدوية المضادة للغزو

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

جيل من Microtumors عن طريق نظام الثقافة 3D Biogel الإنسان وخلايا ورم أرومي دبقي المستمدة من المريض لKinomic التنميط والدواء استجابة اختبار

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

جيل من وسائل الإعلام وتطبيقات مكيفة الجهاز لدراسة التأثيرات-الجهاز بشكل خاص على سرطان الثدي النقيلي السلوك

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

جيل من كبد الفأر أنسنة طريق كبد الإنسان خلايا الجذعية

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

المخدرات تطويعها لأغراض أخرى فرضية الجيل باستخدام &quot;RE: المخدرات بخير&quot; النظام

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

الاختلالات العضلات: اختبار وتدريب القوة الوظيفية أوتار غريب الأطوار في السكان الرياضي

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...