Name: generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von NIH/NICHD HD091068-01 an Dr. Ina Dobrinski unterstützt.

HINWEIS: Die Hoden von einwöchigen Ferkeln wurden von einer gewerblichen Schweinehaltung als Nebenprodukt aus der Kastration von Handelsschweinen gewonnen. Die Beschaffung von Hoden wurde vom Animal Care Committee der University of Calgary genehmigt.
1. Herstellung von Enzymlösungen für die Gewebeverdauung
HINWEIS: Es werden drei verschiedene enzymatische Lösungen benötigt, die zwei verschiedene Kollagenase-IV-Lösungen (Lösung A, B) und eine Desoxyribonuklease-...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+testicular+organoid:+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger.">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li><li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis.">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li><li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system.">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li><li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties.">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li><li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates.">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li><li>Gonz&#225;lez, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Mouse+Monopoly:+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models.">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes.">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li><li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development.">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li></ol>

Wir haben eine einfache Methode etabliert, die die konsistente, wiederholbare Erzeugung einer großen Anzahl von Hodenorganoiden mit Gewebearchitektur ermöglicht, die Hoden in vivo12ähnelt. Während der Ansatz mit Schweine-Hodenzellen entwickelt wurde, ist er breiter angelegt auch auf Maus, nicht-menschliche Primaten und menschliche Hoden12anwendbar. Für die Herstellung von Hodenorganoiden 8,9,<sup cla...

In den letzten Jahren ist das Interesse an dreidimensionalen (3D) Organoiden wieder gestiegen. Verschiedene Organe wie Darm1, Magen2, Bauchspeicheldrüse3,4, Leber5und Gehirn6 wurden erfolgreich in 3D-Organoid-Systeme abgeleitet. Diese Organoide haben architektonische und funktionelle Ähnlichkeiten mit den Organen in vivo und sind biologisch relevanter für die Untersuchung der Gewebemikroumgebung als monolayer Kultursysteme7. Als Ergebnis, Hodenorganoide haben begonnen, Interesse zu gewinnen sowie8,9,10,11,12. Die meisten bisher gemeldeten Methoden sind komplex, nicht hoher Durchsatz10 und erfordern die Zugabe von ECM-Proteinen8,10. Diese Komplexität führt auch zu Problemen mit der Reproduzierbarkeit. Es wird eine einfache und reproduzierbare Methode benötigt, die die Erzeugung von Hodenorganoiden mit Zellassoziationen ermöglicht, die wie Hoden in vivo sind.
Wir haben vor kurzem ein System gemeldet, um diese Anforderungen zu erfüllen12. Unter Verwendung des Schweins als Modell verwendeten wir einen zentrifugalen erzwungenen Aggregationsansatz im Mikrowell-System. Im Mikrowell-System enthält jeder Brunnen eine große Anzahl identischer kleinerer Mikrobrunnen13. Dies ermöglicht die Erzeugung zahlreicher Sphäroide einheitlicher Größe. Das Microwell-System ermöglichte die Erzeugung einer großen Anzahl einheitlicher Organoide mit einer testis-spezifischen Architektur. Das System ist einfach und erfordert keine Zugabe von ECM-Proteinen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm ultra low attachment tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#CLS3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrwell 400</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#34411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5138</td>
			<td>referred as Collagenase IV S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV Worthington</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>#LS004189</td>
			<td>referred as Collagenase IV W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 70 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 40 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine testicular tissue</td>
			<td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture

Organoide sind dreidimensionale Strukturen, die aus mehreren Zelltypen bestehen, die in der Lage sind, Gewebearchitektur und Funktionen von Organen in vivo zu rekapitulieren. Die Bildung von Organoiden hat verschiedene Wege der Grundlagen- und Translationsforschung eröffnet. In den letzten Jahren haben Hodenorganoide Interesse auf dem Gebiet der männlichen Reproduktionsbiologie geweckt. Hodenorganoide ermöglichen die Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, Gewebeentwicklung und der Keimzellnische Mikroumgebung und ermöglichen das Screening von Arzneimitteln und Toxizitäten mit hohem Durchsatz. Eine Methode ist erforderlich, um Hodenorganoide mit Hoden-spezifischer Gewebearchitektur zuverlässig und reproduzierbar zu erzeugen. Das Mikrobrunnenkultursystem enthält eine dichte Reihe von pyramidenförmigen Mikrobrunnen. Hodenzellen, die aus präpubertären Hoden gewonnen werden, werden in diese Mikrobrunnen zentrifugiert und kultiviert, um Hodenorganoide mit hodenspezifischer Gewebearchitektur und Zellassoziationen zu erzeugen. Tausende von homogenen Organoiden können über diesen Prozess erzeugt werden. Das hier berichtete Protokoll wird für Forscher, die die Männliche Fortpflanzung untersuchen, von breitem Interesse sein.

Isolierte Zellen aus 1 Wochen alten Schweinehoden, die in den Mikrobrunnen selbst organisiert in Sphäroide kultiviert wurden (Abbildung 1A, Abbildung 2), mit abgegrenzten und ausgeprägten äußeren (seminiferen Epithel) und Innenfächern ( interstitium) (Abbildung 1B, Abbildung 2). Die beiden Fächer wurden durch eine Kollagen-IV+...

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Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Hier stellen wir ein Protokoll zur reproduzierbaren Erzeugung von Schweinehodenorganoiden mit Testis-spezifischer Gewebearchitektur unter Verwendung des handelsüblichen Mikrowell-Kultursystems vor.

Erzeugung von Porcine Hodenorganoiden mit Testis-spezifischer Architektur mit Microwell-Kultur

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Dieses Protokoll ist wichtig, weil es die Erzeugung von Hodenorganoiden ermöglicht, die als Plattform für die Untersuchung der Hodenmorphogenese und für Tests mit hohem Tropomedikament und Toxizität spämisch genutzt werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie sehr reproduzierbar ist, eine relativ geringe Anzahl von Zellen benötigt und verwendet werden kann, um eine große Anzahl von Hodenorganoiden mit hodenspezifischer Architektur zu erzeugen. Diese Methode kann angewendet werden, um andere Systeme zu untersuchen, wie pluripotente Stammzellen oder Pankreas-Isletzellen mit den notwendigen Optimierungen.Demonstriert wird das enzymatische Verdauungsverfahren des Hodengewebes von Anna Voigt, einer Doktorandin aus meinem Labor. Die Hoden in ein steriles Becherglas einsammeln und mit PBS waschen, das 1%Penicillin-Streptomycin enthält. Nach dem Waschen den Hoden auf eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale mit PBS mit 1%Penicillin-Streptomycin übertragen.Verwenden Sie autoklavierte Schere und Zange, um die Tunika vaginalis und epididymis zu entfernen. Den isolierten Hoden auf eine neue 100-Millimeter-Schale übertragen und gründlich mit PBS waschen, das 1%Penicillin-Streptomycin enthält. Schneiden Sie die Hoden entlang der Längsachse direkt unter der Tunika.Dann schälen Sie die Hoden aus der Tunika mit zwei Zangen und legen Sie sie in eine neue 100-Millimeter-Schale mit 1 Milliliter DMEM mit 1%Penicillin Streptomycin. Den geschälten Hoden mit steriler Schere in ein bis zwei Millimeter Gewebestücke zerkleinern. Nach dem Hacken verwenden Sie sterile Zangen, um die weißen Fragmente des Bindegewebes zu entfernen.Übertragen Sie die gehackten Gewebestücke in Lösung A in einem 50-Milliliter-Rohr und verladen Sie sie auf 50 Milliliter mit DMEM, um eine Konzentration von 0,4 Milligramm pro Milliliter für Diekolagenase 4S und eine Konzentration von 0,8 Milligramm pro Milliliter für Kolagenase 4W zu erhalten. Legen Sie das Rohr mit den Gewebeteilen 30 Minuten lang in ein 37 Grad Celsius Wasserbad. Umkehren Sie das Rohr alle fünf Minuten sanft.Nach 30 Minuten zentrieren Sie das Rohr bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand, ad 40 Milliliter der Lösung B, und toppen Sie bis zu 50 Milliliter mit DMEM, um eine Konzentration von 1,2 Milligramm pro Milliliter Kolagenase 4W zu erhalten. Legen Sie die Röhre für 30 Minuten in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und umkehren Sie das Rohr alle fünf Minuten sanft.Zentrifugieren Sie das Rohr bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Danach den Überstand entsorgen und einmal mit PBS mit 1%Penicillin Streptomycin waschen. Sammeln Sie die Tubuli vorsichtig von oben und legen Sie sie in ein neues 50-Milliliter-Rohr.Aufladen Sie das Rohr mit PBS bis zu 50 Millilitern. Zentrifugieren Sie die Tubuli bei 90 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für 1,5 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und fügen Sie frische PBS hinzu, um zwei weitere Male zu waschen.Nach der letzten PBS-Waschung entfernen Sie den Überstand und setzen Sie die seminiferen Tubuli in fünf Milliliter PBS wieder auf. Dann fügen Sie 15 Milliliter 0.25%Trypsin EDTA zu den Tubuli hinzu. Legen Sie das Rohr in ein 37 Grad Celsius Wasserbad und alle zwei Minuten sanft umkehren.Nach fünf Minuten die enzymatische Verdauung von Tubuli an einzelnen Zellen unter dem Mikroskop mit 10 Mikrolitern Probe auf einer Gewebekulturplatte bewerten. Alle zwei Minuten stellen Sie die Probe unter das Mikroskop, um sie zu beobachten. Wenn meist einzelne Zellen nachgewiesen werden können, stoppen Sie die Reaktion mit fünf MilliliterFBS und filtern durch ein 70-Mikron-Netz und dann durch ein 40-Mikron-Netz.Zentrifugieren Sie die einzelnen Zellen bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Re-suspend in 50 Milliliter Anreicherungsmedium, und zählen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen mit einem Hämozytometer. Übertragen Sie 20 Millionen dieser Ausgangszellpopulation in jede der beiden ultra-niedrigen Befestigung 100 Millimeter Petrischalen und inkubieren in einem Gewebe-Kultur-Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff für zwei Tage.Cede 20 bis 25 Millionen Zellen der verbleibenden Ausgangszellpopulation pro 100 Millimeter Gewebekulturschale in einem Gesamtvolumen von acht Milliliter n an reicherieren. Legen Sie die Schale in einen Inkubator und stellen Sie nach 1,5 Stunden sicher, dass die Mehrheit der Sertoli-Zellen an der Platte befestigt sind. Neigen Sie zwei Platten leicht, um die Überräube zu sammeln und in einer neuen 100-Millimeter-Platte zu kombinieren und wieder in den Inkubator zu legen.Nach einer Stunde wieder die Überräube zweier Platten zu einer neuen 100-Millimeter-Platte kombinieren. Legen Sie die Platten über Nacht wieder in den Inkubator. Dann sammeln Sie die angereicherten Keimzellen in zwei Fraktionen, nicht-anhaftende Fraktion und leicht anhaftende Fraktion.Sammeln Sie den Überstand als die nicht-haftende Fraktion. Für die leicht haftende Fraktion die Platten vorsichtig mit PBS waschen und mit zwei Millilitern einer einbis 20 Verdünnung von 0,25%Trypsin EDTA fünf Minuten bei Raumtemperatur behandeln. Stoppen Sie die Reaktion, indem Sie zwei Milliliter Anreicherungsmedium hinzufügen und in der nicht haftenden Bruchröhre sammeln.Kombinieren Sie das Ausgangszellpräparat mit den angereicherten Keimzellen in einer Röhre, um ein Arbeitszellenpräparat mit 25% Keimzellen zu erhalten. Zentrifuge bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 20 Milliliterorganoid-Bildungsmedium, um eine Konzentration von 2,4 Millionen Zellen pro Milliliter zu erreichen.In einem neuen Rohr fügen Sie einen Milliliter der Lösung, die Zellen enthält. Fügen Sie 0,5 Milliliter Tensidspüllösung zu jedem Brunnen in einer Mikrobrunnenplatte hinzu. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Brunnen gefangen sind.Um Luftblasen zu entfernen zentrifugieren die Platte bei 2 000 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für zwei Minuten. Beobachten Sie die Platte unter einem invertierten Mikroskop mit niedriger Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Blasen aus den Mikrobrunnen entfernt wurden. Bedecken Sie die Platte mit einem Deckel und inkubieren Sie für 30 Minuten bei Raumtemperatur.Nach der Behandlung ist die Spüllösung vollständig entfernen und sofort waschen Sie die Platte mit sterilem Wasser oder PBS. Fügen Sie 0,5 Milliliter Organoid-Formationmedium zu jedem Brunnen und Zentrifuge bei 2.000 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für zwei Minuten, um alle gefangenen Luftblasen zu entfernen. Beobachten Sie den Brunnen unter einem invertierten Mikroskop mit niedriger Vergrößerung, um zu überprüfen, ob die Luftblasen entfernt wurden.0,5 Milliliter der Arbeitszellenaufhängung hinzufügen und sanft vermischen, indem man nach oben und unten pfeift. Zentrifuge bei 500 mal G mit Pausen bei 25 Grad Celsius für fünf Minuten. Verwenden Sie ein invertiertes Mikroskop, um zu überprüfen, ob sich die Zellen in den Mikrobrunnen gruppiert haben.Übertragen Sie die Platte für fünf Tage in einen Zellkultur-Inkubator und eine Kultur. Wechseln Sie jeden zweiten Tag die Hälfte des Mediums. Um die Organoide zu erholen, verwenden Sie eine Breitmaulpipette, um das Medium sanft nach oben und unten zu pipette.Dadurch können die Organoide aus den Mikrobrunnen herauskommen. Sammeln Sie die Organoide, fixieren und führen Sie Immunzytochemie für Keimzellmarker, Sertoli-Zellmarker, peritubulären Myoidzellmarker und Leydig-Zellmarker durch und visualisieren Sie unter einem konfokalen Mikroskop. In dieser Studie isolierten Zellen aus einwöchigen Schweinehoden, die in Mikrobrunnen selbst organisiert in Sphäroide mit abgegrenzten und unterschiedlichen Außen- und Innenfächern kultiviert wurden.Die beiden Fächer wurden durch eine Kollagen IV positive Kellermembran getrennt. GATA4-positive Sertoli-Zellen und UCHL1-positive Keimzellen befanden sich im Außenfach auf der Kellermembran. aSMA positive peri-tubuläre Myoidzellen wurden entlang der Innenseite der Kellermembran lokalisiert, während CYP450 positive Leydig-Zellen im Zentrum des Interstitiums waren.Diese Struktur ähnelt Den In-Situ-Bedingungen, bei denen sich Leydig-Zellen, peri-tubuläre Myoidzellen, im Interstitium, im Interstitiial-Kompartiment und keimzellen befinden, Sertoli-Zellen befinden sich am Seminiferepithel. Es ist wichtig sicherzustellen, dass Zellen, die verwendet werden, um Organoide zu erzeugen, eine optimale Qualität haben. Während der Trypsinisierungsphase der enzymatischen Verdauung sollte sorgfältig darauf geachtet werden.Nach diesem Verfahren können die Organoide langfristig kultiviert werden, um die Keimzelldifferenzierung zu untersuchen oder auf Genexpression und sezernierte Proteine oder Hormone zu analysieren. Die Fähigkeit, Organoide mit hodenspezifischen Zellassoziationen zu erzeugen, bietet ein neuartiges In-vitro-System zur Untersuchung von Zell-Zell-Wechselwirkungen, die für die Entwicklung von Hoden und die Keimzellfunktion wichtig sind.

Research

JoVE Journal

Medicine

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Teratom-Generation in den Hoden Capsule

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Forschung

Medizin

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

Technik der Schweineleber Beschaffung und orthotopen Transplantation mit einem Active Porto-Kava-Shunt

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Isolierung und Kultur Expansion von tumorspezifischen Endothelzellen

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Ein menschliches Glioblastom Organotypisches Scheibenkulturmodell zur Untersuchung der Tumorzellmigration und patientenspezifischen Wirkungen von antiinvasiven Arzneimitteln

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Die Erzeugung von Microtumors Mit 3D Human Biogel Kultursystem und Patienten stammGlioblastomZellen für Kinomic Profilieren and Drug Response-Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Die Erzeugung von Orgelanlage Medien und Anwendungen für das Studium Organspezifische Einflüsse auf Brustkrebs Metastasiertem Verhalten

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

Erzeugung eines humanisierten Maus-Leber unter Einsatz von menschlichem Leberstammzellen

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

Drug Repurposing Hypothesengenerierung Mit der &quot;RE: Fein Drugs&quot; System

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Muskel-Ungleichgewichte: Testen und trainieren funktionale exzentrische Muskelfaserriss Stärke in Athletic Populationen

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...