Name: generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי NIH/HD091068-01 לד ר רינה דוברינסקי.

הערה: האשכים מ 1-שבוע החזרזירונים התקבלו מחוות חזיר מסחרית כתוצר לידי מסירוס של חזירים מסחריים. המקור של האשכים אושרה על ידי ועדת הטיפול בעלי חיים באוניברסיטת קלגרי.
1. הכנת פתרונות אנזימים לעיכול רקמות
הערה: יש צורך בשלושה פתרונות אנזימטיים שונים, הכוללים שתי ?...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+testicular+organoid:+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger.">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li><li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis.">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li><li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system.">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li><li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties.">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li><li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates.">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li><li>Gonz&#225;lez, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Mouse+Monopoly:+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models.">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes.">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li><li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development.">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li></ol>

הקמנו שיטה פשוטה המאפשרת את עקבית, הדור לשחזור של מספר גדול של אורגנואידים האשכים עם אדריכלות רקמות דומה להעיד ב vivo12. בעוד הגישה פותחה באמצעות תאי התפיסה של חזירי, היא ישימה יותר באופן כללי גם על העכבר, הפרימטים הלא אנושיים ו-האדם12. מספר שיטות שונות דווחו להפקת אור...

בשנים האחרונות, היתה תחייה של עניין באורגנואידים תלת ממדיים. איברים שונים כגון המעי1, בטן2, הלבלב3,4, הכבד5, ואת המוח6 נגזר בהצלחה לתוך 3d מערכות אורגאיד. לאורגנואידים אלה יש דמיון אדריכלי ופונקציונלי לאיברים בvivo והם רלוונטיים יותר ביולוגית לחקר מיקרואקולוגיה של רקמות מאשר מערכות התרבות7. כתוצאה מכך, מארגני האשכים החלו לקבל ריבית כמו גם8,9,10,11,12. רוב השיטות שדווחו עד כה מורכבות, תפוקה שאינה גבוהה10 ודורשות תוספת של חלבונים ecm8,10. מורכבות זו גם מובילה לבעיות עם התוכסות. שיטה פשוטה ומקיימת צורך שמאפשר את הדור של אורגנואידים האשכים עם שיוכי תאים שהם כמו ביקורות של vivo.
לאחרונה דיווחו על מערכת שתפנה לדרישות הללו12. בעזרת החזיר כמודל, העסקנו גישה. לצבירת כפייה גלית במערכת המיקרוגל במערכת המיקרוגל, כל הבאר מכילה מספר רב של מערך המיקרוגל הקטן יותר13. זה מאפשר את הדור של מספר רב של מידות בגודל אחיד. מערכת המיקרוגל אפשרה דור של מספר רב של ממדים אחידים עם ארכיטקטורה ספציפית. המערכת פשוטה ואינה דורשת תוספת של חלבונים מבית ECM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm ultra low attachment tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#CLS3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrwell 400</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#34411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5138</td>
			<td>referred as Collagenase IV S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV Worthington</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>#LS004189</td>
			<td>referred as Collagenase IV W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 70 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 40 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine testicular tissue</td>
			<td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture

אורגנואידים הם שלושה מבנים ממדיים המורכב מסוגי תאים מרובים המסוגלים ללכוד את ארכיטקטורת הרקמה ופונקציות של איברים בvivo. היווצרות אורגנואידים פתחה שדרות שונות של מחקר בסיסי וטרנסלייתי. בשנים האחרונות, אורגנואידים האשכים צברה עניין בתחום ביולוגיה של הגבר הרבייה. אורגנואידים האשכים לאפשר את המחקר של אינטראקציות תא תא, התפתחות רקמות, ואת התא הנבט נישה מיקרואקולוגיה ולהקל על התפוקה הגבוהה של סמים והקרנות רעילות. שיטה נדרשת באופן אמין ומתוכשל ליצור אורגנואידים האשכים עם הרקמה הספציפית של רקמת רקמות. מערכת התרבות של המיקרוגל מכילה מערך צפוף של המיקרוגל בצורת פירמידה. תאים האשכים נגזר מפני האשכים pubertal הם centrifuged לתוך המיקרוגל האלה ותרבותי כדי ליצור אורגנואידים האשכים עם ביקורות-הרקמה הספציפית בדיקות ואגודות תאים. בתהליך זה ניתן ליצור אלפי אורגנואידים אחידים. הפרוטוקול המדווח כאן יהיה עניין נרחב לחוקרים הלומדים רבייה גברית.

תאים מבודדים מ 1-שבוע האשכים חזירי שהיו מתורבתים במיקרוגל עצמי מאורגן לתוך spheroids (איור 1A, איור 2), עם החיצוני הנבדל ונפרד (אפיתל הרקמות) ותאי פנים ( interstitium) (איור 1ב, איור 2). שני התאים היו מופרד?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

לכאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור הדור הניתן להתרבות של אורגנואידים האשך של חזירי עם ארכיטקטורת רקמה ספציפית בראש באמצעות מערכת התרבות הזמינה מסחרית למיקרוגל.

הדור של מבנה האשך של פורצין עם הארכיטקטורה הספציפית ביותר באמצעות התרבות של המיקרוגל

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר את הדור של אורגנואידים האשכים, אשר יכול לשמש כפלטפורמה לחקר morphogenesis האשך עבור תרופות tropo גבוהה הקרנות רעילות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא ניתנת לשחזור מאוד, דורשת מספר נמוך יחסית של תאים ו ניתן להשתמש בה כדי ליצור מספר רב של אורגנואידים האשכים עם ארכיטקטורה ספציפית לאשם. שיטה זו יכולה להיות מיושמת כדי ללמוד מערכות אחרות, כגון תאי גזע פלוריפוטנטיים או תאי איון הלבלב עם האופטימיזציה הדרושה.הפגנת הליך העיכול האנזימטי של רקמת האשכים תהיה אנה וויגט, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. אסוף את האשכים לתוך מקור סטרילי ולשטוף עם PBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין. לאחר הכביסה מעבירים את האשכים לתבשיל תרבות רקמה של 100 מילימטר עם PBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין.השתמש מספריים autoclaved ומלקחים כדי להסיר את הנרתיק טוניקה ואפידימיס. מעבירים את האשכים המבודדים לתבשיל חדש של 100 מילימטרים ושוטפים היטב עם PBS המכיל 1%פניצילין סטרפטומיצין. חותכים את האשכים לאורך ציר האורך ישירות מתחת לטוניקה.לאחר מכן לקלף את האשכים מתוך טוניקה באמצעות שני ממטרים ולמקם אותו לתוך צלחת חדשה 100 מילימטר המכיל 1 מיליליטר של DMEM עם 1% פניצילין סטרפטומיצין. טחון את האשכים קלופים עם מספריים סטריליים לחתיכות רקמה אחד עד שני מילימטר. לאחר החיתוך להשתמש מדפים סטריליים כדי להסיר את השברים הלבנים של רקמת חיבור.להעביר את חתיכות רקמה טחון לתוך פתרון A בצינור 50 מיליליטר ו לראשו עד 50 מיליליטר עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 0.4 מיליגרם למיליליטר עבור colagenase 4S וריכוז של 0.8 מיליגרם למיליליטר עבור colagenase 4W. מניחים את הצינור המכיל את חתיכות הרקמה לתוך 37 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך 30 דקות. בעדינות להפוך את הצינור כל חמש דקות.לאחר 30 דקות, צנטריפוגה הצינור ב 90 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות. השלך את supernatant, מודעה 40 מיליליטר של פתרון B, ו העליון עד 50 מיליליטר עם DMEM כדי לקבל ריכוז של 1.2 מיליגרם למיליליטר של colagenase 4W. מניחים את הצינור לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות בעדינות להפוך את הצינור כל חמש דקות.צנטריפוגה הצינור ב 90 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות. לאחר מכן להשליך את supernatant, ולשטוף פעם אחת עם PBS עם 1%פניצילין סטרפטומיצין. בזהירות לאסוף את הצינורות מלמעלה ואת המקום לתוך צינור חדש 50 מיליליטר.למעלה את הצינור עם PBS עד 50 מיליליטר. צנטריפוגה הפקעות ב 90 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות. השליכו את העל-טבעי והוסיפו PBS טרי לשטוף פעמיים נוספות.לאחר לשטוף PBS האחרון להסיר את העל טבעי מחדש להשעות את צינוריות חצי מיליליטר בחמישה מיליליטר של PBS. לאחר מכן, להוסיף 15 מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA לשחפת. מניחים את הצינור באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בעדינות להפוך כל שתי דקות.לאחר חמש דקות להעריך את העיכול האנזימטי של צינוריות לתאים בודדים מתחת למיקרוסקופ עם 10 microliters של מדגם על צלחת תרבות רקמה. כל שתי דקות מניחים את הדגימה מתחת למיקרוסקופ כדי להתבונן. אם בעיקר תאים בודדים ניתן לזהות לעצור את התגובה עם חמישה מיליליטר של FBS ולסנן דרך רשת של 70 מיקרון ולאחר מכן דרך רשת של 40 מיקרון.צנטריפוגה התאים הבודדים ב 500 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. להשעות מחדש 50 מיליליטר של מדיום העשרה, ולספר את מספר התאים קיימא באמצעות hemocytometer. העבר 20 מיליון מאוכלוסיית תאים התחלתית זו לכל אחד משני צלחות פטרי אולטרה-נמוכות 100 מילימטר וחרבן באינקובטור של תרבות הרקמות ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-21% חמצן ליומיים.לוותר על 20 עד 25 מיליון תאים של אוכלוסיית התאים ההתחלתיים הנותרים לכל צלחת תירתי רקמה 100 מילימטר בנפח כולל של שמונה מיליליטר של מדיום העשרה. מניחים את המנה לתוך אינקובטור ולאחר 1.5 שעות להבטיח כי רוב התאים Sertoli מחוברים לצלחת. להטות מעט שתי צלחות כדי לאסוף ולשלב את supernatants לתוך צלחת אחת חדשה 100 מילימטר ולמקום אותו בחזרה לתוך החממה.לאחר שעה, שוב לשלב את supernatants של שתי צלחות לצלחת חדשה 100 מילימטר. מניחים את הצלחות בחזרה לתוך החממה לילה. לאחר מכן לאסוף את תאי הנבט מועשר בשני שברים, שבר שאינו חסיד שבר חסידי מעט.אסוף את העל-טבעי כשבר שאינו חסיד. עבור שבר מעט חסיד לשטוף את הצלחות בעדינות עם PBS ולטפל עם שני מיליליטר של אחד עד 20 דילול של 0.25% טריפסין EDTA במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לעצור את התגובה על ידי הוספת שני מיליליטר של מדיום העשרה ולאסוף בצינור שבר שאינו חסיד.שלב את הכנת התא ההתחלתי ואת תאי הנבט המועשרים בצינור כדי להשיג הכנת תא עבודה המכילה 25% תאי נבט. צנטריפוגה ב 500 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השלך את העל-טבעי והשהה מחדש את התאים ב-20 מיליליטר של מדיום היווצרות אורגנואידים כדי להגיע לריכוז של 2.4 מיליון תאים למיליליטר.בצינור חדש להוסיף מיליליטר אחד של הפתרון המכיל תאים. הוסף 0.5 מיליליטר של פתרון שטיפה פעילי שטח לכל באר בצלחת מיקרו באר. ודא כי אין בועות אוויר לכודים באר.כדי להסיר בועות אוויר צנטריפוגה הצלחת ב 2, 000 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. שימו לב לצלחת תחת מיקרוסקופ הפוך הגדלה נמוכה כדי לוודא שהבועות הוסרו מהמיקרו בארות. מכסים את הצלחת במכסה ודגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.לאחר סיום הטיפול להסיר את פתרון השטיפה מיד לשטוף את הצלחת עם מים סטריליים או PBS. הוסף 0.5 מיליליטר של היווצרות אורגנואידית בינונית לכל באר וצנטריפוגה ב 2, 000 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי להסיר את כל בועות אוויר לכודים. שימו לב ל באר תחת מיקרוסקופ הפוך הגדלה נמוכה כדי לוודא כי בועות האוויר הוסרו.מוסיפים 0.5 מיליליטר של ההשעיה של תא העבודה ומערבבים בעדינות על ידי צינור למעלה ולמטה. צנטריפוגה ב 500 פעמים G עם הפסקות ב 25 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. השתמש במיקרוסקופ הפוך כדי לוודא שהתאים התקבצו בתוך בארות המיקרו.מעבירים את הצלחת לאנקובטור ותרבות של תרבות תאים למשך חמישה ימים. תחליף חצי מהמדיום כל יומיים. כדי לשחזר את האורגנואידים להשתמש פיפטה רחבת פה כדי pipette בעדינות את המדיום למעלה ולמטה.זה מאפשר האורגנואידים לצאת ממיקרו בארות. לאסוף את האורגנואידים, לתקן ולבצע ציטוכימיה חיסונית עבור סמן תא נבט, סמן תא Sertoli, סמן תא מיואיד פריטובולרי סמן תא Leydig ולהמחיש תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. במחקר זה בודדו תאים מתוך אשכי פורצ'ין בני שבוע שהיו מתורבתים במיקרו בארות מאורגנות בעצמן לספריואידים עם תאים חיצוניים ופנימיים מובחנים ומובחנים.שני התאים הופרדו על ידי קרום מרתף חיובי קולגן IV. תאי סרטולי חיוביים GATA4 ותאי נבט חיוביים UCHL1 היו בתא החיצוני על קרום המרתף. תאי מיואידים פרי-צינוריים חיוביים של aSMA היו מקומיים לאורך החלק הפנימי של קרום המרתף בעוד תאי Leydig חיוביים CYP450 היו במרכז האינטרסטיטיום.מבנה זה דומה לתנאי Situ, שבו תאי Leydig, תאים מיואידים צינוריים פרי, ממוקמים interstitium, בתאי תאים interstitial ונבט, תאי Sertoli ממוקמים האפיתל חצי שנתי. חשוב להבטיח כי תאים המשמשים ליצירת אורגנואידים יש איכות אופטימלית. יש להקדיש תשומת לב זהירה במהלך שלב ההתזה של העיכול האנזימטי.בעקבות הליך זה האורגנואידים יכולים להיות מתורבתים לטווח ארוך כדי ללמוד התברואה תא נבט או לנתח ביטוי גנים וחלבונים מופרשים או הורמונים. היכולת ליצור אורגנואידים עם אסוציאציות תאים ספציפיות לאשם מספקת מערכת חוץ-חוץ-תאית חדשנית לחקר אינטראקציות בין תאים לתאים החשובים להתפתחות האשכים ולתפקוד תאי הנבט.

Research

JoVE Journal

Medicine

Teratoma Generation in the Testis Capsule

תפלצת רוחנית דור הקפסולה testis

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

טכניקה של רכש כבד בשר חזירים והשתלות Orthotopic באמצעות פורטו-caval אנט פעיל

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

A Glioblastoma האדם דגם תרבות פרוסה Organotypic לחקר גידול תאים סרטניים ואפקטים ספציפיים לחולה של תרופות אנטי פולשניות

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

דור של Microtumors שימוש 3D אדם Biogel תרבות מערכת תאי Glioblastoma נגזרות חולות להרכבת פרופיל Kinomic ובדיקת תגובה לתרופה

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

דור של איברים ממוזגים מדיה ויישומים עבור לימוד השפעות איבר ספציפי על התנהגות סרטן שד גרורתי

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

דור שערה ותרופות repurposing שימוש &quot;RE: סמים בסדר&quot; מערכת

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

איזון שרירים: בדיקות והדרכה כוח שריר הירך אקסצנטרי פונקציונלי באוכלוסיות אתלטי

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...