Name: generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

이 작품은 NIH / NICHD HD091068-01 박사 에 의해 지원되었다 박사 Ina 도브린스키.

참고 : 1 주 된 돼지의 고환은 상업용 돼지의 거세에서 부산물로 상업용 돼지 농장에서 얻은 것입니다. 고환의 소싱은 캘거리 대학의 동물 관리 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 조직 소화를 위한 효소 용액의 준비
참고: 두 가지 다른 콜라게나아제 IV 용액(솔루션 A, B) 및 데옥시리보누틱스 I(DNase I) 용액을 포함하는 세 가지 다른 효소 솔루션이 필요합니다....

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+testicular+organoid:+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger.">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li><li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis.">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li><li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system.">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li><li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties.">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li><li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates.">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li><li>Gonz&#225;lez, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Mouse+Monopoly:+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models.">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes.">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li><li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development.">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li></ol>

우리는 생체 내 고환과 유사한 조직 구조를 가진 많은 수의 고환 오르가노이드의 일관되고 반복 가능한 생성을 허용하는 간단한 방법을 확립했습니다12. 접근법은 돼지 고환 세포를 사용하여 개발되었지만, 마우스, 비인간 영장류 및 인간고환(12)에도보다 광범위하게 적용가능하다. 고환 오르가노이드8,9,10,<su...

최근에는 3차원(3D) 오르가노이드에 대한 관심이 다시 부호 높아지고 있습니다. 장1,위2,췌장3,4,간5,뇌6 과 같은 다른 장기는 성공적으로 3D 오르가노이드 시스템으로 파생되었습니다. 이들 오르가노이드는 생체내 장기에 대한 건축적 및 기능적 유사성을 가지며 단층 배양 시스템7보다조직 미세환경연구에 생물학적으로 더 관련성이 있다. 그 결과, 고환 오르가노이드는8,9,10,11,12뿐만아니라 관심을 얻기 시작했다. 지금까지 보고된 방법의 대부분은 복잡하고, 비높은처리량(10)이며 ECM 단백질8,10의첨가가 필요하다. 이러한 복잡성은 재현성 문제도 발생합니다. 간단하고 재현 가능한 방법은 생체 내에서 고환과 같은 세포 협회와 고환 오르가노이드의 생성을 허용하는 것이 필요하다.
우리는 최근에 이러한 요구 사항을 해결하는 시스템을보고했다12. 돼지를 모델로 사용하여 마이크로웰 시스템에서 원심 강제 응집 방식을 사용했습니다. 마이크로웰 시스템에서, 각 웰은 동일한 작은마이크로웰(13)을다수 함유한다. 이것은 균일 한 크기의 수많은 스페로이드의 생성을 허용한다. 마이크로웰 시스템은 고환 별 아키텍처를 갖춘 많은 수의 균일한 오르가노이드를 생성할 수 있었습니다. 이 시스템은 간단하며 ECM 단백질을 첨가할 필요가 없습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm ultra low attachment tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#CLS3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrwell 400</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#34411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5138</td>
			<td>referred as Collagenase IV S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV Worthington</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>#LS004189</td>
			<td>referred as Collagenase IV W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 70 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 40 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine testicular tissue</td>
			<td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture

오르가노이드는 생체 내에서 장기의 조직 구조 와 기능을 재량화 할 수있는 여러 세포 유형으로 구성된 3 차원 구조입니다. 오르가노이드의 형성은 기본 및 번역 연구의 다른 길을 열었습니다. 최근 몇 년 동안, 고환 오르가노이드는 남성 생식 생물학 분야에 대한 관심을 얻고있다. 고환 오르가노이드는 세포-세포 상호 작용, 조직 발달 및 세균 세포 틈새 미세 환경의 연구를 허용하고 높은 처리량 약물 및 독성 스크리닝을 용이하게 합니다. 고환 특정 조직 아키텍처를 가진 고환 오르가노이드를 믿을 수 있고 재현가능하게 생성하는 방법이 필요합니다. 마이크로웰 배양 시스템은 피라미드 모양의 마이크로웰의 조밀한 배열을 포함합니다. 전 사춘기 고환에서 파생된 고환 세포는 이 마이크로웰로 원심분리되고 고환 특정 조직 건축 및 세포 협회를 가진 고환 오르가노이드를 생성하기 위하여 배양됩니다. 이 과정을 통해 수천 개의 균일 한 오르가노이드를 생성 할 수 있습니다. 여기에보고된 프로토콜은 남성 생식을 연구하는 연구자들에게 광범위한 관심사가 될 것입니다.

마이크로웰에서 배양된 1주된 돼지 고환으로부터 분리된 세포는 스페로이드(그림1A,그림 2)로자체 조직되었으며, 묘사되고 뚜렷한 외관(seminiferous 상피) 및 내부 구획( (그림1B,그림 2). 두 구획을 콜라겐IV+ve 지하 막에 의해 분리하였다. UCH-L1+ve...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

여기서, 우리는 시판되는 마이크로웰 배양 시스템을 사용하여 고환 특이적 조직 구조를 가진 돼지 고환 오르가노이드의 재현 가능한 생성을 위한 프로토콜을 제시한다.

마이크로웰 배양을 이용한 고환 특이적 구조를 이용한 돼지 고환 오르가노이드 생성

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

이 프로토콜은 고환 성구 의 생성을 허용하기 때문에 중요합니다, 고환 형태 발생을 연구하고 높은 트로피약물 및 독성 검진을 위한 플랫폼으로 사용될 수 있다. 이 기술의 주요 장점은 매우 재현 가능하며 상대적으로 적은 수의 세포가 필요하며 고환 특정 아키텍처를 사용하여 많은 수의 고환 오르가노이드를 생성하는 데 사용할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 필요한 최적화를 가진 다능성 줄기 세포 또는 췌장 적각 세포와 같은 다른 시스템을 연구하기 위하여 적용될 수 있습니다.고환 조직 효소 소화 절차를 시연하는 것은 안나 보이트, 내 실험실에서 박사 과정 학생이 될 것입니다. 멸균 비커로 고환을 수집하고 1 %페니실린 연쇄 절제술을 포함하는 PBS로 세척하십시오. 세척 후 1%페니실린 연쇄상 구균을 함유한 PBS를 함유한 100mm 조직 배양 접시로 고환을 옮김하였다.오토클레이브 가위와 집게를 사용하여 튜니카 질과 부피티미스를 제거하십시오. 분리된 고환을 새로운 100mm 접시로 옮기고 1%페니실린 연쇄상구균을 함유한 PBS로 철저히 세척합니다. 튜니카 바로 아래 세로 축을 따라 고환을 잘라냅니다.그런 다음 두 개의 집게를 사용하여 튜니카에서 고환을 껍질을 벗기고 1 %페니실린 연쇄 절제술과 DMEM의 1 밀리리터를 포함하는 새로운 100 밀리미터 접시에 넣습니다. 껍질을 벗긴 고환을 멸균 가위로 1~2밀리미터 티슈 조각으로 다진다. 잘라낸 후 멸균 집게를 사용하여 결합 조직의 흰색 조각을 제거하십시오.다진 조직 조각을 50 밀리리터 튜브에 용액 A로 옮기고 DMEM을 사용하여 최대 50밀리리터까지 올라가 콜라게나아제 4S의 밀리리터당 0.4 밀리그램의 농도와 콜라게나아제 4W의 밀리리터당 0.8밀리그램의 농도를 얻을 수 있습니다. 조직 조각이 들어 있는 튜브를 섭씨 37도의 수조에 30분간 놓습니다. 5분마다 튜브를 부드럽게 반전시다.30분 후, 튜브를 90회 G로 원심분리하고 1.5분 동안 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 슈퍼네티드, 광고 40 밀리리터의 솔루션 B를 폐기하고, DMEM을 사용하여 최대 50밀리리터를 얹어 콜라게나아제 4W의 밀리리터당 1.2밀리그램의 농도를 얻습니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 30분 동안 튜브를 부드럽게 반전시면 5분마다 튜브를 부드럽게 반전시다.1.5 분 동안 섭씨 25도에서 휴식과 90 시간 G에서 튜브원심분리. 그 후 상체를 버리고, 1 %페니실린 연쇄 절제술로 PBS로 한 번 세척하십시오. 조심스럽게 상단에서 튜블러를 수집하고 새로운 50 밀리리터 튜브에 배치합니다.최대 50 밀리리터의 PBS로 튜브를 위로 합니다. 90회 G의 튜블러를 원심분리하고 섭씨 25도에서 1.5분간 휴식을 취합니다. 상체를 버리고 신선한 PBS를 추가하여 두 번 더 씻습니다.마지막 PBS 세척 후 슈퍼 나탄을 제거하고 PBS의 다섯 밀리리터에서 반열구 관을 다시 중단합니다. 그런 다음 튜블러에 0.25 %의 트립신 EDTA의 15 밀리리터를 추가합니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 놓고 2분마다 부드럽게 반전합니다.5 분 후 조직 배양 판에 샘플의 10 마이크로 리터와 현미경의 밑에 단 하나 세포에 관의 효소 소화를 평가합니다. 매 2 분마다 관찰 현미경 의 밑에 견본을 놓습니다. 대부분 단일 세포가 검출될 수 있다면 FBS의 5밀리리터를 가진 반응을 중지하고 70 미크론 메쉬를 통해 필터한 다음 40 미크론 메쉬를 통해 서식한다.단일 세포를 500배 G로 원심분리하고 5분 동안 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 농축 배지의 50 밀리리터에서 다시 중단하고 혈종계를 사용하여 실행 가능한 세포의 수를 계산합니다. 이 시작 세포 인구의 2,000만 마리를 각각 2개의 초저 부착 100mm 페트리 접시로 옮기고 2일 동안 37도, 5%의 이산화탄소와 21%의 산소를 조직 배양 인큐베이터로 배양한다.100밀리미터 조직 배양 접시당 나머지 시작 세포 집단의 20~2,500만 개의 세포는 농축 배지의 총 부피8밀리리터이다. 접시를 인큐베이터에 넣고 1.5 시간 후에 대부분의 세르톨리 세포가 접시에 부착되도록하십시오. 두 개의 플레이트를 약간 기울여 수퍼네티를 하나의 새로운 100mm 플레이트에 모아 서식하여 인큐베이터에 다시 넣습니다.한 시간 후, 다시 새로운 100 밀리미터 플레이트에 두 개의 플레이트의 슈퍼 네이너티드를 결합합니다. 플레이트를 하룻밤 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 그런 다음 농축 된 세균 세포를 두 분획, 비 부착 분수 및 약간 부착 된 분획으로 수집합니다.상신을 부착되지 않은 분수로 수집합니다. 약간 부착 된 분수의 경우 PBS로 접시를 부드럽게 씻고 실온에서 5 분 동안 0.25 %의 1 ~ 20 희석2 밀리리터로 치료하십시오. 농축 배지의 2밀리리터를 첨가하여 반응을 멈추고 비 부착 분획 튜브에서 수집합니다.25% 세균 세포를 포함하는 작업 세포 준비를 얻기 위하여 튜브에 있는 시작 세포 준비 및 농축한 세균 세포를 결합합니다. 500회 G의 원심분리기와 5분간 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 상체를 버리고 20 밀리리터의 오르가노이드 형성 배지에서 세포를 다시 중단하여 밀리리터 당 240만 개의 세포 농도에 도달한다.새로운 튜브에서 세포를 포함하는 용액의 1 밀리리터를 추가합니다. 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에 계면 활성제 헹구는 용액0.5 밀리리터를 추가합니다. 기포가 우물에 갇혀 있지 않도록 하십시오.기포 원심분리기를 2, 000회 G로 제거하고 2분간 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 낮은 배율 반전 현미경하에서 플레이트를 관찰하여 마이크로 우물에서 거품이 제거되었는지 확인합니다. 뚜껑으로 접시를 덮고 실온에서 30 분 동안 배양하십시오.처리가 완료되면 헹구는 용액을 제거하고 즉시 멸균물 또는 PBS로 접시를 세척하십시오. 각 우물에 0.5 밀리리터의 오르가노이드 형성 매체를 추가하고 25도에서 휴식과 2 5°C의 휴식과 원심분리기를 2분 동안 섭씨 25도에 추가하여 갇힌 기포를 제거합니다. 낮은 배율 반전 현미경하에서 우물을 관찰하여 기포가 제거되었는지 확인합니다.작업 셀 서스펜션의 0.5 밀리리터를 추가하고 위아래로 파이프팅하여 부드럽게 섞습니다. 500회 G의 원심분리기와 5분간 섭씨 25도에서 휴식을 취합니다. 반전된 현미경을 사용하여 세포가 마이크로 웰 내에 클러스터되었는지 확인합니다.5 일 동안 세포 배양 배양 및 배양으로 플레이트를 전송합니다. 격일로 매체의 절반을 변경합니다. 오르가노이드를 복구하려면 와이드 입 파이펫을 사용하여 중간 크기의 위아래로 부드럽게 피펫을 피펫합니다.이를 통해 오간노이드가 마이크로 우물에서 나올 수 있습니다. 오르가노이드를 수집, 수정 및 세균 세포 마커에 대한 면역 세포 화학을 수행, 세르톨리 세포 마커, peritubular myoid 세포 마커 및 Leydig 세포 마커와 공초점 현미경에서 시각화. 이 연구에서는 마이크로 웰에서 배양 된 1 주일 된 돼지 고환에서 분리 된 세포를 묘사하고 뚜렷한 외부 및 내부 구획으로 스페로이드로 자체 구성했습니다.두 구획은 콜라겐 IV 양성 지하 막에 의해 분리되었다. GATA4 양성 세르톨리 세포와 UCHL1 양성 세균 세포는 지하 막의 외부 구획에 있었다. aSMA 양성 페리 관 마이드 세포는 지하 막의 내부를 따라 국소화되었고 CYP450 양성 Leydig 세포는 간질의 중심에 있었다.이 구조는 Leydig 세포, peri 관 마이드 세포가 중간 체획 및 세균 세포에서 중간 질에 위치한 시투 조건과 유사하며, 세르톨리 세포는 반열성 상피에 위치합니다. 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 세포가 최적의 품질을 가지고 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 효소 소화의 트립시화 단계에서주의해야 한다.이 절차에 따라 오르가노이드는 생식 세포 분화를 연구하거나 유전자 발현 및 분비 된 단백질 또는 호르몬을 분석하기 위해 장기적으로 배양 될 수 있습니다. 고환 특이적 세포 협회를 가진 오르가노이드를 만드는 기능은 고환 발달 및 생식 세포 기능에 중요한 세포 세포 상호 작용을 연구하기 위하여 새로운 체외 계통을 제공합니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Testis 캡슐의 Teratoma 생성

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

연구

의학

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

활성 포르토 대정맥 션트를 사용하여 돼지 간 조달 및 동소 이식 이식의 기술

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

종양 특이 내피 세포의 분리 및 문화 확장

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Kinomic 프로파일 의약품 응답 테스트를위한 3D 인간의를 Biogel 문화 시스템을 사용 Microtumors 및 환자 유래 아교 모세포종 세포의 생성

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

유방암 전이성 행동에 장기 별 영향 유학을위한 장기 에어컨 미디어 및 응용 프로그램의 생성

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

인간 간 줄기 세포를 이용한 인간형 마우스 간 세대

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

은 &quot;RE를 : 좋은 약&quot;을 사용하여 의약품 용도 변경 가설 발전 시스템

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

근육의 불균형: 테스트 및 기능 편심 햄 스트링 운동 인구 강도 훈련

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...