Name: generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture
Uploaded: 2019-10-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

Bu çalışma NIH/NICHD HD091068-01 tarafından Dr. Ina Dobrinski tarafından desteklenmiştir.

NOT: 1 haftalık domuz yavrularından alınan testisler, ticari domuzların hadım edilmesinden elde edilen yan ürün olarak ticari bir domuz çiftliğinden elde edilebildi. Testislerin kaynak Calgary Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylandı.
1. Doku sindirimi için enzim çözeltilerinin hazırlanması
NOT: İki farklı kollajenaz IV çözeltisi (A, B çözeltisi) ve deoksiribonükle I (DNase I) çözeltisi içeren üç farklı enzimatik çözüm ...

<ol>
	<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5/R-spondin+axis.">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> Embo Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).</li><li>Boj, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoid+models+of+human+and+mouse+ductal+pancreatic+cancer.">Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer.</a> Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).</li><li>Takebe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascularized+and+functional+human+liver+from+an+iPSC-derived+organ+bud+transplant.">Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant.</a> Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).</li><li>Quadrato, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+diversity+and+network+dynamics+in+photosensitive+human+brain+organoids.">Cell diversity and network dynamics in photosensitive human brain organoids.</a> Nature. 545 (7652), 48-53 (2017).</li><li>Abbott, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+culture:+biology's+new+dimension.">Cell culture: biology's new dimension.</a> Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).</li><li>Pendergraft, S. S., Sadri-Ardekani, H., Atala, A., Bishop, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+testicular+organoid:+a+novel+tool+for+the+study+of+human+spermatogenesis+and+gonadotoxicity+in+vitrodagger.">Three-dimensional testicular organoid: a novel tool for the study of human spermatogenesis and gonadotoxicity in vitrodagger.</a> Biology of Reproduction. 96 (3), 720-732 (2017).</li><li>Strange, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+testicular+organoid+system+as+a+novel+tool+to+study+Zika+virus+pathogenesis.">Human testicular organoid system as a novel tool to study Zika virus pathogenesis.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 7 (1), 82-82 (2018).</li><li>Alves-Lopes, J. P., Soder, O., Stukenborg, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testicular+organoid+generation+by+a+novel+in+vitro+three-layer+gradient+system.">Testicular organoid generation by a novel in vitro three-layer gradient system.</a> Biomaterials. 130, 76-89 (2017).</li><li>Baert, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Human+Testicular+Cells+Self-Organize+into+Organoids+with+Testicular+Properties.">Primary Human Testicular Cells Self-Organize into Organoids with Testicular Properties.</a> Stem Cell Reports. 8 (1), 30-38 (2017).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. , (2019).</li><li>Razian, G., Yu, Y., Ungrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+Large+Numbers+of+Size-controlled+Tumor+Spheroids+Using+Microwell+Plates.">Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), 50665 (2013).</li><li>Sakib, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+organotypic+testicular+organoids+in+microwell+culture.">Formation of organotypic testicular organoids in microwell culture.</a> Biology of Reproduction. 100 (6), 1648-1660 (2019).</li><li>Gonz&#225;lez, R., Dobrinski, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+the+Mouse+Monopoly:+Studying+the+Male+Germ+Line+in+Domestic+Animal+Models.">Beyond the Mouse Monopoly: Studying the Male Germ Line in Domestic Animal Models.</a> ILAR Journal. 56 (1), 83-98 (2015).</li><li>Oatley, J. M., Brinster, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+germline+stem+cell+niche+unit+in+mammalian+testes.">The germline stem cell niche unit in mammalian testes.</a> Physiological Reviews. 92 (2), 577-595 (2012).</li><li>Chen, L. Y., Willis, W. D., Eddy, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Gdnf+Gene+in+peritubular+myoid+cells+disrupts+undifferentiated+spermatogonial+cell+development.">Targeting the Gdnf Gene in peritubular myoid cells disrupts undifferentiated spermatogonial cell development.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 113 (7), 1829-1834 (2016).</li></ol>

Biz in vivo12testis benzer doku mimarisi ile testis organoidlerin çok sayıda tutarlı, tekrarlanabilir nesil sağlayan basit bir yöntem kurduk. Yaklaşım domuz testis hücreleri kullanılarak geliştirilmiş olsa da, daha geniş fare, insan olmayan primat ve insan testis12için de geçerlidir. Testis organoidleri 8 ,9,10,11 üretmek için farklı yöntemler<sup class...

Son yıllarda, üç boyutlu (3D) organoidler ilgi bir canlanma olmuştur. Bağırsak gibi farklı organlar1, mide2, pankreas3,4, karaciğer5, ve beyin6 başarıyla 3D organoid sistemlere türetilmiştir. Bu organoidler in vivo organlara mimari ve fonksiyonel benzerlikler var ve daha biyolojik olarak monolayer kültürsistemleri7 daha doku mikroçevre çalışması için ilgilidir. Sonuç olarak, testis organoidler de ilgi toplamaya başlamıştır8,9,10,11,12. Şimdiye kadar bildirilen yöntemlerin çoğunluğu karmaşık, non-yüksek iş10 ve ECM proteinleri8,10eklenmesini gerektirir. Bu karmaşıklık aynı zamanda tekrarlanabilirlik ile ilgili sorunlara yol açar. Testis in vivo gibi hücre çağrışımları olan testis organoidlerinin oluşumuna olanak tanıyan basit ve tekrarlanabilir bir yöntem gereklidir.
Biz son zamanlarda bu gereksinimleri12adresine bir sistem bildirdiniz. Domuzu model olarak kullanarak microwell sisteminde santrifüj zorunlu toplama yaklaşımını kullandık. Microwell sisteminde, her kuyu aynı küçük microwells13çok sayıda içerir. Bu üniforma boyutu çok sayıda küresel nesil sağlar. Microwell sistemi, testislere özgü bir mimariye sahip çok sayıda tek tip organoidin üretilebini sağladı. Sistem basittir ve ECM proteinlerinin eklenmesini gerektirmez.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm ultra low attachment tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#CLS3262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm tissue culture dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>#353803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aggrwell 400</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#34411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Adherence Rinsing Solution</td>
			<td>Stemcell Technologies</td>
			<td>#07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV from Clostridium histolyticum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#C5138</td>
			<td>referred as Collagenase IV S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase type IV Worthington</td>
			<td>Worthington-Biochem</td>
			<td>#LS004189</td>
			<td>referred as Collagenase IV W</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium - high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epidermal Growth Factor</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>#236-EG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 70 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon Cell Strainers 40 &#181;m</td>
			<td>FisherScientific</td>
			<td>#352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>#12483-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>#41400-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>#P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Porcine testicular tissue</td>
			<td>Sunterra Farms Ltd (Alberta, Canada)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>#SCGP00525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>#T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture

Organoidler, doku mimarisini ve organların işlevlerini in vivo olarak özetleyebilen birden fazla hücre tipinden oluşan üç boyutlu yapılardır. Organoidlerin oluşumu temel ve çevirisel araştırmaların farklı yollarını açmıştır. Son yıllarda, testis organoidler erkek üreme biyolojisi alanında ilgi topladı. Testis organoidleri hücre-hücre etkileşimleri, doku gelişimi ve germ hücre niş mikroortamda çalışma için izin ve yüksek iş yapımı ilaç ve toksisite tarama kolaylaştırmak. Testis spesifik doku mimarisine sahip testis organoidlerinin güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde üretilmesi için bir yöntem gereklidir. Microwell kültür sistemi piramit şeklinde mikrowelller yoğun bir dizi içerir. Ergenlik öncesi testislerden elde edilen testis hücreleri bu mikrowelllere santrifüj edilir ve testis-spesifik doku mimarisi ve hücre çağrışımları ile testis organı oluşturmak için kültürlenir. Bu süreç le binlerce homojen organoid üretilebilir. Burada bildirilen protokol, erkek üremesi üzerinde araştırma yapmak ta bir araştırmacının ilgisini çekebilir.

Mikrowelllerde kendi kendine organize edilen 1 haftalık domuz testlerinden izole hücreler(Şekil 1A, Şekil 2), belirgin dış (seminifer epitel) ve iç bölmeler ( interstitium) (Şekil 1B, Şekil 2). İki bölme kollajen IV+ve bazmembran ile ayrılmıştır. UCH-L1+ve mikrop hücreleri ve GATA4+ve Ser...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture at JoVE.com

Generation of Porcine Testicular Organoids with Testis Specific Architecture using Microwell Culture

Burada, ticari olarak mevcut mikrokuyu kültür sistemini kullanarak testis spesifik doku mimarisi ile domuz testis organoidlerinin tekrarlanabilir üretimi için bir protokol sıyoruz.

Microwell Kültürü kullanılarak Testis'e Özgü Mimariye Sahip Domuz Testis Organoidlerinin Üretimi

Organoids are three dimensional structures composed of multiple cell types that are capable of recapitulating tissue architecture and functions of organs ...

Bu protokol, testis morfogenezinin incelenmesi nde ve yüksek tropo ilaç ve toksisite taramalarında kullanılabilen testis organoidlerinin nesline izin verdiği için önemlidir. Bu tekniğin en büyük avantajı, son derece tekrarlanabilir olması, nispeten düşük sayıda hücre gerektirmesi ve testis-spesifik mimariye sahip çok sayıda testis organoidi oluşturmak için kullanılabilmesidir. Bu yöntem pluripotent kök hücreler veya gerekli optimizasyonlar ile pankreas adacık hücreleri gibi diğer sistemleri, çalışma için uygulanabilir.Testis dokusu enzimatik sindirim prosedürünü gösteren Anna Voigt, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak. Steril bir kabın içine testis toplamak ve% 1 penisilin streptomisin içeren PBS ile yıkayın. Yıkadıktan sonra testis% 1 penisilin streptomisin içeren PBS ile 100 milimetrelik doku kültür çanak aktarır.Tunica vaginalis ve epididim kaldırmak için otoklav makas ve forseps kullanın. İzole testisi yeni bir 100 milimetrelik tabağa aktarın ve %1 penisilin streptomisin içeren PBS ile iyice yıkayın. Doğrudan tunica altında uzunlamasına eksen boyunca testis kesin.Daha sonra iki forseps kullanarak tunica testis soyma ve 1% penisilin streptomisin ile DMEM 1 mililitre içeren yeni bir 100 milimetre lik çanak içine yerleştirin. Bir ila iki milimetrelik doku parçaları halinde steril makas ile soyulmuş testis kıyma. Doğrama sonra bağ dokusunun beyaz parçaları kaldırmak için steril forceps kullanın.50 mililitrelik bir tüpiçinde a çözeltisine kıyma doku parçalarını aktarın ve colagenaz 4S için mililitre başına 0,4 miligram ve colagenase 4W için mililitre başına 0,8 miligram konsantrasyon elde etmek için DMEM ile 50 mililitreye kadar yerleştirin. Doku parçalarını içeren tüpü 30 dakika boyunca 37 derece su banyosuna yerleştirin. Tüpü her beş dakikada bir yavaşça ters çevirin.30 dakika sonra tüpü 90 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede 1,5 dakika ara verin. Supernatant atın, ad 40 çözelti B mililitre, ve colagenase 4W mililitre başına 1,2 miligram konsantrasyon elde etmek için DMEM ile 50 mililitre kadar top. Tüpü 30 dakika boyunca 37 derece lik bir su banyosuna yerleştirin ve tüpü her beş dakikada bir hafifçe ters çevirin.Tüpü 90 kez G'de 25 santigrat derecede 1,5 dakika ara verin. Bundan sonra supernatant atın ve% 1 penisilin streptomisin ile PBS ile bir kez yıkayın. Dikkatle üst ve yerden yeni bir 50 mililitretüp içine tübülleri toplamak.50 mililitreye kadar PBS ile tüpü toplayın. 1,5 dakika boyunca 25 santigrat derece molaları ile 90 kez G boruları santrifüj. Supernatant atın ve iki ek kez yıkamak için taze PBS ekleyin.Son PBS yıkama dan sonra supernatant kaldırmak ve pbs beş mililitre seminiferous tübülleri yeniden askıya. Daha sonra, tübüllere %0,25 Tripsin EDTA 15 mililitre ekleyin. Tüpü 37 derece lik bir su banyosuna yerleştirin ve her iki dakikada bir hafifçe ters çevirin.Beş dakika sonra bir doku kültürü plaka üzerinde örnek 10 mikrolitre ile mikroskop altında tek hücrelere tübüllerin enzimatik sindirim değerlendirmek. Her iki dakikada bir gözlemlemek için örneği mikroskop altına yerleştirin. Çoğunlukla tek hücreler tespit edilebilirse, reaksiyonu beş mililitre FBS ile durdurun ve 70 mikronluk bir kafesten ve ardından 40 mikronluk bir ağdan filtreleyin.Tek hücreleri 500 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede beş dakika ara verin. 50 mililitre zenginleştirme ortamında yeniden askıya alın ve hemositometre kullanarak canlı hücre sayısını sayın. Bu başlangıç hücre nüfusunun 20 milyonunun iki ultra düşük eki 100 milimetre Petri kabının her birine aktarılması ve iki gün boyunca %5'i karbondioksit ve %21 oksijen le 37 santigrat derecelik bir doku kültürü kuluçka makinesine inkübatın.Cede 20-25 milyon hücre kalan başlangıç hücre nüfusunun 100 milimetre doku kültürü çanak başına zenginleştirme orta toplam hacmi. Bir kuvöz içine çanak yerleştirin ve 1,5 saat sonra Sertoli hücrelerinin çoğunluğu plaka bağlı olduğundan emin olun. Süpernatants'ı toplamak ve birleştirmek için iki plakayı hafifçe yatırın ve 100 milimetrelik yeni bir plakaya yerleştirin ve kuvöze geri yerleştirin.Bir saat sonra, yine yeni bir 100 milimetreplaka için iki plaka supernatants birleştirir. Tabakları bir gecede kuvöze geri yerleştirin. Sonra iki fraksiyonu, non-yapışık fraksiyonu ve biraz yapışık fraksiyonu zenginleştirilmiş mikrop hücreleri toplamak.Non-adherent fraksiyonu olarak supernatant toplamak. Hafif yapışkan fraksiyonu için pbs ile yavaşça plakaları yıkayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 0,25% Trypsin EDTA 0,25% seyreltme bir iki mililitre ile tedavi. Zenginleştirme orta iki mililitre ekleyerek reaksiyonu durdurun ve non-adherent fraksiyonu tüp toplamak.Başlangıç hücre preparatını ve zenginleştirilmiş mikrop hücrelerini bir tüpte birleştirerek %25'lik mikrop hücresi içeren bir çalışma hücresi preparatını elde edin. 500 kez G'de santrifüj ve 25 santigrat derecede beş dakika mola verin. Supernatant atın ve mililitre başına 2.4 milyon hücre konsantrasyonuna ulaşmak için organoid oluşumu orta 20 mililitre hücreleri yeniden askıya.Yeni bir tüp hücre içeren çözeltinin bir mililitre ekleyin. Mikro kuyu plakasındaki her kuyuya 0,5 mililitre yüzey aktif madde durulama çözeltisi ekleyin. Hiçbir hava kabarcıkları kuyuda sıkışıp olduğundan emin olun.Hava kabarcıklarını çıkarmak için plakayı 2,000 kez G'de santrifüj edin ve 25 santigrat derecede iki dakika ara verin. Kabarcıkların mikro kuyulardan çıkarıldığını doğrulamak için düşük büyütmeli ters mikroskop altında plakayı gözlemleyin. Tabağı kapaklı olarak kapatın ve oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.Tedavi tamamlandıktan sonra durulama çözeltisini çıkarın ve hemen tabağı steril su veya PBS ile yıkayın. Her kuyuya 0,5 mililitre organoid formasyon ortası ekleyin ve 2,000 kez G'de 25 santigrat derecede iki dakika mola lar ile kapana kısılmış hava kabarcıklarını temizleyin. Hava kabarcıkları kaldırılmış olduğunu doğrulamak için düşük büyütme ters mikroskop altında kuyu gözlemleyin.Çalışma hücresi süspansiyon0,5 mililitre ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tarafından karıştırın. 500 kez G'de santrifüj ve 25 santigrat derecede beş dakika mola verin. Hücrelerin mikro kuyularda kümelendiğini doğrulamak için ters bir mikroskop kullanın.Plakayı beş gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine ve kültüre aktarın. Her gün ortamın yarısını değiştirin. Organoidler kurtarmak için yavaşça orta yukarı ve aşağı pipet için geniş ağızlı pipet kullanın.Bu organoidler mikro kuyular çıkmak için izin verir. Organoidleri toplayın, germ hücre belirteci, Sertoli hücre belirteci, peritübüler miyoid hücre belirteci ve Leydig hücre belirteci için immün omünokimyayı düzeltin ve gerçekleştirin ve konfokal mikroskop altında görselleştirin. Bu çalışmada, mikro kuyularda kendi kendine düzenlenmiş ve farklı dış ve iç bölmeleri ile küresel olarak organize edilen bir haftalık domuz testislerinden izole edilmiş hücreler.İki bölme kollajen IV pozitif bazal membran ile ayrılmıştır. GATA4 pozitif Sertoli hücreleri ve UCHL1 pozitif mikrop hücreleri bodrum zarının dış bölmesinde ydi. aSMA pozitif peri-tübüler miyoid hücreler bodrum zarının iç boyunca lokalize edildi cyp450 pozitif Leydig hücreleri interstitium merkezinde idi.Bu yapı, Leydig hücrelerinin, peri-tübüler miyoid hücrelerinin interstisyumda, interstisyel bölmede ve mikrop hücrelerinde yer aldığı Situ koşullarına benzer, Sertoli hücreleri seminiferous epitelde bulunur. Organoid ler üretmek için kullanılan hücrelerin optimum kaliteye sahip olmasını sağlamak önemlidir. Enzimatik sindirimin tripsinizasyon aşamasında dikkatli olunmalıdır.Bu prosedürü takiben organoidler germ-hücre farklılaşmasını incelemek veya gen ekspresyonu ve salgılanan protein ler veya hormonlar için analiz etmek için uzun vadeli kültürlenebilir. Testis-spesifik hücre çağrışımları ile organoidler oluşturma yeteneği testis gelişimi ve germ hücre fonksiyonu için önemli hücre-hücre etkileşimleri çalışma için yeni bir in-vitro sistem sağlar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Testis Kapsül içinde teratom Üretimi

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Technique of Porcine Liver Procurement and Orthotopic Transplantation using an Active Porto-Caval Shunt

Active Porto-Caval Shunt kullanarak Domuz Karaciğer Tedarik ve Ortotopik Nakli Tekniği

The success of liver transplantation has resulted in a dramatic organ shortage. Each year, a considerable number of patients on the liver transplantation ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

Tümör spesifik Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü Genişleme

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

A Human Glioblastoma Organotypic Slice Culture Model for Study of Tumor Cell Migration and Patient-specific Effects of Anti-Invasive Drugs

Tümör Hücre Göçü ve İnvaziv Olmayan İlaçların Hastaya Özel Etkilerinin İncelenmesi İçin Bir İnsan Glioblastoma Organotipik Dilim Kültürü Modeli

Glioblastoma (GBM) continues to carry an extremely poor clinical prognosis despite surgical, chemotherapeutic, and radiation therapy. Progressive tumor ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Generation of Organ-conditioned Media and Applications for Studying Organ-specific Influences on Breast Cancer Metastatic Behavior

Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi

Breast cancer preferentially metastasizes to the lymph node, bone, lung, brain and liver in breast cancer patients. Previous research efforts have focused ...

Generation of a Humanized Mouse Liver Using Human Hepatic Stem Cells

İnsan Karaciğer Kök Hücreler kullanma Insanlaşmış Fare Karaciğer Üretimi

A novel animal model involving chimeric mice with humanized livers established via human hepatocyte transplantation has been developed. These mice, in ...

Drug Repurposing Hypothesis Generation Using the "RE:fine Drugs" System

&quot;RE: İnce ilaçlar kullanılması&quot; İlaç repurposing Hipotez Üretim Sistemi

The promise of drug repurposing is that existing drugs may be used for new disease indications in order to curb the high costs and time for approval. The ...

Muscle Imbalances: Testing and Training Functional Eccentric Hamstring Strength in Athletic Populations

Kas dengesizlikleri: Test ve fonksiyonel eksantrik Hamstring gücü atletik nüfus eğitim

Many hamstring injuries that occur during physical activity occur while the muscles are lengthening, during eccentric hamstring muscle actions. Opposite ...