Name: in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system
Uploaded: 2020-01-09T12:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

אנו מבקשים להודות לד ר דניאל גידלר על שסיפק לנו את הפלביניים של הדלתא 5. עבודה זו ממומנת ע י הקרן הישראלית למדע, 700/16) (ME), הקרן הלאומית למדעי המדינה-ישראל (BSF, 2017323) (לי ו-MS), האגודה הישראלית לסרטן (ICA, 20170024) (לי), הקרן הישראלית לחקר הסרטן (ICRF, 17-1693-RCDA) (ME), והקרן הדאגה (#7895) (לי). מלגת מלגות: מלגת אלון בשבילי ובאוניברסיטת בן גוריון במלגות ל-SJ ו-MP.

מחקר זה אושר על ידי אוניברסיטת בן גוריון במועצה לטיפול בבעלי חיים בנגב ושימוש. ניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי IACUC (IL. 80-12-2015 ו-IL. 29-05-2018 (E)). כל ההיבטים של בדיקות בעלי חיים, דיור, ותנאים סביבתיים המשמשים במחקר זה היו בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה13.
1. אדנו-הפק?...

<ol>
	<li>Reyes-Gibby, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+association+study+identifies+genes+associated+with+neuropathy+in+patients+with+head+and+neck+cancer.">Genome-wide association study identifies genes associated with neuropathy in patients with head and neck cancer.</a> Scientific Reports. 8 (1), 8789 (2018).</li><li>Riaz, N., Morris, L. G., Lee, W., Chan, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+the+molecular+genetics+of+head+and+neck+cancer+through+genome-wide+approaches.">Unraveling the molecular genetics of head and neck cancer through genome-wide approaches.</a> Genes &amp; Diseases. 1 (1), 75 (2014).</li><li>Leemans, C. R., Snijders, P. J. F., Brakenhoff, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+landscape+of+head+and+neck+cancer.">The molecular landscape of head and neck cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 18 (5), 269-282 (2018).</li><li>Jiang, X., Ye, J., Dong, Z., Hu, S., Xiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+genetic+alterations+and+their+impact+on+target+therapy+response+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma.">Novel genetic alterations and their impact on target therapy response in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Cancer Management and Research. 11, 1321-1336 (2019).</li><li>Im, W., Moon, J., Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+CRISPR/Cas9+for+Gene+Editing+in+Hereditary+Movement+Disorders.">Applications of CRISPR/Cas9 for Gene Editing in Hereditary Movement Disorders.</a> Journal of Movement Disorders. 9 (3), 136-143 (2016).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+analysis+of+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma+cell+lines+and+human+tumors:+a+rational+approach+to+preclinical+model+selection.">Genomic analysis of head and neck squamous cell carcinoma cell lines and human tumors: a rational approach to preclinical model selection.</a> Molecular Cancer Research: MCR. 12 (4), 571-582 (2014).</li><li>AACR Project GENIE Consortium, T.A.P.G.. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AACR+Project+GENIE:+Powering+Precision+Medicine+through+an+International+Consortium.">AACR Project GENIE: Powering Precision Medicine through an International Consortium.</a> Cancer Discovery. 7 (8), 818-831 (2017).</li><li>Suh, Y., Amelio, I., Guerrero Urbano, T., Tavassoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+update+on+cancer:+molecular+oncology+of+head+and+neck+cancer.">Clinical update on cancer: molecular oncology of head and neck cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 5 (1), e1018 (2014).</li><li>Anderson, J. A., Irish, J. C., Ngan, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+RAS+oncogene+mutation+in+head+and+neck+carcinomas.">Prevalence of RAS oncogene mutation in head and neck carcinomas.</a> The Journal of Otolaryngology. 21 (5), 321-326 (1992).</li><li>Ryals, R. C., Boye, S. L., Dinculescu, A., Hauswirth, W. W., Boye, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+transduction+efficiencies+of+unmodified+and+tyrosine+capsid+mutant+AAV+vectors+in+vitro+using+two+ocular+cell+lines.">Quantifying transduction efficiencies of unmodified and tyrosine capsid mutant AAV vectors in vitro using two ocular cell lines.</a> Molecular Vision. 17, 1090-1102 (2011).</li><li>Smith-Arica, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+Efficiency+of+Human+and+Mouse+Embryonic+Stem+Cells+Using+Adenoviral+and+Adeno-Associated+Viral+Vectors.">Infection Efficiency of Human and Mouse Embryonic Stem Cells Using Adenoviral and Adeno-Associated Viral Vectors.</a> Cloning and Stem Cells. 5 (1), 51-62 (2003).</li><li>Li, J., Xiao, X., Kenniston, T., Kudlow, J., Giannoukakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV+Vectors.">AAV Vectors.</a> Molecular Therapy. 3 (5), S174-S192 (2001).</li><li>Institute of Laboratory Animal Resources (U.S.). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guide for the care and use of laboratory animals. , (1996).</li><li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling.">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li><li>Zhang, Y., Chirmule, N., Gao, G. P., Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand-dependent+activation+of+cytotoxic+T+lymphocytes+by+adeno-associated+virus+vectors+in+vivo:+role+of+immature+dendritic+cells.">CD40 ligand-dependent activation of cytotoxic T lymphocytes by adeno-associated virus vectors in vivo: role of immature dendritic cells.</a> Journal of Virology. 74 (17), 8003-8010 (2000).</li><li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus.">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> Journal of Virology. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li><li>Auricchio, A., Hildinger, M., O'Connor, E., Gao, G. P., Wilson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Highly+Infectious+and+Pure+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Vectors+with+a+Single-Step+Gravity-Flow+Column.">Isolation of Highly Infectious and Pure Adeno-Associated Virus Type 2 Vectors with a Single-Step Gravity-Flow Column.</a> Human Gene Therapy. 12 (1), 71-76 (2001).</li><li>Lock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+Recombinant+Adeno-Associated+Virus+Type+2+Reference+Standard+Material.">Characterization of a Recombinant Adeno-Associated Virus Type 2 Reference Standard Material.</a> Human Gene Therapy. 21 (10), 1273 (2010).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nature Protocols. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Rabinowitz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-packaging+of+a+single+adeno-associated+virus+(AAV)+type+2+vector+genome+into+multiple+AAV+serotypes+enables+transduction+with+broad+specificity.">Cross-packaging of a single adeno-associated virus (AAV) type 2 vector genome into multiple AAV serotypes enables transduction with broad specificity.</a> Journal of Virology. 76 (2), 791-801 (2002).</li><li>Cheng, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memorial+Sloan+Kettering-Integrated+Mutation+Profiling+of+Actionable+Cancer+Targets+(MSK-IMPACT).">Memorial Sloan Kettering-Integrated Mutation Profiling of Actionable Cancer Targets (MSK-IMPACT).</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (3), 251-264 (2015).</li><li>Sun, H., Taneja, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Transformation+and+Tumorigenicity+Using+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells.">Analysis of Transformation and Tumorigenicity Using Mouse Embryonic Fibroblast Cells.</a> Cancer Genomics and Proteomics. 383, 303-310 (2007).</li><li>Durkin, M., Qian, X., Popescu, N., Lowy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mouse+Embryo+Fibroblasts.">Isolation of Mouse Embryo Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (18), (2013).</li><li>Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblast+Cells+Suitable+for+Culturing+Human+Embryonic+and+Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e3854 (2012).</li><li>Boehm, J. S., Hession, M. T., Bulmer, S. E., Hahn, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Human+and+Murine+Fibroblasts+without+Viral+Oncoproteins.">Transformation of Human and Murine Fibroblasts without Viral Oncoproteins.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (15), 6464 (2005).</li><li>Gupta, T., S&#225;enz Robles, T. M., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+transformation+of+mouse+embryo+fibroblasts+in+the+absence+of+activator+E2Fs.">Cellular transformation of mouse embryo fibroblasts in the absence of activator E2Fs.</a> Journal of Virology. 89 (9), 5124-5133 (2015).</li><li>Leong, H., Blewitt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrovirus+Mediated+Malignant+Transformation+of+Mouse+Embryonic+Fibroblasts.">Retrovirus Mediated Malignant Transformation of Mouse Embryonic Fibroblasts.</a> BIO-PROTOCOL. 3 (15), (2013).</li><li>Parikh, N., Nagarajan, P., Sei-ichi, M., Sinha, S., Garrett-Sinha, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+an+immortalized+oral+keratinocyte+cell+line+of+mouse+origin.">Isolation and characterization of an immortalized oral keratinocyte cell line of mouse origin.</a> Archives of Oral Biology. 53 (11), 1091-1100 (2008).</li><li>Badarni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repression+of+AXL+expression+by+AP-1/JNK+blockage+overcomes+resistance+to+PI3Ka+therapy.">Repression of AXL expression by AP-1/JNK blockage overcomes resistance to PI3Ka therapy.</a> JCI Insight. 5, 125341 (2019).</li><li>Chen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+of+mouse+oral+carcinoma+cell+lines+derived+from+transgenic+mice+and+their+use+as+syngeneic+tumorigenesis+models.">Establishing of mouse oral carcinoma cell lines derived from transgenic mice and their use as syngeneic tumorigenesis models.</a> BMC Cancer. 19 (1), 281 (2019).</li><li>Hoover, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Human+Papillomavirus+16+E6+in+Anchorage-Independent+and+Invasive+Growth+of+Mouse+Tonsil+Epithelium.">The Role of Human Papillomavirus 16 E6 in Anchorage-Independent and Invasive Growth of Mouse Tonsil Epithelium.</a> Archives of Otolaryngology-Head &amp; Neck Surgery. 133 (5), 495 (2007).</li><li>Smahel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+MHC+class+I-negative+mouse+cells+derived+by+transformation+with+human+papillomavirus+type+16.">Metastatic MHC class I-negative mouse cells derived by transformation with human papillomavirus type 16.</a> British Journal of Cancer. 84 (3), 374-380 (2001).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Growth+of+a+Newly+Established+Mouse+Epithelial+Cell+Line+Transformed+with+HPV-16+E7+in+Diabetic+Mice.">Increased Growth of a Newly Established Mouse Epithelial Cell Line Transformed with HPV-16 E7 in Diabetic Mice.</a> PloS One. 11 (10), e0164490 (2016).</li></ol>

מספר שיטות שימשו בעבר כדי לשנות את התאים הראשוניים בתרבות עם דרגות משתנה של הצלחה25,26,27,28. רוב השיטות האלה להשתמש העכבר פיברוההדף תאים עבור שינוי14,17,18,19</...

HNC הוא ממאירות נפוצה ברחבי העולם1. מידול בראשית של HNC neoplasia נמצא כעת נקודת מפנה מדעית2. בעוד מוטציות גנטיות רבות זוהו hnc2,3,4 (למשל, TP53, PIK3CA, NOTCH1, FAT1, ו RAS) שילובים ספציפיים של שינויים גנותיים נדרש בקונצרט כדי לגרום hnc להישאר ברור.
השימוש הנוכחי בקווי התאים האנושיים HNC עזר באופן משמעותי כדי להבהיר את המנגנונים הקשורים בפתוגנזה וטיפול3. עם זאת, המחקר של קווי התאים האנושיים במערכות murine החיסונית יש המגבלות שלה, כי מערכות אלה אינם מטפלים בתהליך vivo נאופלסטי, התפקיד של מוטציות גנים ספציפיים, ותגובות טיפול במיקרו הסביבה החיסונית. מכאן, הפיתוח והקמתה של קווי תא מורטין עם שינויים גנטיים ספציפיים הם בעלי חשיבות עיקרית ללמוד כיצד גנים שונים תורמים לתהליך הטרנספורמציה ולבדוק טיפולים מבוססי מולקולה הרומן עכברים המוסמכת.
לימודי התפקוד הגנטי במחקרים ביו-רפואיים הושפעו באופן משמעותי מהתקדמות בטכנולוגיות לעריכת דנ א, על ידי החדרת הפסקות כפולות (DSBs), לדוגמה5. טכנולוגיות אלה, כולל שימוש בנוקלאוסים של אצבעות אבץ, שעתוק activator-כמו אפקטור נוקלאוסיס, ומקובצים באשכולות במרווחים של הרגולציה הבין-מפרידים (CRISPR/Cas9), מאפשרים מניפולציה של כל גן התעניינות בלוקוס. מערכות crispr האחרונה/Cas9 מורכב מדריך RNA (grna) המכוון את Cas9 נוקלאז כדי ליצור dsb באתר ספציפי בגנום. מערכת זו צברה הכרה נרחבת בשינוי גנים אנדוגני בתוך כל תא או רקמות היעד, אפילו באופן מסורתי קשה לטפל באורגניזמים5. יש לו יתרונות רבים על מערכות אחרות בשל פשטותו, מהירות, ויעילות.
באונקולוגיה, CRISPR/CAS9 הטכנולוגיה מילא את הצורך לחקות ביעילות תאים סרטניים. כדי להקים מערכת זו ב HNC, אנו מניפולציות קראס אואונגן חזק ושני גנים מדכא הגידול חשוב, APC ו p536. על פי מסד הנתונים של ג ' יני7, שילוב זה נדיר ב hnc. מוטציות RAS (HRAS, NRAS, ו קראס) קיימים רק ~ 7% של כל אוכלוסיית HNC. גידולים אלה נוטים להיות עמידים לטיפול8,9.
משלוח של Cas9 ו gRNA שלה מושגת באמצעות התמרה ויראלית באמצעות AAVs או לנטיאוירוסים. רקומביננטי AAV הוא לעתים קרובות את השיטה המועדפת לאספקת גנים כדי למקד את התאים בשל titer גבוה שלה, התגובה החיסונית מתון, היכולת לשנות מגוון רחב של תאים, ובטיחות כוללת. באמצעות מערכת AAV, שונים מסוימים רקמות תא העכבר נוצרו, וקווי תא חדש עדיין מפותחים10,11,12. עם זאת, מערכת יעילה של עריכת גנומית שיכולה ליצור קו התאים של murine HNC הדגמים שרידים להתפתח. במחקר זה, אנו ביקשו לפתח במערכת מבוססת על מבחנה AAV-Cas9 להפיכת תאי הלשון הראשוניים של מורלין למצב הטומורגניים. זה ייחודי CRISPR/Cas9 פרוטוקול הטרנספורמציה ואת קו הגידול הוקם התא ניתן להשתמש כדי להבין טוב יותר את הביולוגיה של HNC הנגרמת על ידי מגוון של שינויים גנומית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti mouse HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-035-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti rabbit HRP</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cas9 Mouse mAb</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>14697</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cre</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>900901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-165-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>111-165-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-9996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>4370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti E cadherin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3195S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-KRT 14</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB-ab181595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; actin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>691001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946; catenin</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9582S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEK93T</td>
			<td>ATCC</td>
			<td><a href="https://www.atcc.org/en/Products/All/CRL-3216.aspx" target="_blank">CRL-3216</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Media, Chemicals and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>30015484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0332-TAM-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI fluoromount</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL (Westar Supernova and Westar Nova 2.0)</td>
			<td>Cyanagen</td>
			<td>XLS3.0100 and XLS071.0250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>04-127-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin - Agarose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolate II Genomic DNA Kit</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-52066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Panreac AppliChem</td>
			<td>300283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Bio Lab Ltd</td>
			<td>1903059100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep Solution</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-031-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PFA</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>30525-89-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail</td>
			<td>Biotool</td>
			<td>B15001A/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>P2714-1BTL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer</td>
			<td>MERCK Millipore</td>
			<td>648311-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Enzymes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase IV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17104019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>18047019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronidase</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Biological Industries Israel Beit-Haemek Ltd.</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BNCB00130RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Bar Naor</td>
			<td>BN9308C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B6;129-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J</td>
			<td>Jackson labs</td>
			<td>24857</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD.CB17-Prkdc-scid/NCr Hsd (Nod.Scid)</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV pCM109 EFS Cre sg APC sg Kras sg P53- Kras HDR</td>
			<td>Broad Institute of MIT</td>
			<td></td>
			<td>Kind gift from Dr Randall J Platt and Dr. Joseph Rosenbluh, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA 02142, USA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV 2/9 capsid vector</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112865</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAD Delta F5 helper</td>
			<td>Ben Gurion University of the Negev</td>
			<td></td>
			<td>Provided by Dr Daniel Gitler, Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, and Zlotowski Center for Neuroscience, Ben-Gurion University of the Negev, Beer-Sheva 84105, Israel.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic wares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon-ULTRA filter 100 KDa</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m sterile filters, 4 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m sterile filters, 13 mm</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLHV013SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro establishment of a genetically engineered murine head and neck cancer cell line using an adeno-associated virus-cas9 system

השימוש בתאי אפיתל הראשוני נורמלי מאפשר ליצור לגרום לשינויים גנומית נדרש עבור שינוי הסלולר על ידי החדרת מוטציות ספציפיות אונגנים וגנים מדכא הגידול, באמצעות במרווחים רגולציה באשכולות לחזור קצר palindromic (CRISPR)-מבוססי הגנום עריכת טכנולוגיה בעכברים. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקות במדויק את השינויים הגנטיים המתרחשים בסרטן האנושי באמצעות עכברים. על ידי שינוי גנטי מהפך תאים ראשוניים, אנחנו יכולים ללמוד טוב יותר התפתחות סרטן, התקדמות, טיפול, ואבחון. במחקר זה, השתמשנו inducible Cas9 לשון העכבר תאים אפיתל כדי לאפשר עריכת הגנום באמצעות וירוס הקשורים adeno (AAV) ב מבחנה. באופן ספציפי, על ידי שינוי קראס, p53, ו APC בתאי האפיתל הלשון נורמלי, הצלחנו הראש מורנין סרטן הצוואר (HNC) קו מחוץ לתחום, אשר הוא הטמורגניים בעכברים syngeneic. השיטה המוצגת כאן מתארת בפרוטרוט כיצד ליצור קווי התאים HNC עם שינויים גנומית ספציפיים ומסביר התאמה שלהם לחיזוי התקדמות הגידול בעכברים syngeneic. אנו לדמיין כי זו שיטה מבטיחה יהיה אינפורמטיבי ושימושי כדי ללמוד ביולוגיה של הגידול וטיפול של HNC.

שימוש במערכת AAV לשינוי תאי Cas9 רגילים איור 1 מספק מפה וקטורית מפורטת של הפלג ' ה-aav המשמש במחקר זה. איור 2 מתווה את העיצוב והעבודה של המערכת המבוססת על Aav-Cas9. כדי לייצר חלקיקים ויראליים, התאים HEK293T היו מזוהמים עם וקטור הטרנסגנטי AAV ו אח...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System at JoVE.com

In Vitro Establishment of a Genetically Engineered Murine Head and Neck Cancer Cell Line using an Adeno-Associated Virus-Cas9 System

פיתוח של מודלים murine עם גנים ספציפיים מוטציה בראש ובצוואר חולי סרטן נדרש להבנת neoplasia. כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור שינוי בלתי מתורבת של תאי הלשון הראשי murine באמצעות מערכת וירוס הקשורים adeno-Cas9 כדי ליצור קווים מורין HNC התאים עם שינויים גנומית ספציפיים.

בשנת הקמת מבחנה של הראש מהונדסים גנטית מורה וצוואר הסרטן קו תא באמצעות Adeno משויך וירוס-Cas9 מערכת

The use of primary normal epithelial cells makes it possible to reproducibly induce genomic alterations required for cellular transformation by ...

פרוטוקול זה איפשר התפתחות של מודלים של סרטן הראש והצוואר עם פעולה גנומית ספציפית, והשפיע באופן משמעותי על הבנתנו את תפקידן של מוטציות גנים ספציפיות בתהליך הניאופלזיה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא הקלות שבה ניתן לפתח את קו התא כמעט מכל איבר. הדגמת ההליך תהיה מאנו פראסאד סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי.התחל על ידי שימוש במספריים כירורגיים כדי לקצור את הלשון מעכבר מהומר זכר או נקבה בן שישה שבועות B6. השתמש אזמל כדי לטחון את הרקמה לתוך שברים קטנים מאוד ולאסוף את החלקים לתוך צינור 15 מיליליטר המכיל 4.5 מיליליטר של מדיום רגיל RPMI ללא סרום. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תערובת אנזימים משולשת לצינור ודגירים את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות הקשה על הצינור כל 10 דקות כדי לשפר את הדיסוציאציה האנזימטית של הרקמה.בסוף הדגירה, לעצור את התגובה עם 5%FBS ב PBS ולסנן את השעיית התא דרך מסננת רשת 70 מיקרו מטר כדי להפריד את התאים מן שברי הרקמה הגדולים. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בשלושה מיליליטר של מדיום שלם. לאחר מכן צלחת התאים בשלושה מיליליטר של מדיום מלא לכל צלחת 16 מילימטר.העבר צבירות תאים שנשמרו על גבי המסנן לצלחת תרבות נפרדת של 16 מילימטרים והוסף שלושה מיליליטר של מדיום שלם. שמור את שתי הכלים באינקובטור עד שנוצרות מושבות תאים נפרדות. לאחר שבוע של תרבות, מיקרוסקופית לבחון את תרבות התאים העיקרית לנוכחות של זיהום fibroblast, טיפול בתאים עם 25% טריפסין ב 02% EDTA ב 37 מעלות צלזיוס לדקה אחת, ולהסיר את כל fibroblasts.ביום 10 של תרבות להשתמש 25% טריפסין ב 02%EDTA במשך שלוש עד חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס כדי לקצור את התאים מן התבלינים מתלים התא או תאים צבירה ולראות פעמיים 10 לתאים העיקריים החמישי בשני מיליליטר של בינוני לתוך כל באר של צלחת 6 באר. למחרת להתמר את התאים עם אחד פעמים 10 כדי 12 הגנום ויראלי למיליליטר ולהדגיר את התאים במדיום המכיל חלקיקים ויראלי במשך 48 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף האינקובציה, החלף את על-טבעי התרבות בשני מיליליטר של מדיום שלם טרי ל הבאר והחזר את התאים לחממת תרבות התאים.לאחר שבועיים של התרחבות תרבותית, זרע את התאים לאימות וניסויים vivo tumorigenic. באמצעות וקטור AAV CAS9, פעם אחת 10 כדי 12 גנומים ויראליים למיליליטר של וירוס נקבעו ביעילות להפוך תאי ספיד ראשוניים למפות tumorigenic באמצעות הפרוטוקול כפי שהודגם. התאים המתווצרים אקספרס קר, CAS9 וחלבון פלואורסצנטי ירוק.הזרקה של חמש פעמים 10 למפות AAV העיקרי החמישי מתמר לתוך הלשון, השפה והעור של עכברי NOD SCID, תוצאות היווצרות הגידול בבעלי חיים אלה בניגוד להזרקה של מפות ראשוניות, אשר אינם גורמים גידולים. הטרנספורמציה tumorigenic של תאים אפיתל הלשון העיקרית ניתן לאשר באמצעות immunofluorescence ו כתמים מערביים. ניתוח גנומי על ידי רצף עמוק של דנ"א, מבודד מהתאים שהשתנו, מאשר את עריכת הגנים היעילה ואת המסגרת של החלבון הגידולי 53 וגנים APC על ידי מערכת AAV CAS9.בנוסף, תאי הלשון שהשתנו יוצרים ביעילות גידולים בסוג הבר C57 שחור שישה עכברים. ניתוח אימונוהיסטוכימי של תאי הגידול הניאופלסטיים חושף ביטוי ציטופלסמי של E-Cadherin ו Keratin 14, שני סמני רקמת אפיתל. כאשר מנסים הליך זה, תמיד לזכור כי יותר מדי בשר טחון או תגובה אנזימטית יותר מדי להוביל הכדאיות מופחתת של התאים, המוביל יעילות עסקה וירוס מופחתת.באמצעות הליך זה, קווי התא ניתן לשנות גנטית כדי לקבל תובנה לתוך פוטנציאל tumorigenic ו גרורתי של תאים סרטניים מכל רקמה מעניינת.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

מודל הפלישה Perineural ב קרצינומה תא ראש וצוואר קשקש

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

ארבע צבע הקרינה אימונוהיסטוכימיה של T- תאים subpopulations ב פורמולה קבוע פורמאלית, פרפין, מוטבע האדם דגימות שלפוחית ​​השתן דגימות קרצינומה של תאי קשקש

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

דגם עכבר מהונדס גנטית של סרטן המעי הגס ספוראדי

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

The tumor immune microenvironment (TIME) has recently been recognized as a critical mediator of treatment response in solid tumors, especially for ...

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

הקמת החולה סרטן קיבה-מודלים נגזרים הנגזרות וקווי התא הראשי

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

In Vitro Assay to Study Tumor-macrophage Interaction

בתוך שיטת חוץ גופית כדי ללמוד גידול-מקרופאג אינטראקציה

Tumor associated macrophages (TAMs) account for a large percentage of cells in the tumor mass for different types of cancers. Glioblastoma (GBM), a ...