Name: detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection
Uploaded: 2020-02-06T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par la National Nature Science Foundation of China (81570399 et 81773735), le National Key Research and Development Program of China - Traditional Chinese Medicine Modernization Research project (2017YFC1702003), et Hei Long Jiang Fonds scientifique pour la jeunesse exceptionnel (JC2017020).

Toutes les procédures impliquant les animaux et leurs soins ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université médicale Harbin.
REMARQUE : Les outils et l’équipement requis pour la méthode sont énumérés dans le Tableau des matériaux.
1. Préparation des matériaux et des animaux
<ol><li>Commandez des souris mâles C57BL/6 dont le poids se siédesde entre 20 g et 25 g auprès d?...

<ol>
	<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function.">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue.">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li><li>Torres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiotic+model+for+differentiating+local+and+systemic+effects+of+continuous+and+intermittent+hypoxia.">Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).</li><li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy.">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153 (4), 828-839 (2013).</li><li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+mice:+a+detailed+protocol.">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).</li><li>Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+parabiosis:+historical+perspective+and+methodological+considerations+for+studies+of+aging+and+longevity.">Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity.</a> Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).</li><li>Eggel, A., Wyss-Coray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revival+of+parabiosis+in+biomedical+research.">A revival of parabiosis in biomedical research.</a> Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).</li><li>Brack, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+of+the+heart+reversed+by+youthful+systemic+factors!.">Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors!.</a> EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).</li><li>Wu, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cells+contribute+to+cardiomyocyte+regeneration+after+injury.">Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury.</a> Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).</li><li>Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Rejuvenation+factor'+in+blood+turns+back+the+clock+in+old+mice.">'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice.</a> Science. 344 (6184), 570-571 (2014).</li><li>Rando, T. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+aging+and+rejuvenation--a+sense+of+humors?.">Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors?.</a> New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).</li><li>Heidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+monocytes+to+heart+macrophages+in+steady-state+and+after+myocardial+infarction.">Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).</li><li>McPherron, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+thick+and+thin:+a+circulating+growth+factor+inhibits+age-related+cardiac+hypertrophy.">Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).</li><li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+blood+reverses+age-related+impairments+in+cognitive+function+and+synaptic+plasticity+in+mice.">Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.</a> Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).</li><li>Katsimpardi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+neurogenic+rejuvenation+of+the+aging+mouse+brain+by+young+systemic+factors.">Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors.</a> Science. 344 (6184), 630-634 (2014).</li><li>Starzl, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lost+chord:+microchimerism+and+allograft+survival.">The lost chord: microchimerism and allograft survival.</a> Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).</li><li>Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+historical+perspective+on+leptin.">A historical perspective on leptin.</a> Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).</li><li>Salpeter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+regulation+of+the+age-related+decline+of+pancreatic+beta-cell+replication.">Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication.</a> Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).</li><li>Sheldon, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+exercise+protects+adult+male+offspring+from+high-fat+diet-induced+hepatic+steatosis.">Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).</li><li>Martineau, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+profile+of+intrahepatic+cholestasis+of+pregnancy+is+associated+with+impaired+glucose+tolerance,+dyslipidemia,+and+increased+fetal+growth.">The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth.</a> Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).</li><li>Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+C+Protects+Mice+from+HFD-Induced+Obesity+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease.">Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).</li></ol>

Parabiose se réfère à la technique chirurgicale de connecter deux animaux vivants pour établir un système vasculaire commun par des moyens expérimentaux6,7,8. L’avantage de ce modèle est que les substances produites par un seul individu peuvent agir sur les deux animaux en même temps. Ainsi, le modèle de parabiose peut être utilisé pour explorer le rôle d’une substance ou d’un facteur dans une maladie connexe, ...

La parabiose est une méthode de modélisation dans laquelle deux organismes vivants sont réunis chirurgicalement et se développent comme un système physiologique unique avec un système circulatoire partagé1. Ces modèles ont été largement utilisés pour étudier la physiologie en raison de l’avantage que les substances produites par un seul individu peuvent agir sur les deux animaux en même temps via le système circulatoire partagé. Depuis le milieu des années 1800, lorsque les expériences parabiotiques ont été lancées par Paul Bert2, les méthodes de construction de modèles parabiotiques sont devenues standardisées. Cependant, une méthode simple et commode pour vérifier l’établissement réussi du chimérisme de sang a été manquante. Il a été rapporté que la circulation croisée peut être évaluée avec succès en injectant intrapéritonement 0,5% de colorant bleu Evans dans l’un des parabionts suivi par la mesure de l’absorption du bleu Evans dans le sang des deux parabionts avec un lecteur de microplaque3. Une autre méthode nécessite une race de sourisspécifique qui contient CD45.1 - et CD45.2- monocytes étiquetés dans chaque parabiont. La cytométrie cellulaire est ensuite utilisée pour déterminer le chimérisme sanguin en mesurant la fréquence des deux marqueurs dans les monocytes de la rate ou du sang4. Cependant, ces méthodes sont souvent mortelles ou encombrantes pour les animaux, et une méthode sûre et simple pour une vérification rapide et fiable des modèles parabiotiques est hautement souhaitable. Dans cette étude, nous avons établi une nouvelle méthode à cet effet, qui a été validée dans un modèle de souris de parabiose. La concentration de glucose dans les échantillons de sang prélevés dans une veine de queue est mesurée à l’aide d’un glucomètre, et le modèle de changements du niveau de glucose chez les souris donneuses et bénéficiaires est considéré comme une indication de chimérisme de circulation. Nous avons nommé cette méthode la « méthode de fluctuation du glucose ». L’application de cette méthode de validation ne se limite pas aux souris, mais pourrait être étendue à divers modèles pathologiques, sauf pour ceux qui ont une dysrégulation sérieuse du métabolisme du glucose. La procédure est simple, gain de temps, et sûr.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>J31340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scissors</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>WA1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle forcep</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>60017961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringes</td>
			<td>Agilent, USA</td>
			<td>5182-9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethano</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>IP0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tramadol</td>
			<td>Yijishiye, China</td>
			<td>YJT712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucometer</td>
			<td>Roche Diabetes Care, Indiana</td>
			<td>Accu-Chek Active test strips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue Counterstain</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>G1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>depilatory cream</td>
			<td>Nair, USA</td>
			<td>LL9161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming Blanket (Heating pad)</td>
			<td>Kent Scientific Corp, USA</td>
			<td>TP-22G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical shaver</td>
			<td>Codos, China</td>
			<td>CP-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0,5-0 
			surgical suture</td>
			<td>Shanghai Medical Suture Needle Factory, China</td>
			<td>SYZ 3-0#, SYZ 5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection

La parabiose est une méthode expérimentale pour combiner chirurgicalement deux animaux parallèles le long de l’axe longitudinal du corps. Nous présentons un protocole pour détecter l’établissement réussi du chimerism de sang dans les parabionts par une injection caudale de veine de glucose. Des souris parabiotiques ont été construites. Le glucose a été injecté dans la souris de distributeur par la veine de queue, et la fluctuation du niveau de glucose sanguin a été mesurée dans les deux souris utilisant un glucomètre de sang à différents points de temps. Nos résultats ont prouvé qu’après injection de glucose, le niveau de glucose sanguin dans les souris de distributeur a augmenté brusquement après 1 min et a diminué lentement par la suite. Pendant ce temps, le taux de glucose sanguin des souris receveuses a atteint un sommet de 15 min après l’injection. Des résultats similaires ont été obtenus avec Evans bleu, utilisé comme un contrôle positif pour le glucose. La fluctuation synchrone des niveaux de glucose sanguin indique que le flux sanguin entre les deux souris a été établi avec succès.

Chez six souris donneuses, le taux de glucose sanguin a fortement augmenté pour atteindre 26,5 'mol/L (augmentation de 173 %) à une moyenne de 1 min après l’injection de 100 l de glucose (1,2 g/kg) dans la veine de la queue, puis a diminué graduellement à 13,3 'mol/L à 60 min. Chez les souris receveuses, la glycémie augmentait lentement après l’injection et atteignait le premier niveau de pointe à 15 min (augmentation de 47 %, 12,2 'mol/L). Sur la base des résultats ci-dessu...

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Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Ici nous décrivons une nouvelle méthode de détecter l’établissement réussi de la circulation sanguine partagée de deux parabionts par une injection caudale de veine de glucose, qui cause des dommages minimaux et n’est pas mortelle aux parabionts.

Détection de l’établissement de l’approvisionnement en sang partagé dans les souris parabiotiques par injection de glucose de veine caudale

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

Notre protocole fournit une méthode de vérification améliorée pour le chimérisme de circulation et une méthode pour la configuration réussie de modèle de parabiosis pour la recherche biomédicale. Comparé aux méthodes existantes pour la détection du chimérisme sanguin dans la parabiose qui sont souvent mortelles ou lourdes, notre protocole est sûr et simple, permettant une vérification rapide et fiable. Bien que cette méthode soit spécifique à la détection du chimérisme sanguin dans les modèles de parabiose, elle peut être appliquée à toutes les études biomédicales impliquant des procédures parabiotic.L’étape la plus difficile est l’injection de glucose. Par conséquent, assurez-vous de pratiquer l’injection de veine de queue avant d’effectuer une procédure expérimentale, ou d’utiliser un fixateur de queue de souris visuelle veineuse. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de la pédale, placez deux souris mâles noires C57 noires de 20 à 25 grammes en position supine, et utilisez un rasoir électrique pour bien raser le côté gauche d’une souris et le côté droit de la deuxième souris d’environ un centimètre au-dessus du coude à un centimètre sous le genou.Retirer les cheveux restants avec de la crème depilatory avant de faire des incisions cutanées longitudinales dans la peau défrichée de chaque animal, à partir de 0,5 centimètres au-dessus du coude à 0,5 centimètres sous l’articulation du genou, et détacher doucement la peau du fascia sous-cutané. Connectez l’olécranon et le genou du parabiont avec la suture 3-0, et suturez la peau rasée avec une suture continue de 5-0. Injectez ensuite sous-cutanément 0,5 millilitres de chlorure de sodium à 0,9 % pour prévenir la déshydratation, et injectez par voie intramusculaire 10 milligrammes de tramadol par 25 grammes de souris pour soulager la douleur, dans chaque souris par jour pendant trois jours.Pour vérifier la construction réussie de la circulation entre le chimérisme entre les parabionts par fluctuation de glucose, le 10ème jour après chirurgie de parabiosis, fixez les souris donneuses dans un fixateur visuel veineux de queue de souris, et emploiez une boule de coton éthanol-trempée de 70 à 75% pour frotter les veines caudales dans le flanc d’une queue de parabiont. Insérez une aiguille de seringue d’un millilitre dans la veine caudale à deux ou quatre centimètres de la pointe de la queue et aussi parallèle à la veine que possible, et injectez un à deux grammes par kilogramme de glucose dans 100 microlitres de solution saline dans le donneur sur une période de 10 secondes. Utilisez ensuite des ciseaux pour enlever les ateils du donneur et des animaux receveurs afin de permettre la collecte d’une goutte de sang à divers moments d’intérêt après l’injection.Ajoutez ensuite une goutte de chaque échantillon de sang au centre d’une bande d’essai de glucomètre pour la détection du niveau de glucose. Pour vérifier la construction réussie de la circulation par l’absorption de colorant bleu Evans, injecter 200 microlitres de 0,5%Evans contre-tache bleue intraperitoneally dans la souris donneur, et recueillir le sang des deux parabionts par perforation cardiaque après deux heures. Séparez le sérum par centrifugation, et transférez le sérum dans un tube conique pour la dilution à un rapport de un à 50 dans le chlorure de sodium de 0,9%.Mesurez ensuite l’absorption des échantillons de sérum dilués à 620 nanomètres sur un spectrophotomètre. Dans cette analyse représentative des niveaux de glucose sanguin chez six souris donneuses, la glycémie a fortement augmenté à 26,5 micromolaires par litre à une moyenne d’une minute après l’injection de 100 microlitres de glucose par la veine de la queue. Les niveaux de glucose sanguin ont alors graduellement diminué à 13.3 microlitres par litre à 60 minutes.Chez les souris receveurs, la glycémie a lentement augmenté après l’injection, atteignant le premier niveau de pointe à 15 minutes. La concentration de colorant bleu Evans dans le sérum des parabionts a également indiqué une construction réussie du chimérisme de circulation, et des jonctions vasculaires sous-cutanées entre les parabionts pourraient être clairement observées. Dans les parabionts qui n’ont pas établi le chimérisme de sang 15 jours après chirurgie de parabiosis, les souris destinataires n’ont pas exhibé un niveau accru de glucose sanguin dans les 60 minutes après injection de glucose dans l’animal de donneur.La concentration sanguine de bleu Evans chez les deux receveurs n’a pas non plus été élevée, ce qui démontre que la méthode de fluctuation du glucose est aussi sensible que la méthode bleue Evans. En outre, le taux d’insuline dans le sang a été nettement diminué une heure après l’injection de glucose en raison de l’augmentation rapide des niveaux de glucose et récupéré à des niveaux normaux de trois heures, ce qui indique que les effets du glucose injecté sur le métabolisme de l’insuline sont réparables. Prenez soin de vous assurer que l’aiguille est insérée directement dans la veine de la queue.Après avoir confirmé le chimérisme sanguin des parabionts par cette méthode, des changements physiopathologiques peuvent être étudiés chez les animaux parabiotic vivants.

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