Name: detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection
Uploaded: 2020-02-06T12:30:00
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この研究は、中国国家自然科学財団(81570399および81773735)、中国の国家主要研究開発プログラム-伝統的な中国医学近代化研究プロジェクト(2017YFC1702003)、および平龍江によって支援されました優れた青少年科学基金(JC2017020)。

動物とそのケアに関するすべての手順は、ハルビン医科大学の機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました.
注: この方法に必要な工具および装置は、材料表にリストされています。
1. 素材・動物の製造
<ol><li>標準的な実験動物の供給業者からの20 g-25 g間の重量のC57BL/6雄のマウスを注文する。</li>
	<li>マウスを12時間の光のサ...

<ol>
	<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function.">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue.">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li><li>Torres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiotic+model+for+differentiating+local+and+systemic+effects+of+continuous+and+intermittent+hypoxia.">Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).</li><li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy.">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153 (4), 828-839 (2013).</li><li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+mice:+a+detailed+protocol.">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).</li><li>Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+parabiosis:+historical+perspective+and+methodological+considerations+for+studies+of+aging+and+longevity.">Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity.</a> Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).</li><li>Eggel, A., Wyss-Coray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revival+of+parabiosis+in+biomedical+research.">A revival of parabiosis in biomedical research.</a> Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).</li><li>Brack, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+of+the+heart+reversed+by+youthful+systemic+factors!.">Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors!.</a> EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).</li><li>Wu, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cells+contribute+to+cardiomyocyte+regeneration+after+injury.">Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury.</a> Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).</li><li>Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Rejuvenation+factor'+in+blood+turns+back+the+clock+in+old+mice.">'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice.</a> Science. 344 (6184), 570-571 (2014).</li><li>Rando, T. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+aging+and+rejuvenation--a+sense+of+humors?.">Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors?.</a> New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).</li><li>Heidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+monocytes+to+heart+macrophages+in+steady-state+and+after+myocardial+infarction.">Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).</li><li>McPherron, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+thick+and+thin:+a+circulating+growth+factor+inhibits+age-related+cardiac+hypertrophy.">Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).</li><li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+blood+reverses+age-related+impairments+in+cognitive+function+and+synaptic+plasticity+in+mice.">Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.</a> Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).</li><li>Katsimpardi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+neurogenic+rejuvenation+of+the+aging+mouse+brain+by+young+systemic+factors.">Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors.</a> Science. 344 (6184), 630-634 (2014).</li><li>Starzl, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lost+chord:+microchimerism+and+allograft+survival.">The lost chord: microchimerism and allograft survival.</a> Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).</li><li>Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+historical+perspective+on+leptin.">A historical perspective on leptin.</a> Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).</li><li>Salpeter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+regulation+of+the+age-related+decline+of+pancreatic+beta-cell+replication.">Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication.</a> Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).</li><li>Sheldon, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+exercise+protects+adult+male+offspring+from+high-fat+diet-induced+hepatic+steatosis.">Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).</li><li>Martineau, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+profile+of+intrahepatic+cholestasis+of+pregnancy+is+associated+with+impaired+glucose+tolerance,+dyslipidemia,+and+increased+fetal+growth.">The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth.</a> Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).</li><li>Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+C+Protects+Mice+from+HFD-Induced+Obesity+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease.">Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).</li></ol>

パラバイオシスは、実験手段6、7、8によって共通の血管系を確立するために2匹の生きている動物を接続する外科的技術を指す。このモデルの利点は、単一の個人によって生成された物質が同時に両方の動物に作用することができるということです。したがって、パラビオシスモデルは、関連疾患における物質または因子?...

パラビオシスは、2つの生物が外科的に結合し、共有循環系1を有する単一の生理システムとして発達するモデリング方法である。このようなモデルは、単一の個人によって産生される物質が共有循環系を介して両方の動物に同時に作用できるという利点のために生理学を研究するために広く使用されている。1800年代半ば以来、パラバイオティクス実験がPaul Bert2によって開拓された、パラバイオティクスモデルを構築するための方法が標準化されています。しかし、血液キメラリズムの確立が成功したことを確認するための簡単で便利な方法は欠けています。クロス循環は、腹腔内注射で0.5%のエバンスブルー染料を1つのパラバイオエントに注入し、続いてマイクロプレートリーダーを用いた両方のパラバイオレントの血液中のエバンスブルーの吸光度の測定によって正常に評価できることが報告されている。別の方法は、各パラバイオレントにCD45.1+ -とCD45.2+- 標識単球を含む特定のマウス品種を必要とします。細胞サイトメトリーは、次に脾臓または血液4から単球中の2つのマーカーの頻度を測定することによって血液キメラリズムを決定するために使用される。しかし、これらの方法は、動物に対して致死的または面倒であることが多く、かつ、パラバイオティクスモデルの迅速かつ確実な検証のための安全で簡単な方法が非常に望ましい。本研究では、パラビオシスのマウスモデルで検証された新しい方法を確立しました。尾静脈から採取した血液サンプル中のグルコース濃度はグルコメーターを用いて測定され、ドナーマウスとレシピエントマウスにおけるグルコースレベルの変化のパターンは循環キメラリズムの指標と考えられる。この方法を「グルコース変動法」と名付けた。この検証方法の適用は、マウスに限らず、グルコース代謝の深刻な調節不変を有するものを除いて、多様な病理学的モデルに拡張することができる。手順は簡単で、時間を節約し、安全です。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>J31340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scissors</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>WA1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle forcep</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>60017961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringes</td>
			<td>Agilent, USA</td>
			<td>5182-9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethano</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>IP0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tramadol</td>
			<td>Yijishiye, China</td>
			<td>YJT712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucometer</td>
			<td>Roche Diabetes Care, Indiana</td>
			<td>Accu-Chek Active test strips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue Counterstain</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>G1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>depilatory cream</td>
			<td>Nair, USA</td>
			<td>LL9161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming Blanket (Heating pad)</td>
			<td>Kent Scientific Corp, USA</td>
			<td>TP-22G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical shaver</td>
			<td>Codos, China</td>
			<td>CP-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0,5-0 
			surgical suture</td>
			<td>Shanghai Medical Suture Needle Factory, China</td>
			<td>SYZ 3-0#, SYZ 5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection

パラビオシスは、身体の縦軸に沿って2つの平行動物を外科的に結合するための実験的方法である。我々は、グルコースの尾静脈注射によってパラバイオントにおける血液キメラリズムの確立を成功させるためのプロトコルを提示する。パラバイオティクスマウスを構築した。グルコースは、尾静脈を介してドナーマウスに注入され、そして、血糖量の変動を異なる時点で血液グルコメーターを用いて両マウスで測定した。我々の結果は、グルコース注射後、ドナーマウスの血糖値が1分後に急激に増加し、その後ゆっくりと減少することを示した。一方、レシピエントマウスの血糖値は、注射後15分にピークを迎えた。同様の結果は、グルコースの陽性対照として使用されるエバンスブルーで得られた。血糖レベルの同期変動は、2つのマウス間の血流が正常に確立されたことを示す。

ドナーマウス6匹では、血糖濃度が100μLのブドウ糖(1.2g/kg)を尾静脈に注射した後、平均1分で26.5μmol/L(173%増加)に急上昇し、60分で13.3μmol/Lに徐々に低下した。レシピエントマウスでは、注射後に血糖値がゆっくりと上昇し、15分で最初のピークレベルに達した(47%増加、12.2μmol/L)。上記の結果に基づいて、循環キメラ症の標準は次のように設定した:1)グルコース注入後1分?...

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Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

ここでは、グルコースの尾静脈注射を通じて2つのパラバイオリンの共有血液循環の確立を成功させたことを検出する新しい方法について説明します。

コーダル静脈グルコース注射によるパラバイオティクスマウスにおける共有血液供給の検出

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

当社のプロトコルは、循環キメラリズムの改善された検証方法と、生物医学研究のためのパラバイオシスモデル設定を成功させるための方法を提供します。多くの場合、致死的または面倒であるパラバイオシスにおける血液キメラリズムの検出のための既存の方法と比較して、私たちのプロトコルは安全で簡単であり、迅速かつ信頼性の高い検証を可能にします。この方法は、パラバイオシスモデルにおける血液キメラリズムの検出に特異的であるが、パラバイオティクス処置を含むあらゆる生物医学的研究に適用することができる。最も困難なステップは、グルコース注入です。したがって、実験手順を行う前に尾静脈注射を練習するか、静脈視覚的マウス尾部固定剤を使用してください。ペダル反射に対する応答の欠如を確認した後、20〜25グラムの麻酔付きC57黒6雄マウスをスピービン位置に置き、電気剃りを使用して1匹のマウスの左側と2番目のマウスの右側を肘の上約1センチメートルから膝の下1センチメートルまで徹底的に剃ります。肘の上0.5センチメートルから膝関節の下0.5センチメートルまで、各動物のクリアされた皮膚に縦方向の皮膚切開を行う前に脱毛クリームで残りの毛髪を取り除き、皮下筋膜から皮膚をそっと剥離します。パラビオントのオレクラノンと膝を3-0縫合で接続し、剃った皮膚を5-0縫合で縫合する。その後、皮下に0.5ミリリットルの0.9%塩化ナトリウムを注入して脱水症状を防ぎ、筋肉内にマウス25グラムあたり10ミリグラムのトラマドールを注入して痛みを和らげ、1日あたり1匹ずつ3日間注射する。グルコース変動によるパラバイオント間のキメラリズム間の循環の正常な構築を検証するために、パラバイオシス手術後10日目に、ドナーマウスを静脈視覚マウス尾固定器に固定し、70〜75%エタノール浸し綿球を使用して、1つのパラバイオント尾部の側面で尾静脈をこすります。尾端から2〜4センチメートル、可能な限り静脈に平行な尾静脈に1ミリリットルの注射針を挿入し、100マイクロリットルの生理食塩水中のグルコース1キログラム当たり1〜2グラムを10秒間ドナーに注入する。次に、注射後の様々な時点での血液の滴を可能にするために、ドナーおよびレシピエント動物からつま先を取り除くためにはさみを使用する。次に、各血液サンプルの滴をグルコメータテストストリップの中央に加え、グルコースレベル検出を行います。エバンスブルー色素吸光度による循環の成功した構築を確認するには、0.5%のエバンスブルーカウンターステインの200マイクロリットルをドナーマウスに腹腔内に注入し、2時間後に心臓穿刺によって両方のパラバイオントから血液を採取する。遠心分離によって血清を分離し、0.9%の塩化ナトリウムで1〜50比で希釈するために円錐形チューブに血清を移す。次に、分光光度計で620ナノメートルで希釈した血清サンプルの吸光度を測定します。6匹のドナーマウスにおける血糖値のこの代表的な分析では、血糖値は、尾静脈を通して100マイクロリットルのグルコースを注入した後、平均1分で1リットル当たり26.5マイクロモルに急激に増加した。血糖値は、その後、徐々に60分でリットル当たり13.3マイクロリットルに減少しました。レシピエントマウスでは、注入後に血糖値が徐々に増加し、15分で最初のピークレベルに達した。パラバイオエントの血清中のエバンスブルー染料の濃度はまた、循環キメラリズムの構築に成功したことを示し、パラバイオント間の皮下血管接合部は明確に観察することができた。パラバイオシス手術の15日後に血中キメリズムを確立しなかったパラバイオエントでは、レシピエントマウスは、ドナー動物へのグルコース注入後60分以内に血糖値の上昇を示さなかった。2人のレシピエントにおけるエバンスブルーの血中濃度も上昇しておらず、グルコース変動法がエバンスブルー法と同じくらい敏感であることを実証した。さらに、血中インスリン濃度は、グルコースレベルの急速な増加によりグルコース注射の1時間後に著しく低下し、3時間の正常レベルまで回復し、インスリン代謝に対する注入されたグルコースの効果が回復可能であることを示している。針が尾静脈に直接挿入されていることを確認するように注意してください。この方法によりパラバイオントの血中キメラリズムを確認した後、生理病理学的変化を生きたパラバイオティクス動物で研究することができる。

Research

JoVE Journal

Biology

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

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Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

新生児マウスからの肺血管内皮細胞の単離と培養

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによる除核イベントにおけるマウス赤芽球亜集団エンリッチの同定

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

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Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

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シンプルで効率的なマウスの心筋内注入による生体内の心臓特異的遺伝子操作法

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フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

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