Name: detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection
Uploaded: 2020-02-06T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência da Natureza da China (81570399 e 81773735), pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China - Tradicional Projeto de Pesquisa em Modernização da Medicina Chinesa (2017YFC1702003) e Hei Long Jiang Excelente Fundo de Ciência da Juventude (JC2017020).

Todos os procedimentos envolvendo animais e seus cuidados foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Médica harbin.
NOTA: As ferramentas e equipamentos necessários para o método estão listados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de materiais e animais
<ol><li>Peça C57BL/6 camundongos machos com peso entre 20 g-25 g de um fornecedor animal de laboratório padrão.</li>
	<li>Abrigar os ratos em u...

<ol>
	<li>Baruch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging-induced+type+I+interferon+response+at+the+choroid+plexus+negatively+affects+brain+function.">Aging-induced type I interferon response at the choroid plexus negatively affects brain function.</a> Science. 346 (6205), 89-93 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positional+cloning+of+the+mouse+obese+gene+and+its+human+homologue.">Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue.</a> Nature. 372 (6505), 425-432 (1994).</li><li>Torres, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiotic+model+for+differentiating+local+and+systemic+effects+of+continuous+and+intermittent+hypoxia.">Parabiotic model for differentiating local and systemic effects of continuous and intermittent hypoxia.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 118 (1), 42-47 (2015).</li><li>Loffredo, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor+11+is+a+circulating+factor+that+reverses+age-related+cardiac+hypertrophy.">Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy.</a> Cell. 153 (4), 828-839 (2013).</li><li>Kamran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parabiosis+in+mice:+a+detailed+protocol.">Parabiosis in mice: a detailed protocol.</a> Journal of Visualized Experiments. (80), e50556 (2013).</li><li>Conboy, M. J., Conboy, I. M., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochronic+parabiosis:+historical+perspective+and+methodological+considerations+for+studies+of+aging+and+longevity.">Heterochronic parabiosis: historical perspective and methodological considerations for studies of aging and longevity.</a> Aging Cell. 12 (3), 525-530 (2013).</li><li>Eggel, A., Wyss-Coray, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revival+of+parabiosis+in+biomedical+research.">A revival of parabiosis in biomedical research.</a> Swiss Medical Weekly. 144, w13914 (2014).</li><li>Brack, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ageing+of+the+heart+reversed+by+youthful+systemic+factors!.">Ageing of the heart reversed by youthful systemic factors!.</a> EMBO Journal. 32 (16), 2189-2190 (2013).</li><li>Wu, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+cells+contribute+to+cardiomyocyte+regeneration+after+injury.">Circulating cells contribute to cardiomyocyte regeneration after injury.</a> Circulation Research. 116 (4), 633-641 (2015).</li><li>Kaiser, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term='Rejuvenation+factor'+in+blood+turns+back+the+clock+in+old+mice.">'Rejuvenation factor' in blood turns back the clock in old mice.</a> Science. 344 (6184), 570-571 (2014).</li><li>Rando, T. A., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+aging+and+rejuvenation--a+sense+of+humors?.">Cardiac aging and rejuvenation--a sense of humors?.</a> New England Journal of Medicine. 369 (6), 575-576 (2013).</li><li>Heidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+contribution+of+monocytes+to+heart+macrophages+in+steady-state+and+after+myocardial+infarction.">Differential contribution of monocytes to heart macrophages in steady-state and after myocardial infarction.</a> Circulation Research. 115 (2), 284-295 (2014).</li><li>McPherron, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through+thick+and+thin:+a+circulating+growth+factor+inhibits+age-related+cardiac+hypertrophy.">Through thick and thin: a circulating growth factor inhibits age-related cardiac hypertrophy.</a> Circulation Research. 113 (5), 487-491 (2013).</li><li>Villeda, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Young+blood+reverses+age-related+impairments+in+cognitive+function+and+synaptic+plasticity+in+mice.">Young blood reverses age-related impairments in cognitive function and synaptic plasticity in mice.</a> Nature Medicine. 20 (6), 659-663 (2014).</li><li>Katsimpardi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+and+neurogenic+rejuvenation+of+the+aging+mouse+brain+by+young+systemic+factors.">Vascular and neurogenic rejuvenation of the aging mouse brain by young systemic factors.</a> Science. 344 (6184), 630-634 (2014).</li><li>Starzl, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lost+chord:+microchimerism+and+allograft+survival.">The lost chord: microchimerism and allograft survival.</a> Immunology Today. 17 (12), 577-584 (1996).</li><li>Coleman, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+historical+perspective+on+leptin.">A historical perspective on leptin.</a> Nature Medicine. 16 (10), 1097-1099 (2010).</li><li>Salpeter, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+regulation+of+the+age-related+decline+of+pancreatic+beta-cell+replication.">Systemic regulation of the age-related decline of pancreatic beta-cell replication.</a> Diabetes. 62 (8), 2843-2848 (2013).</li><li>Sheldon, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gestational+exercise+protects+adult+male+offspring+from+high-fat+diet-induced+hepatic+steatosis.">Gestational exercise protects adult male offspring from high-fat diet-induced hepatic steatosis.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 171-178 (2016).</li><li>Martineau, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+profile+of+intrahepatic+cholestasis+of+pregnancy+is+associated+with+impaired+glucose+tolerance,+dyslipidemia,+and+increased+fetal+growth.">The metabolic profile of intrahepatic cholestasis of pregnancy is associated with impaired glucose tolerance, dyslipidemia, and increased fetal growth.</a> Diabetes Care. 38 (2), 243-248 (2015).</li><li>Wang, F., Liu, Y., Yuan, J., Yang, W., Mo, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound+C+Protects+Mice+from+HFD-Induced+Obesity+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease.">Compound C Protects Mice from HFD-Induced Obesity and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> International Journal of Endocrinology. 2019, 3206587 (2019).</li></ol>

A parabiose refere-se à técnica cirúrgica de conectar dois animais vivos para estabelecer um sistema vascular comum por meioexperimental6,7,8. A vantagem deste modelo é que as substâncias produzidas por um único indivíduo podem atuar em ambos os animais ao mesmo tempo. Assim, o modelo de parabiose pode ser usado para explorar o papel de uma substância ou fator em uma doença relacionada, produzindo muitas conclusões sig...

A parabiose é um método de modelagem no qual dois organismos vivos são unidos cirurgicamente e se desenvolvem como um único sistema fisiológico com um sistema circulatório compartilhado1. Tais modelos têm sido amplamente utilizados para estudar fisiologia devido à vantagem de que as substâncias produzidas por um único indivíduo podem atuar em ambos os animais ao mesmo tempo através do sistema circulatório compartilhado. Desde meados da década de 1800, quando experimentos parabióticos foram pioneiros por Paul Bert2, os métodos para a construção de modelos parabióticos tornaram-se padronizados. No entanto, um método simples e conveniente para verificar o estabelecimento bem sucedido do chimerismo sanguíneo está faltando. Foi relatado que a circulação cruzada pode ser avaliada com sucesso por injetar intraperitoneicamente 0,5% de tinta azul Evans em um dos parabiontes seguido pela medição da absorção do azul Evans no sangue de ambos os parabiontes com um leitor de microplaca3. Outro método requer uma raça específica do mouse que contém CD45.1+- e monocitos rotulados por CD45.2+em cada parabionte. A citometria celular é então usada para determinar o chimerismo sanguíneo medindo a frequência dos dois marcadores em monocitos do baço ou sangue4. No entanto, esses métodos são muitas vezes letais ou complicados para os animais, e um método seguro e simples para verificação rápida e confiável de modelos parabióticos é altamente desejável. Neste estudo, estabelecemos um novo método para esse fim, que foi validado em um modelo de parabiose de camundongos. A concentração de glicose em amostras de sangue retiradas de uma veia traseira é medida usando um glucometer, e o padrão de mudanças do nível de glicose em camundongos doadores e receptores é considerado uma indicação de chimerismo de circulação. Nomeamos este método de "método de flutuação de glicose". A aplicação deste método de validação não se limita aos camundongos, mas pode ser estendida a diversos modelos patológicos, exceto aqueles com grave disregulação do metabolismo da glicose. O procedimento é simples, economizando tempo e seguro.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>curved forceps</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>J31340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fine scissors</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>WA1030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle forcep</td>
			<td>JZ surgical Instruments, China</td>
			<td>60017961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5 mL syringes</td>
			<td>Agilent, USA</td>
			<td>5182-9642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethano</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>T48402-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>IP0150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tramadol</td>
			<td>Yijishiye, China</td>
			<td>YJT712520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glucometer</td>
			<td>Roche Diabetes Care, Indiana</td>
			<td>Accu-Chek Active test strips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evan&#39;s blue Counterstain</td>
			<td>Solarbio, China</td>
			<td>G1810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>depilatory cream</td>
			<td>Nair, USA</td>
			<td>LL9161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warming Blanket (Heating pad)</td>
			<td>Kent Scientific Corp, USA</td>
			<td>TP-22G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrical shaver</td>
			<td>Codos, China</td>
			<td>CP-5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-0,5-0 
			surgical suture</td>
			<td>Shanghai Medical Suture Needle Factory, China</td>
			<td>SYZ 3-0#, SYZ 5-0#</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detecting establishment of shared blood supply in parabiotic mice by caudal vein glucose injection

A parabiose é um método experimental para combinar cirurgicamente dois animais paralelos ao longo do eixo longitudinal do corpo. Apresentamos um protocolo para detectar o estabelecimento bem sucedido de chimerismo sanguíneo em parabiontes por uma injeção de glicose na veia caudal. Foram construídos camundongos parabióticos. A glicose foi injetada no camundongo doador através da veia traseira, e a flutuação do nível de glicose no sangue foi medida em ambos os camundongos usando um glucometer de sangue em diferentes pontos de tempo. Nossos resultados mostraram que após a injeção de glicose, o nível de glicose no sangue em camundongos doadores aumentou acentuadamente após 1 min e diminuiu lentamente depois disso. Enquanto isso, o nível de glicose no sangue dos camundongos receptores atingiu 15 min após a injeção. Resultados semelhantes foram obtidos com o azul Evans, usado como um controle positivo para a glicose. A flutuação síncrona dos níveis de glicose no sangue indica que o fluxo sanguíneo entre os dois camundongos foi estabelecido com sucesso.

Em seis camundongos doadores, os níveis de glicose no sangue aumentaram acentuadamente para 26,5 μmol/L (aumento de 173%) em uma média de 1 min após a injeção de 100 μL de glicose (1,2 g/kg) através da veia traseira e, em seguida, gradualmente diminuíram para 13,3 μmol/L a 60 min. Em camundongos receptores, a glicemia aumentou lentamente após a injeção e atingiu o primeiro pico de nível de 15 min (aumento de 47%, 12,2 μmol/L). Com base nos resultados acima, o padrão de qui...

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Detecting Establishment of Shared Blood Supply in Parabiotic Mice by Caudal Vein Glucose Injection

Aqui descrevemos um novo método de detecção de estabelecimento bem sucedido de circulação sanguínea compartilhada de dois parabiontes através de uma injeção de veia caudal de glicose, o que causa danos mínimos e não é fatal para os parabiontes.

Detectando estabelecimento de suprimento de sangue compartilhado em camundongos parabióticos por injeção de glicose em veia caudal

Parabiosis is an experimental method for surgically combining two parallel animals along the longitudinal axis of the body. We present a protocol for ...

Nosso protocolo fornece um método de verificação aprimorado para o chimerismo de circulação e um método para uma configuração bem-sucedida do modelo de parabiose para pesquisa biomédica. Comparado com os métodos existentes para a detecção de chimerismo sanguíneo na parabiose que muitas vezes são letais ou complicados, nosso protocolo é seguro e simples, permitindo uma verificação rápida e confiável. Embora este método seja específico para a detecção do chimerismo sanguíneo em modelos de parabiose, pode ser aplicado a quaisquer estudos biomédicos envolvendo procedimentos parabióticos.O passo mais desafiador é a injeção de glicose. Portanto, certifique-se de praticar a injeção da veia da cauda antes de realizar um procedimento experimental, ou usar um fixador de cauda visual venoso. Depois de confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, coloque dois camundongos c57 pretos c57 de 20 a 25 gramas na posição supina, e use um barbeador elétrico para raspar completamente o lado esquerdo de um rato e o lado direito do segundo rato de aproximadamente um centímetro acima do cotovelo para um centímetro abaixo do joelho.Remova qualquer cabelo restante com creme depilatório antes de fazer incisões longitudinais na pele limpa de cada animal, começando de 0,5 centímetros acima do cotovelo para 0,5 centímetros abaixo da articulação do joelho, e desprender suavemente a pele da fáscia subcutânea. Conecte o olecranon e o joelho do parabionte com sutura 3-0, e sutura a pele raspada com uma sutura contínua 5-0. Em seguida, injete subcutâneamente 0,5 mililitros de cloreto de sódio de 0,9% para evitar a desidratação, e injete intramuscularmente 10 miligramas de tramadol por 25 gramas de rato para aliviar a dor, em cada rato por dia durante três dias.Para verificar a construção bem sucedida de circulação entre os parabiontes por flutuação de glicose, no 10º dia após a cirurgia de parabiose, fixar os camundongos doadores em um fixador de cauda de rato visual venoso, e usar uma bola de algodão 70 a 75% encharcada de etanol para esfregar as veias caudais no flanco de uma cauda parabionte. Insira uma agulha de seringa de um mililitro na veia caudal de dois a quatro centímetros da ponta da cauda e o mais paralelo possível à veia, e injete de um a dois gramas por quilograma de glicose em 100 microlitres de solução salina no doador em um período de 10 segundos. Em seguida, use uma tesoura para remover os dedos dos dedos dos animais doadores e receptores para permitir a coleta de uma gota de sangue em vários momentos de interesse após a injeção.Em seguida, adicione uma gota de cada amostra de sangue no centro de uma tira de teste de glucometer para detecção do nível de glicose. Para verificar a construção bem sucedida da circulação por evans absorvente de corante azul, injete 200 microliters de 0,5% Evans contra-mancha azul intraperitoneal no rato doador, e colete sangue de ambos os parabiontes por punção cardíaca após duas horas. Separe o soro por centrifugação e transfira o soro para um tubo cônico para diluição em uma proporção de um a 50 em cloreto de sódio de 0,9%.Em seguida, meça a absorvência das amostras de soro diluído em 620 nanômetros em um espectrofotômetro. Nesta análise representativa dos níveis de glicose no sangue em seis camundongos doadores, a glicemia aumentou acentuadamente para 26,5 micromolar por litro, em média um minuto após a injeção de 100 microliters de glicose pela veia traseira. Os níveis de glicose no sangue diminuíram gradualmente para 13,3 microliters por litro em 60 minutos.Em camundongos receptores, a glicemia aumentou lentamente após a injeção, atingindo o primeiro nível de pico em 15 minutos. A concentração de corante azul evans no soro dos parabiontes também indicou uma construção bem sucedida de chimerismo de circulação, e junções vasculares subcutâneas entre os parabiontes poderiam ser claramente observadas. Em parabiontes que não estabeleceram chimerismo sanguíneo 15 dias após a cirurgia de parabiose, os camundongos receptores não apresentaram aumento do nível de glicose no sangue em 60 minutos após a injeção de glicose no animal doador.A concentração sanguínea de Evans azul nos dois receptores também não foi elevada, demonstrando que o método de flutuação de glicose é tão sensível quanto o método azul evans. Além disso, o nível de insulina no sangue foi significativamente diminuído uma hora após a injeção de glicose devido ao rápido aumento dos níveis de glicose e recuperado aos níveis normais em três horas, indicando que os efeitos da glicose injetada no metabolismo da insulina são restauráveis. Tenha cuidado para ter certeza de que a agulha está inserida diretamente na veia da cauda.Após a confirmação do chimerismo sanguíneo dos parabiontes por este método, alterações fisiopatológicas podem ser estudadas em animais parabióticos vivos.

Research

JoVE Journal

Biology

Drawing Blood from Rats through the Saphenous Vein and by Cardiac Puncture

Desenho de sangue de ratos através da veia safena e por punção cardíaca

Drawing blood from rodents is necessary for a large number of both in vitro and in vivo studies. Sites of blood draws are numerous in rodents: ...

Biologia

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Detecting Somatic Genetic Alterations in Tumor Specimens by Exon Capture and Massively Parallel Sequencing

Detectando somáticas Genéticos Alterações em amostras de tumor por Exon Captura e Seqüenciamento Massively Parallel

Efforts  to detect and investigate key oncogenic mutations have proven valuable to  facilitate the appropriate treatment for cancer patients. The ...

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Identificação de um Murino eritroblasto subpopulação enriquecido em enucleação Eventos da Multi-espectral de imagem de Citometria de Fluxo

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

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In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Sampling Blood from the Lateral Tail Vein of the Rat

A amostragem de sangue a partir da veia lateral da cauda do rato

Blood samples are commonly obtained in many experimental contexts to measure targets of interest, including hormones, immune factors, growth factors, ...

Fecal Glucocorticoid Analysis: Non-invasive Adrenal Monitoring in Equids

Fecal Análise de glicocorticóides: Non-invasive Monitoring Adrenal em eqüídeos

Adrenal activity can be assessed in the equine species by analysis of feces for corticosterone metabolites. During a potentially aversive situation, ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

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Um método simples e eficiente para In Vivo cardíaco-específicas do Gene manipulação por injeção Intramiocárdica em ratos

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Detectando e caracterizando a auto-montagem da proteína in vivo por citometria de fluxo

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Detecting Migration and Infiltration of Neutrophils in Mice

Detectando migração e infiltração de neutrófilos em camundongos

Neutrophils are a major member of the innate immune system and play pivotal roles in host defense against pathogens and pathologic inflammatory reactions. ...