Name: isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment
Uploaded: 2020-01-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل مستشفى الجامعة الطبية الصينية (DMR-Cell-1809).

تم تنفيذ البروتوكول السريري والموافقة عليه وفقًا للمبادئ التوجيهية لمجلس المراجعة المؤسسية للجامعة الطبية الصينية ولجنة أخلاقيات أبحاث المستشفيات. تم حصاد عينات الدم المحيطية من متطوعين أصحاء بموافقتهم المستنيرة.
1- إعداد المواد
<ol><li>تخزين الكواشف والأجسام المضادة والم...

<ol>
	<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors:+The+paradigm+of+Cytokine-Induced+Killer+(CIK)+cells.">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).</li><li>Schmidt-Wolf, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+large+numbers+of+T+cells+with+natural+killer+cell+markers.">Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers.</a> British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).</li><li>Grainger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+in+Hematological+Malignancies.">Wnt Signaling in Hematological Malignancies.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+combined+PD-L1/PD-1+blockade+with+cytokine-induced+killer+cells+as+a+synergistic+immunotherapy+for+gastrointestinal+cancer.">Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer.</a> Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).</li><li>Schmidt-Wolf, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+SCID+mouse/human+lymphoma+model+to+evaluate+cytokine-induced+killer+cells+with+potent+antitumor+cell+activity.">Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity.</a> TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).</li><li>Introna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+massive+expansion+of+cord+blood-derived+cytokine-induced+killer+cells:+an+innovative+proposal+for+the+treatment+of+leukemia+relapse+after+cord+blood+transplantation.">Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).</li><li>Schmeel, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+cancer+immunotherapy:+report+of+the+international+registry+on+CIK+cells+(IRCC).">Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC).</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).</li><li>Rutella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+with+cytokine-induced+killer+cells+generated+with+a+new+good+manufacturing+practice-grade+protocol.">Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol.</a> Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).</li><li>Nausch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+in+tumor+immunity.">NKG2D ligands in tumor immunity.</a> Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).</li><li>Gammaitoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+activity+of+cytokine-induced+killer+cells+against+autologous+metastatic+melanoma+including+cells+with+stemness+features.">Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features.</a> Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).</li><li>Rettinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+potential+of+interleukin-15-stimulated+cytokine-induced+killer+cells+against+leukemia+cells.">The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells.</a> Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+cytokine-induced+killer+cell+infusion+as+consolidation+after+nonmyeloablative+allogeneic+transplantation+for+myeloid+neoplasms.">Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).</li><li>Castiglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+killer+cells+produced+in+good+manufacturing+practices+conditions:+identification+of+the+most+advantageous+and+safest+expansion+method+in+terms+of+viability,+cellular+growth+and+identity.">Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).</li><li>Bonanno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoglobulin,+interferon-&#947;+and+interleukin-2+efficiently+expand+cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+clinical-grade+cultures.">Thymoglobulin, interferon-&#947; and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).</li><li>Iudicone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+enhances+cytokine+induced+killer+(CIK)+cytotoxic+potential+against+epithelial+cancer+cell+lines+via+an+innate+pathway.">Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway.</a> Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+anticancer+capacity+of+CD8++cytokine-induced+killer+cells+after+antigen-induced+expansion.">Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion.</a> PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+cells+as+a+feasible+adoptive+immunotherapy+for+the+treatment+of+lung+cancer.">Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 366 (2018).</li><li>Tario, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+proliferation+by+dye+dilution:+considerations+for+probe+selection.">Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).</li><li>Last'ovicka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+natural+killer+cells+in+tamarins:+a+technical+basis+for+studies+of+innate+immunity.">Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity.</a> Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).</li></ol>

الطريقة الموصوفة هي بروتوكول سريع ومريح وموثوق به لعزل وتوسيع الخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) من عينات الدم الكاملة للمتبرعين الأصحاء. كما أنه يظهر تأثير السمية للخلايا من CIK ضد سرطان الدم (K562) وخلايا سرطان المبيض (OC-3) باستخدام تدفق الإعداد الخلوي وتتبع النظام (CS & T). يمكن حث خلايا CI...

الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا هي مجموعة خلايا ذات تأثير مناعي محددة تتوسط الاستجابات المناعية ضد السرطان. تم تطوير العديد من مجموعات الخلايا الضارة بما في ذلك الخلايا القاتلة المنشطة من اللمفوكين (LAK) ، والخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا T ، والخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) لأغراض العلاج بالخلايا التائية بالتبني (ACT)1. هناك اهتمام متزايد في خلايا CIK ، لأنها تمثل مزيجًا من مجموعات الخلايا السامة للخلايا الناجمة عن السيتوكين التي توسعت من الخلايا أحادية نووية الدم المحيطية الذاتية (PMBCs)2.
يؤدي النمو غير المنضبط لخلايا السلف اللمفاوية والمايلوبلاست والأورام اللمفاوية إلى ثلاثة أنواع رئيسية من سرطان الدم (أي سرطان الدم وسرطان الغدد الليمفاوية والمايلوما) والأورام الصلبة ، بما في ذلك السرطانات (على سبيل المثال ، سرطان الرئة ، سرطان المعدة ، سرطان عنق الرحم) ، والساركومات ، من بين أنواع أخرى من السرطانات3. خلايا CIK هي مزيج من مجموعات الخلايا التي تحمل مجموعة واسعة من مجمع التوافق الهيستيك الرئيسي (MHC) - نشاط مضاد للورم غير المقيد وبالتالي تحمل الوعد لعلاج الأورام الدموية والمتقدمة4،5،6،7. خلايا CIK تتألف من مزيج من الخلايا، بما في ذلك الخلايا التائية (CD3+CD56−)، NK-T الخلايا (CD3+CD56+)، وخلايا NK (CD3-CD56+). التحسين من بروتوكول التعريفي CIK باستخدام جدول زمني ثابت بالإضافة إلى IFN-ο، الأجسام المضادة CD3، وIL-2، يؤدي إلى توسيع خلايا CIK8. القدرة السامة للخلايا CIK ضد الخلايا السرطانية يعتمد أساسا على مشاركة NK المجموعة 2 عضو D (عضو في الأسرة مستقبلات C-نوع ليكتين مثل) لغاند NKG2D على الخلايا السرطانية, وعلى مسارات perforin بوساطة9. وكشفت نتائج دراسة ما قبل السريرية أن IL-15-حفز خلايا CIK تسبب السمية الخلوية قوية ضد خطوط خلايا سرطان الدم النخاعي الأولية والحادة في المختبر وأظهرت انخفاض alloreactivity ضد PBMCs العاديوالخلايا الليفية9. في الآونة الأخيرة ، تم نشر نتيجة CIK المشتقة من المتبرع الصحي لمرة واحدة (1 × 108/ كجم CD3+ الخلايا) التسريب كدمج بعد زرع الخلايا الجينية غير النخاعية لعلاج الأورام النخاعية في دراسة سريرية المرحلة الثانية10.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير صيغة زراعة الخلايا المحسنة المكونة من IFN-ο ، IL-1α ، الأجسام المضادة CD3 ، وIL-2 المضافة إلى وسط الخلية المكونة للدم لزيادة إنتاج CIK ، وحقق تأثير الخلايا السامة للخلايا ضد الإنسان المزمن سرطان الدم النخاعي (K562) الخلايا وسرطان المبيض (OC-3) الخلايا.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-Amino Actinomycin D</td>
			<td>BD</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD56 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555518</td>
			<td>B159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555751</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
			<td>SN: R33896202856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>BD</td>
			<td>565082</td>
			<td></td>
			<td>Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
			<td>For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.02</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for OC-3 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
			<td>For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>71101700-EK</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555332</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555748</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-CD3 mAb</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T210</td>
			<td>OKT3</td>
			<td>Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin</td>
			<td>NOVARTIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of Proleukin Powder (22x106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interferon-gamma</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>1425-050</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of rh IFN-g (5x105 IU/50 &#181;g) with 200 &#181;L of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-1 alpha</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>200-01A</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution rh IL-1&#945; (10 &#181;g) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 3-18K Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10295</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
			<td>Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment

يركز العلاج المناعي الخلوي بالتبني على استعادة التعرف على السرطان عبر الجهاز المناعي ويحسن القتل الفعال للخلايا السرطانية. وقد أفيد القاتل الناجم عن السيتوكين (CIK) T العلاج بالخلايا لممارسة آثار كبيرة السامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية والحد من الآثار السلبية للجراحة, الإشعاع, والعلاج الكيميائي في علاجات السرطان. يمكن اشتقاق CIK من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطية (PBMCs) ونخاع العظام ودم الحبل السري. خلايا CIK هي مجموعة فرعية غير متجانسة من الخلايا التائية مع CD3+CD56+ والخصائص الطبيعية للقاتل (NK) التي تشمل مجمع التوافق الأنسجة الرئيسي (MHC) - نشاط مضاد للورم غير المقيد. تصف هذه الدراسة طريقة مؤهلة وقابلة للتطبيق سريرياً وقائمة على التدفق الخلوي للقياس الكمي للقدرة الخلويلة لخلايا CIK المشتقة من PBMC ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة. في الاستئصال الخلوي، تشارك خلايا CIK في احتضان بنسب مختلفة مع الخلايا السرطانية المستهدفة الملطخة مسبقا. بعد فترة الحضانة ، يتم تحديد عدد الخلايا المستهدفة بواسطة بقعة ملزمة للحمض النووي للكشف عن الخلايا الميتة. تنطبق هذه الطريقة على كل من تطبيقات البحث والتشخيص. تمتلك خلايا CIK سمية سيتومية قوية يمكن استكشافها كاستراتيجية بديلة لعلاج السرطان عند تقييمها قبل السريري من خلال إعداد وتتبع مقياس الخلايا (CS & T) نظام قياس الخلايا القائم على.

الغرض من هذا البروتوكول هو عزل وتوسيع الخلايا القاتلة الناجمة عن السيتوكين (CIK) T من monocytes الدم المحيطي وتقييم تأثير السامة للخلايا CIK ضد الأورام الخبيثة الدموية والخلايا السرطانية الصلبة، على التوالي. تم تحديد تحريض CIK من خلال الاعتراف CD3/CD56. ويبين الشكل 1ألف بروتوك...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

هنا ، نقدم بروتوكولًا لتنفيذ عزل وتوسيع خلايا الدم الطرفية أحادية النواة المشتقة من السيتوكين CD3+CD56+ الخلايا القاتلة وتوضيح تأثيرها على السمية السيتومية ضد الخلايا السرطانية الدموية والصلبة باستخدام نظام التدفق الخلوي للتشخيص المختبري.

عزل وتوسيع الخلايا التائية القاتلة التي يسببها الخلايا السامة للخلايا السامة لعلاج السرطان

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

قمنا بتحسين طريقة مؤهلة تأهيلا عاليا وقابلة للتطبيق سريريا لتوسيع الخلايا التائية القاتلة المشتقة من PBMC من السيتوكين، وتقييم السمية الخلوية ضد السرطان. وميزة هذه التقنية هي توفير إجراء تشغيلي موحد للفنيين والأطباء لتحديد مدى فاعلية الخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكين في كل من البحث العلمي والتقييم السريري. ابدأ هذا الإجراء بإعداد خلايا CIK كما هو موضح في بروتوكول النص ، ثم غسل خلايا CIK بـ 10 ملليلتر من PBS العقيم.جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق في 300 مرة G و 18 إلى 20 درجة مئوية. pirate عظمى و resuspend الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. عد أرقام الخلية واختبار صلاحية الخلية باستخدام اختبار استبعاد trypan الأزرق.Aliquot الخلايا CIK في ستة أنابيب 1.5 ملليلتر معقمة في كثافة ما يقرب من 5 إلى مليون خلية لكل ملليلتر من برنامج تلفزيوني. تسمية الخلايا ومعالجتها كما هو مفصل في بروتوكول النص. خلط بلطف الخلايا CIK مع الأجسام المضادة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقمة ملليلتر واحد.احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 300 مرة G و 18 إلى 20 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، وpirate فائقة و resuspend بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، ثم الماصات بلطف الخلايا صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقم ملليلتر واحد.نقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقمة خمسة ملليلتر البوليسترين جولة أسفل مع غطاء مصفاة الخلية عن طريق الأنابيب بلطف من خلال الغطاء، ثم وضع الأنابيب على دائري في النظام. فتح تدفق برنامج تحليل القياسات البولية وإنشاء مجلد تجريبي، ثم انقر فوق زر العينة الجديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة. اسم الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص.لإنشاء نظام مبعثر الغسور للسكان الخلية CIK، أولاً حدد أنبوب واحد وانقر على زر مؤامرة نقطة لإنشاء مؤامرة FSCA SSCA. رسم بوابة مستطيل فوق مجموعة الخلايا بأكملها مع عتبة FSCA أكبر من 5000 لاستبعاد حطام الخلية. حدد FSCA FSCH المعلمة لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة مضلع حول جميع الخلايا الفردية.حدد العدد مقابل FITC-الاقتران CD3 والعد مقابل APC-مترافق CD56 المعلمة لمؤامرة المدرج التكراري الجديد. حدد فيتC-مترافق CD3 مقابل APC-مترافق CD56 المعلمة لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة رباعية أربعة لتحديد السكان الفرعية الأربعة. تسجيل البيانات من 20،000 خلية واحدة في كل عينة.انقر فوق الزر نموذج التحميل لتحليل نموذج عنصر تحكم فارغ أولاً. تعريف مجموعة خلايا CIK بأكملها باستخدام معلمات قناة CD56 و CD3. افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية للعينة الفردية لتحليل مجموعات خلايا CIK وإعادة طباعتها في ملفات التحليل.لأداء فحص السامة للخلايا، CIK تربية ثانية والبشرية المزمنة سرطان الدم النخاعي K562 الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من الخلايا K562 إلى كل بئر في لوحة ستة جيدا في كثافة 5 ملايين خلية لكل ملليلتر، ثم إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة القاعدية مع أو بدون خلايا CIK إلى لوحة ستة جيدا كما هو مبين في بروتوكول النص. خلط تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا على الأقل ثلاث مرات. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 24 ساعة.الآن، CIK coculture والخلايا OC-3 المبيض عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة القاعدية مع أو بدون خلايا CIK إلى لوحة ستة جيدا كما هو مبين في بروتوكول النص. خلط تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا على الأقل ثلاث مرات. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 24 ساعة.بعد الحضانة، وحصاد CIK K562 تعليق الخلية مباشرة في أنبوب معقم 15 ملليلتر. لحصاد كل من خلايا التعليق والالتزام من مجموعات CIK OC-3، قم أولاً بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 15 ملليلتر. غسل البئر مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة، وجمع برنامج تلفزيوني، وإضافته إلى الأنبوب، ثم إضافة 5 ملليلتر من محلول انزيم تفكك الخلايا واحتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.إضافة ملليلتر واحد من المحلل من نفس الأنبوب إلى البئر المقابلة، وخلط بلطف الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقمة ملليلتر واحد. جمع كل الخلايا في نفس الأنبوب. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة 10 دقائق.استلهمت من فوق ونعيد الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم. بيليه الخلايا في 300 مرة G لمدة 10 دقائق، ثم الpireate فائقة و resuspend الخلايا في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. إضافة خمسة microliters من صبغة 7-AAD إلى تعليق الخلية.خلط بلطف الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقمة ملليلتر واحد. احتضان لمدة 10 دقائق وترك في الظلام قبل التحليل. لإجراء فحص القدرة الخلوية ، اخلط تعليق الخلية وكرر التحضير لعملية استئصال الخلايا المتدفقة.انقر فوق زر العينة الجديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة. اسم الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص. لإنشاء نظام مبعثر جسور للمكاصيرية، أولاً حدد أنبوب واحد وانقر على زر مؤامرة نقطة لإنشاء مؤامرة FSCA SSCA.رسم بوابة مستطيل على جميع الأحداث مع عتبة FSCA أكبر من 50،000 لاستبعاد حطام الخلية. حدد المعلمة CFSE SSCA لمؤامرة نقطة جديدة، ثم حدد المعلمة CFSE 7-AAD لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة رباعية أربعة لتحديد الـ 4 الـ 1000. انقر فوق الزر نموذج التحميل لتحليل نموذج عنصر تحكم فارغ أولاً.ضبط الجهد من SSCA و FSCA. تحديد عدد الخلايا الميتة باستخدام معلمات قناة CFSE و 7-AAD. تسجيل البيانات من أكبر من 20،000 الخلايا الإيجابية CFSE في كل عينة.افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية لكل عينة على حدة لتحليل مجموعات الخلايا غير القابلة للحياة، ثم تصدير البيانات إلى ملفات التحليل. تظهر النتائج التمثيلية لاستراتيجية البوابات لتحليل السكان الفرعيين للخلايا T-الإيجابية CD-3 إيجابية CD56 من المتبرعين الأصحاء مع التحليل الإحصائي لنسبة CIK من ثلاثة أفراد. زادت نسبة الخلايا الإيجابية CD56 إيجابية CD-3 بشكل ملحوظ بعد 14 يوما من التوسع.وهذا واضح من خلال 65٪ لBBMC الأصلي الذي زاد إلى 27.4٪ للخلايا CIK التي تم حصادها في اليوم 14. في هذا النظام الثقافي، أسفرت خلايا CIK عن حوالي نصف مائة مرة من التغييرات مقارنة مع العدد الأصلي من PBMCs. كانت تلطخت خلايا K562 مع CFSE صبغة غير فلورية، والتي هي مشقوق من قبل استراس داخل الخلايا داخل الخلايا القابلة للحياة ويصبح صبغة فلورية عالية.يتم توضيح حجم و حبيبي الخلايا الإيجابية CIK و CFSE. وقد تم علاج خلايا K562 الملطخة بـ CFSE مع خلايا CIK بنسبة صفر إلى واحد وخمسة إلى واحد و10 إلى واحد. كانت هذه الخلايا ملطخة بصبغة 7 AAD كمسبار قابل للتطبيق لاستبعاد الخلايا الميتة.تم تقييم الخلايا الإيجابية 7-AAD من خلايا CSE إيجابية K562. وقد تم علاج خلايا OC-3 الملطخة بـ CFSE مع خلايا CIK بنسبة 10 إلى واحد. يظهر السمية الخلوية الواضحة لـ CIK ضد خلايا OC-3 هنا بعد 24 ساعة من الحضانة.وقد أفيد CIK الخلايا التائية لممارسة آثار السامة للخلايا كبيرة ضد الخلايا السرطانية والحد من الآثار السلبية للجراحة, الإشعاع, والعلاج الكيميائي في علاجات السرطان. العلاج المناعي هو علاج واعد لعدد من أنواع السرطان. يمكن توسيع CIK بكفاءة في المختبر عن طريق احتضان PMBCs المشتقة من المريض في حالة GMP الصف لمزيد من التسريب الذاتي.بعد هذا البروتوكول، يمكننا تنفيذ العلاج الخلوي المناعي في منشأة من طراز GTP أو GMP لمزيد من العلاج السريري للسرطان.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

جيل وعزل الخلايا القبض على دورة الخلية مع كاريوتيبيس المعقدة

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

نموذج ماوس سينجينيك اللمفاوية ب-خلية للتقييم قبل الإكلينيكية لخلايا تي سيارة CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

إعداد اكسوسوميس ل siRNA إيصالها إلى "الخلايا السرطانية"

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

تصنيع مستقبلات مستضد تشياريك (CAR) خلايا T للعلاج المناعي بالتبني

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

باستخدام الإنسان المستحثة الخلايا الجذعية مستحث لتوليد خلايا T الأورام مستضد محدده

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

توليد أورام البنكرياس التقويمية وتوصيف الجسم السابق للخلايا التي تتسلل إلى الخلايا T

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

عزل خلايا الدم الطرفية البشرية أحادية النواة والخلايا التائية CD4+ من مرضى متلازمة سيزاري للتنميط النسخي

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

طريقة تمدد الخلايا القاتلة الطبيعية (NK) و CAR-NK باستخدام خط الخلية B المعدل بالغشاء IL-21

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

توسيع وإثراء الخلايا التائية من منتج بشري غير مشفر

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

توليد وتوسيع خطوط ورم المتوسطة الجنبي الأولي الخبيث

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...