Name: isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment
Uploaded: 2020-01-24T14:00:00
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Cette étude a été soutenue par le China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).

Le protocole clinique a été exécuté et approuvé conformément aux lignes directrices du Comité d'examen institutionnel de l'Université médicale de Chine et du Comité d'éthique de la recherche hospitalière. Des échantillons de sang périphériques ont été prélevés auprès de volontaires en bonne santé avec leur consentement éclairé.
1. Préparation des matériaux
<ol><li>Stockez les réactifs, les anticorps et les produits chimiques comme le montre la fiche de données sur ...

<ol>
	<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors:+The+paradigm+of+Cytokine-Induced+Killer+(CIK)+cells.">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).</li><li>Schmidt-Wolf, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+large+numbers+of+T+cells+with+natural+killer+cell+markers.">Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers.</a> British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).</li><li>Grainger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+in+Hematological+Malignancies.">Wnt Signaling in Hematological Malignancies.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+combined+PD-L1/PD-1+blockade+with+cytokine-induced+killer+cells+as+a+synergistic+immunotherapy+for+gastrointestinal+cancer.">Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer.</a> Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).</li><li>Schmidt-Wolf, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+SCID+mouse/human+lymphoma+model+to+evaluate+cytokine-induced+killer+cells+with+potent+antitumor+cell+activity.">Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity.</a> TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).</li><li>Introna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+massive+expansion+of+cord+blood-derived+cytokine-induced+killer+cells:+an+innovative+proposal+for+the+treatment+of+leukemia+relapse+after+cord+blood+transplantation.">Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).</li><li>Schmeel, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+cancer+immunotherapy:+report+of+the+international+registry+on+CIK+cells+(IRCC).">Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC).</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).</li><li>Rutella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+with+cytokine-induced+killer+cells+generated+with+a+new+good+manufacturing+practice-grade+protocol.">Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol.</a> Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).</li><li>Nausch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+in+tumor+immunity.">NKG2D ligands in tumor immunity.</a> Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).</li><li>Gammaitoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+activity+of+cytokine-induced+killer+cells+against+autologous+metastatic+melanoma+including+cells+with+stemness+features.">Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features.</a> Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).</li><li>Rettinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+potential+of+interleukin-15-stimulated+cytokine-induced+killer+cells+against+leukemia+cells.">The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells.</a> Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+cytokine-induced+killer+cell+infusion+as+consolidation+after+nonmyeloablative+allogeneic+transplantation+for+myeloid+neoplasms.">Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).</li><li>Castiglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+killer+cells+produced+in+good+manufacturing+practices+conditions:+identification+of+the+most+advantageous+and+safest+expansion+method+in+terms+of+viability,+cellular+growth+and+identity.">Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).</li><li>Bonanno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoglobulin,+interferon-&#947;+and+interleukin-2+efficiently+expand+cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+clinical-grade+cultures.">Thymoglobulin, interferon-&#947; and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).</li><li>Iudicone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+enhances+cytokine+induced+killer+(CIK)+cytotoxic+potential+against+epithelial+cancer+cell+lines+via+an+innate+pathway.">Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway.</a> Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+anticancer+capacity+of+CD8++cytokine-induced+killer+cells+after+antigen-induced+expansion.">Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion.</a> PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+cells+as+a+feasible+adoptive+immunotherapy+for+the+treatment+of+lung+cancer.">Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 366 (2018).</li><li>Tario, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+proliferation+by+dye+dilution:+considerations+for+probe+selection.">Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).</li><li>Last'ovicka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+natural+killer+cells+in+tamarins:+a+technical+basis+for+studies+of+innate+immunity.">Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity.</a> Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).</li></ol>

La méthode décrite est un protocole rapide, pratique et fiable pour l'isolement et l'expansion des cellules T cytotoxiques induites par la cytokine (CIK) à partir d'échantillons de sang entier de donneurs sains. Il montre également l'effet cytotoxique de CIK contre la leucémie (K562) et les cellules cancéreuses ovariennes (OC-3) à l'aide d'un système de configuration et de suivi de la cytométrie du débit (CS et T). Les cellules CIK peuvent être induites et étendues dans de bonnes pratiques manuusines (GMP) c...

Les lymphocytes T cytotoxiques sont une population spécifique de cellules d'effetmor immunitaire qui médiatise les réponses immunitaires contre le cancer. Plusieurs populations de cellules effectrices, y compris les cellules tueuses activées par la lymphokine (LAK), les lymphocytes infiltrants par tumeur (TL), les cellules tueuses naturelles (NK), les lymphocytes T et les cellules tueuses induites par la cytokine (CIK) ont été développées à des fins de thérapie cellulaire T (ACT)adoptive1. Il y a un intérêt croissant pour les cellules CIK, parce qu'elles représentent un mélange des populations cytotoxiques cytotoxiques cytokine-induites s'est développée des cellules mononucléaires périphériques autologues de sang (PMBCs)2.
La croissance incontrôlée des cellules progénitrices lymphoïdes, des myéloblastes et des lymphoblastes mène à trois principaux types de cancers du sang (c.-à-d. leucémie, lymphome et myélome), tumeurs solides, y compris les carcinomes (p. ex. cancer du poumon, cancer gastrique, cancer du col de l'utérus) et sarcomes, entre autres cancers3. Les cellules CIK sont un mélange de populations cellulaires qui présentent un large éventail de complexe d'histocompatibilité majeure (MHC) - activité antitumorale sans restriction et sont donc prometteuses pour le traitement des tumeurs hématologiques et avancées4,5,6,7. Les cellules CIK comprennent une combinaison de cellules, y compris les lymphocytes T, y compris les lymphocytes T(CD3etCD56), les cellules NK-T (CD3etCD56) et les cellules NK (CD3etCD56). L'optimisation du protocole d'induction CIK par l'utilisation d'un calendrier fixe pour l'ajout d'anticorps IFN, anti-CD3 et IL-2, entraîne l'expansion des cellules CIK8. La capacité cytotoxique des cellules de CIK contre des cellules cancéreuses dépend principalement de l'engagement du membre d'un groupe de NK 2 D (un membre de la famille de récepteurs de type C de lectine)NKG2D sur des cellules de tumeur, et sur des voies perforin-négociées9. Les résultats d'une étude préclinique ont indiqué que les cellules CIK IL-15-stimulées ont induit la cytotoxicité puissante contre les lignes primaires et aigues de cellules de leucémie myéloïde in vitro et ont montré une alloreactivity inférieure contre pbMCs normal et fibroblastes9. Récemment, les résultats de l'infusion de CIK untemps sain de donneur-dérivé (1 x 108/kg CD3- cellules) comme consolidation suivant la transplantation allogeneic nonmyeloablative pour le traitement myéloïde de néoplasmes dans une étude clinique de phase II a été édité10.
Dans la présente étude, nous avons développé une formule optimisée de culture cellulaire composée d'IFN-, d'IL-1, d'anticorps anti-CD3 et d'IL-2 ajoutés au milieu hématopoïétique de cellules pour augmenter la production de CIK, et avons étudié l'effet cytotoxique des cellules de CIK contre le milieu chronique humain cellules de leucémie myéloïde (K562) et cellules de cancer de l'ovaire (OC-3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-Amino Actinomycin D</td>
			<td>BD</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD56 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555518</td>
			<td>B159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555751</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
			<td>SN: R33896202856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>BD</td>
			<td>565082</td>
			<td></td>
			<td>Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
			<td>For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.02</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for OC-3 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
			<td>For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>71101700-EK</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555332</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555748</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-CD3 mAb</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T210</td>
			<td>OKT3</td>
			<td>Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin</td>
			<td>NOVARTIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of Proleukin Powder (22x106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interferon-gamma</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>1425-050</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of rh IFN-g (5x105 IU/50 &#181;g) with 200 &#181;L of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-1 alpha</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>200-01A</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution rh IL-1&#945; (10 &#181;g) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 3-18K Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10295</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
			<td>Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment

L'immunothérapie cellulaire adoptive se concentre sur la restauration de la reconnaissance du cancer par l'intermédiaire du système immunitaire et améliore l'abattage efficace des cellules tumorales. La thérapie de cellules T induite par Cytokine (CIK) a été rapportée pour exercer des effets cytotoxiques significatifs contre des cellules cancéreuses et pour réduire les effets défavorables de la chirurgie, de la radiothérapie, et de la chimiothérapie dans des traitements de cancer. CiK peut être dérivé des cellules mononucléaires périphériques de sang (PBMCs), de la moelle, et du sang de cordon ombilical. Les cellules CIK sont une sous-population hétérogène de lymphocytes T avec cD3-CD56- et les caractéristiques phénotypiques du tueur naturel (NK) qui incluent le complexe d'histocompatibilité majeur (MHC) -activité antitumorale sans restriction. Cette étude décrit une méthode qualifiée, cliniquement applicable, basée sur la cytométrie de flux pour la quantification de la capacité cytolytique des cellules CIK dérivées de PBMC contre les cellules cancéreuses hématologiques et solides. Dans l'assay cytolytique, les cellules CIK sont co-incubées à différents rapports avec les cellules tumorales cibles présatyables. Après la période d'incubation, le nombre de cellules cibles est déterminé par une tache liant l'acide nucléique pour détecter les cellules mortes. Cette méthode s'applique à la fois aux applications de recherche et de diagnostic. Les cellules ciK possèdent la cytotoxicité puissante qui pourrait être explorée comme stratégie alternative pour le traitement de cancer sur son évaluation préclinique par une configuration et suivi de cytomètre (CS et T)-basé système de cytométrie de flux.

Le but du protocole actuel est d'isoler et d'étendre les cellules T de tueur induite par la cytokine (CIK) des monocytes périphériques de sang et d'évaluer l'effet cytotoxique de CIK contre la malignité hématologique et les cellules cancéreuses pleines, respectivement. L'induction de CIK a été identifiée par la reconnaissance CD3/CD56. La figure 1A montre le protocole d'induction et d'expansion du CIK. Les résultats représentatifs de la stratégie de gating pour ...

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Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Ici, nous présentons un protocole pour exécuter l'isolement et l'expansion des cellules mononucléaires périphériques mononucléaires CD3-CD56- cellules tueuses et pour illustrer leur effet de cytotoxicité contre les cellules cancéreuses hématologiques et solides en utilisant un système de cytométrie de flux de diagnostic in vitro.

Isolement et expansion des cellules T tueuses cytotoxiques induites par Cytokine pour le traitement du cancer

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Nous avons optimisé une méthode hautement qualifiée et cliniquement applicable pour l’expansion des lymphocytes T tueurs cytokine-induits par PBMC-dérivés et pour l’évaluation de leur cytotoxicité contre des cancers. L’avantage de cette technique est de fournir une procédure d’exploitation standard pour les techniciens et les cliniciens afin de quantifier la puissance des cellules tueuses induites par la cytokine dans la recherche scientifique et l’évaluation clinique. Commencez cette procédure par une préparation des cellules CIK telle que décrite dans le protocole de texte, puis lavez les cellules CIK avec 10 millilitres de PBS stérile.Centrifugeuse pendant 10 minutes à 300 fois G et 18 à 20 degrés Celsius. Aspirer le supernatant et résusquer les cellules avec cinq millilitres de PBS. Comptez les numéros de cellule et testez la viabilité des cellules à l’aide de l’analyse d’exclusion bleue trypan.Aliquot les cellules CIK en six tubes de stérilisation de 1,5 millilitre à une densité d’environ 5 à un million de cellules par millilitre de PBS. Étiquetez et traitez les cellules comme détaillées dans le protocole textuel. Mélanger délicatement les cellules CIK avec les anticorps en pipetting doucement de haut en bas au moins trois fois avec une pipette de stérilisation d’un millilitre.Incuber les cellules pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Centrifuger les tubes pendant 10 minutes à 300 fois G et 18 à 20 degrés Celsius. Après centrifugation, aspirer le supernatant et résusquer la pastille cellulaire avec un millilitre de PBS, puis pipette doucement les cellules de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile d’un millilitre.Transférer la suspension cellulaire dans un tube de fond rond stérile de cinq millilitres en polystyrène avec un bouchon de passoire cellulaire en traversant doucement le bouchon, puis placez les tubes sur le carrousel dans l’ordre. Ouvrez le logiciel d’analyse de cytométrie de flux et créez un dossier expérimental, puis cliquez sur le nouveau bouton spécimen pour ajouter un spécimen et un tube à l’expérience. Nommez les tubes comme indiqués dans le protocole texte.Pour créer un système de diffusion pour les populations de cellules CIK, sélectionnez d’abord le tube un et cliquez sur le bouton de diagramme de point pour créer une parcelle FSCA SSCA. Dessinez une porte rectangle sur toute la population cellulaire avec un seuil FSCA supérieur à 5000 pour exclure les débris cellulaires. Sélectionnez le paramètre FSCA FSCH pour la nouvelle parcelle à points et dessinez une porte polygone autour de toutes les cellules individuelles.Sélectionnez le compte par rapport au CD3 conjugué fitc et comptez par rapport au paramètre CD56 conjugué par APC pour la nouvelle parcelle d’histogramme. Sélectionnez le paramètre CD56 conjugué fitc par rapport au CD56 conjugué à l’APC pour la nouvelle parcelle à points et dessinez une porte de quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations. Enregistrez les données de 20 000 cellules individuelles dans chaque spécimen.Cliquez d’abord sur le bouton de l’échantillon de charge pour analyser l’échantillon de contrôle vierge. Identifiez l’ensemble de la population de cellules CIK en utilisant les paramètres du canal CD56 et CD3. Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques du spécimen individuel pour analyser les populations de cellules CIK et les réimprimer dans des fichiers d’analyse.Pour effectuer l’analyse cytotoxique, la coculture CIK et la leucémie myéloïde chronique humaine K562 cellules en ajoutant un millilitre de cellules K562 à chaque puits dans une plaque de six puits à une densité de 5 millions de cellules par millilitre, puis ajouter un millilitre de milieu basal avec ou sans cellules CIK à la plaque de six puits comme indiqué dans le protocole texte. Mélangez les suspensions cellulaires en faisant monter et descendre doucement au moins trois fois. Placer la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures.Maintenant, coculture CIK et ovariens OC-3 cellules en ajoutant un millilitre de milieu basal avec ou sans cellules CIK à la plaque de six puits comme indiqué dans le protocole de texte. Mélangez les suspensions cellulaires en faisant monter et descendre doucement au moins trois fois. Mettre la plaque dans l’incubateur pendant 24 heures.Après incubation, récolter la suspension cellulaire CIK K562 directement dans un tube stérile de 15 millilitres. Pour récolter les cellules de suspension et d’adhérence des groupes CIK OC-3, transférez d’abord la suspension cellulaire dans un tube stérile de 15 millilitres. Lavez le puits avec un millilitre de Stéril PBS, recueillir le PBS, et l’ajouter au tube, puis ajouter 5 millilitres de solution enzymatique de dissociation cellulaire et incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.Ajouter un millilitre de la solution du même tube au puits correspondant, et mélanger délicatement les cellules en pipetting de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile d’un millilitre. Recueillir toutes les cellules dans le même tube. Centrifugeuse à 300 fois G pendant 10 minutes.Aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en un millilitre de PBS stérile. Pelleter les cellules à 300 fois G pendant 10 minutes, puis aspirer le supernatant et resuspendre les cellules en 100 microlitres de PBS stérile. Ajouter cinq microlitres de colorant 7-AAD à la suspension cellulaire.Mélanger délicatement les cellules en pipetant de haut en bas au moins trois fois avec une pipette stérile d’un millilitre. Incuber pendant 10 minutes et laisser dans l’obscurité avant l’analyse. Pour effectuer l’analyse de la capacité cytolytique, mélanger la suspension cellulaire et répéter la préparation pour la cytométrie d’écoulement.Cliquez sur le nouveau bouton spécimen pour ajouter un spécimen et un tube à l’expérience. Nommez les tubes comme indiqués dans le protocole texte. Pour créer un système de diffusion pour l’analyse cytolytique, sélectionnez d’abord le tube un et cliquez sur le bouton de diagramme de point pour créer une parcelle FSCA SSCA.Dessinez une porte rectangle sur tous les événements avec un seuil FSCA supérieur à 50 000 pour exclure les débris cellulaires. Sélectionnez le paramètre SSCA CFSE pour la nouvelle parcelle à points, puis sélectionnez le paramètre CFSE 7-AAD pour la nouvelle parcelle à points et dessinez une porte de quatre quadrants pour définir les quatre sous-populations. Cliquez d’abord sur le bouton de l’échantillon de charge pour analyser l’échantillon de contrôle vierge.Réglez la tension de SSCA et FSCA. Identifiez la population de cellules mortes en utilisant les paramètres du canal CFSE et 7-AAD. Enregistrez les données de plus de 20 000 cellules positives cfse dans chaque spécimen.Ouvrez les fichiers contenant les valeurs statistiques de chaque spécimen individuel pour analyser les populations de cellules non viables et exporter les données dans des fichiers d’analyse. Les résultats représentatifs de la stratégie de gating pour analyser la sous-population de CD-3 positifs CD56 t-cells de donneurs sains sont montrés avec l’analyse statistique de la proportion de CIK de trois individus. La proportion positive de cellules CD56 CD-3 a augmenté de façon significative après 14 jours d’expansion.Cela est évident à travers les 65% pour le PBMC d’origine qui a augmenté à 27,4% pour les cellules CIK récoltées le jour 14. Dans ce système de culture, les cellules CIK ont produit environ une demi-centaine de changements par rapport au nombre original de PBMCs. Les cellules K562 ont été tachées d’un colorant non fluorescent CFSE, qui est fendu par des estérases intracellulaires dans les cellules viables et devient un colorant très fluorescent.La taille et la granularité des cellules CIK et CFSE-positives sont illustrées. Les cellules K562 tachées de CFSE ont été co-traitées avec des cellules de CIK à un rapport de zéro à un, cinq pour un, et 10 à un. Ces cellules ont été souillées avec le colorant de 7-AAD comme sonde de viabilité pour l’exclusion de cellules mortes.Les cellules positives 7-AAD des cellules K562 positives de CFSE ont toutes été évaluées. Les cellules OC-3 tachées de CFSE ont été co-traitées avec des cellules de CIK à un rapport de 10 pour un. La cytotoxicité évidente du CIK contre les cellules OC-3 est démontrée ici après 24 heures d’incubation.On a signalé que les lymphocytes T CIK exercent des effets cytotoxiques importants contre les cellules cancéreuses et réduisent les effets néfastes de la chirurgie, de la radiothérapie et de la chimiothérapie dans les traitements contre le cancer. L’immunothérapie est un traitement prometteur pour un certain nombre de cancers. Le CIK peut être augmenté efficacement in vitro par incubation de PMBCs patients-dérivés dans l’état de GMP-grade pour davantage d’infusion autologue.Suivant ce protocole, nous pourrions exécuter la thérapie cellulaire immunisée dans un établissement gtp-ou GMP-grade pour davantage de traitement clinique de cancer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Génération et l’isolement des cellules Cycle cellulaire-arrêté avec caryotypes complexes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Recherche

Recherche en cancérologie

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modèle de lymphome de B-cellule souris syngénique pour évaluation préclinique des cellules de T de voiture CD19

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Préparation des Exosomes des siARN livraison aux cellules cancéreuses

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Fabrication de cellules T de récepteur d'antigène chimérique (CAR) pour l'immunothérapie adoptive

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilisation de cellules souches pluripotentes induites par l'homme pour la génération de lymphocytes T spécifiques à l'antigène tumoral

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Génération de tumeurs pancréatiques orthopiques et caractérisation ex vivo de la cytotoxicité des cellules T infiltrantes

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isoler les cellules mononucléaires du sang périphérique humain et les lymphocytes T CD4+ de patients atteints du syndrome de Sézary pour le profilage transcriptomique

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

TUEUR NATUREL (NK) ET PROCÉDÉ D’EXPANSION CELLULAIRE CAR-NK UTILISANT UNE LIGNÉE CELLULAIRE B MODIFIÉE PAR UNE LIGNÉE CELLULAIRE B LIÉE À LA MEMBRANE

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Expansion et enrichissement des lymphocytes T gamma-delta (γδ) à partir d’un produit humain aphéré

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Génération et expansion de lignées tumorales de mésothéliome pleural malin primitif

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...