Name: isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment
Uploaded: 2020-01-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Questo studio è stato supportato dal China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).

Il protocollo clinico è stato eseguito e approvato in conformità con le linee guida del Institutional Review Board della China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Gli esemplari di sangue periferico sono stati raccolti da volontari sani con il loro consenso informato.
1. Preparazione dei materiali
<ol><li>Conservare reagenti, anticorpi e sostanze chimiche, come mostrato nella scheda dati sulla sicurezza dei materiali (MSDS). Sciogliere i farmaci o le citochine nei sol...

<ol>
	<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors:+The+paradigm+of+Cytokine-Induced+Killer+(CIK)+cells.">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).</li><li>Schmidt-Wolf, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+large+numbers+of+T+cells+with+natural+killer+cell+markers.">Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers.</a> British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).</li><li>Grainger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+in+Hematological+Malignancies.">Wnt Signaling in Hematological Malignancies.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+combined+PD-L1/PD-1+blockade+with+cytokine-induced+killer+cells+as+a+synergistic+immunotherapy+for+gastrointestinal+cancer.">Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer.</a> Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).</li><li>Schmidt-Wolf, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+SCID+mouse/human+lymphoma+model+to+evaluate+cytokine-induced+killer+cells+with+potent+antitumor+cell+activity.">Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity.</a> TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).</li><li>Introna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+massive+expansion+of+cord+blood-derived+cytokine-induced+killer+cells:+an+innovative+proposal+for+the+treatment+of+leukemia+relapse+after+cord+blood+transplantation.">Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).</li><li>Schmeel, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+cancer+immunotherapy:+report+of+the+international+registry+on+CIK+cells+(IRCC).">Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC).</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).</li><li>Rutella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+with+cytokine-induced+killer+cells+generated+with+a+new+good+manufacturing+practice-grade+protocol.">Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol.</a> Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).</li><li>Nausch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+in+tumor+immunity.">NKG2D ligands in tumor immunity.</a> Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).</li><li>Gammaitoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+activity+of+cytokine-induced+killer+cells+against+autologous+metastatic+melanoma+including+cells+with+stemness+features.">Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features.</a> Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).</li><li>Rettinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+potential+of+interleukin-15-stimulated+cytokine-induced+killer+cells+against+leukemia+cells.">The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells.</a> Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+cytokine-induced+killer+cell+infusion+as+consolidation+after+nonmyeloablative+allogeneic+transplantation+for+myeloid+neoplasms.">Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).</li><li>Castiglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+killer+cells+produced+in+good+manufacturing+practices+conditions:+identification+of+the+most+advantageous+and+safest+expansion+method+in+terms+of+viability,+cellular+growth+and+identity.">Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).</li><li>Bonanno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoglobulin,+interferon-&#947;+and+interleukin-2+efficiently+expand+cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+clinical-grade+cultures.">Thymoglobulin, interferon-&#947; and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).</li><li>Iudicone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+enhances+cytokine+induced+killer+(CIK)+cytotoxic+potential+against+epithelial+cancer+cell+lines+via+an+innate+pathway.">Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway.</a> Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+anticancer+capacity+of+CD8++cytokine-induced+killer+cells+after+antigen-induced+expansion.">Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion.</a> PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+cells+as+a+feasible+adoptive+immunotherapy+for+the+treatment+of+lung+cancer.">Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 366 (2018).</li><li>Tario, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+proliferation+by+dye+dilution:+considerations+for+probe+selection.">Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).</li><li>Last'ovicka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+natural+killer+cells+in+tamarins:+a+technical+basis+for+studies+of+innate+immunity.">Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity.</a> Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).</li></ol>

Il metodo descritto è un protocollo veloce, conveniente e affidabile per l'isolamento e l'espansione di cellule T killer citotototossiche indotte da citotozi (CIK) da campioni di t di donatori sani. Mostra anche l'effetto citotossico del CIK contro la leucemia (K562) e le cellule tumorali ovariche (OC-3) utilizzando un sistema di localizzazione e tracciamento della citometria a flusso (CS & T). Le cellule CIK possono essere indotte ed espanse in buone pratiche manufactoryli (GMP) utilizzando citochine di grado GMP e mez...

I linfociti Citotossici sono una popolazione specifica di cellule eretritarie immunitarie che mediano le risposte immunitarie contro il cancro. Diverse popolazioni di cellule efleganti, tra cui cellule killer attivate da linfocini (LAK), linfociti infiltrati di tumore (TIL), cellule NK , cellule di z T, e cellule killer indotta da citochine (CIK) sono stati sviluppati per scopi di terapia at-cellule adottivi (ACT)1. C'è un crescente interesse per le cellule CIK, perché rappresentano una miscela di popolazioni di cellule citototossiche indotte da citochine espanse da cellule mononucleari del sangue periferico autologhe (PMBC)2.
La crescita incontrollata di cellule progenitrici linfoidi, mieloblasti e linfoblasti porta a tre principali tipi di tumori del sangue (ad esempio leucemia, linfoma e mieloma), tumori solidi, tra cui carcinomi (ad esempio, cancro del polmone, cancro gastrico, cancro cervicale) e sarcomi, tra gli altri cancri3. Le cellule CIK sono una miscela di popolazioni cellulari che presentano una vasta gamma di attività antitumorali unrestricted complex (MHC) -unrestricted e quindi promettono per il trattamento dei tumori ematologici e avanzati4,5,6,7. Le celle CIK sono costituite da una combinazione di celle, tra cui le celle T (CD3,CD56),le cellule NK-T (CD3,CD56) e le cellule NK (CD3–CD56). L'ottimizzazione del protocollo di induzione del CIK mediante l'uso di un programma fisso per l'aggiunta di anticorpi IFN-z, anti-CD3 e IL-2, comporta l'espansione delle cellule CIK8. La capacità citototossica delle cellule CIK contro le cellule tumorali dipende principalmente dall'impegno del membro D del gruppo NK 2 (un membro della famiglia di recettori simili alla lectina di tipo C) ligando NKG2D sulle cellule tumorali e sulle vie mediate da perforina9. I risultati di uno studio preclinico hanno rivelato che le cellule CIK stimolate da IL-15 hanno indotto la potente citotossicità potente contro le linee cellulari della leucemia mieloide primaria e acuta in vitro e hanno mostrato una minore alloreattività contro i normali PBMC e i fibroblasti9. Recentemente, è stato pubblicato il risultato dell'infusione di CIK (1 x 108/kg dicellule CD3) come consolidamento a seguito del trapianto allogeneico non mieloablativo per il trattamento dei neoplasmi mieloidi in uno studio clinico di fase II.
Nel presente studio, abbiamo sviluppato una formula di coltura cellulare ottimizzata composta da ifN-z, IL-1, anticorpi anti-CD3, e IL-2 aggiunto al mezzo cellulare ematopoietico per aumentare la produzione di CIK, e studiato l'effetto citotossico delle cellule CIK contro le malattie umane croniche leucemia mieloide (K562) cellule e cellule tumorali ovariche (OC-3).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-Amino Actinomycin D</td>
			<td>BD</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD56 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555518</td>
			<td>B159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555751</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
			<td>SN: R33896202856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>BD</td>
			<td>565082</td>
			<td></td>
			<td>Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
			<td>For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.02</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for OC-3 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
			<td>For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>71101700-EK</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555332</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555748</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-CD3 mAb</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T210</td>
			<td>OKT3</td>
			<td>Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin</td>
			<td>NOVARTIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of Proleukin Powder (22x106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interferon-gamma</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>1425-050</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of rh IFN-g (5x105 IU/50 &#181;g) with 200 &#181;L of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-1 alpha</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>200-01A</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution rh IL-1&#945; (10 &#181;g) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 3-18K Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10295</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
			<td>Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment

L'immunoterapia cellulare adottiva si concentra sul ripristino del riconoscimento del cancro tramite il sistema immunitario e migliora l'uccisione efficace delle cellule tumorali. La terapia con cellule T indotta da citochine (CIK) per esercitare effetti citotossici significativi contro le cellule tumorali e per ridurre gli effetti negativi della chirurgia, delle radiazioni e della chemioterapia nei trattamenti contro il cancro. Il CIK può essere derivato da cellule mononucleari periferiche del sangue (PBMC), midollo osseo e sangue del cordone ombelicale. Le cellule CIK sono una sottopopolazione eterogenea di cellule T con CD3-CD56e caratteristiche fenotipiche natural killer (NK) che includono l'attività antitumorale senza restrizioni del complesso di istocompatibilità (MHC). Questo studio descrive un metodo qualificato, clinicamente applicabile, basato sulla citometria di flusso per la quantificazione della capacità citolytica delle cellule CIK derivate da PBMC contro le cellule tumorali ematologiche e solide. Nel saggio citolitico, le cellule CIK sono co-incubate a diversi rapporti con cellule tumorali bersaglio prestainte. Dopo il periodo di incubazione, il numero di cellule bersaglio è determinato da una macchia legante acido nucleico per rilevare le cellule morte. Questo metodo è applicabile sia alle applicazioni di ricerca che a quella diagnostica. Le cellule CIK possiedono una potente citotossicità che potrebbe essere esplorata come strategia alternativa per il trattamento del cancro dopo la sua valutazione preclinica da parte di un sistema di citometria basato su citometro (CS & T).

Lo scopo del presente protocollo è quello di isolare ed espandere le cellule T killer indotte da citochine (CIK) dai monociti del sangue periferici e valutare l'effetto citotossico del CIK contro la malignità ematologica e le cellule tumorali solide, rispettivamente. L'induzione del CIK è stata identificata dal riconoscimento CD3/CD56. Figura 1A mostra il protocollo per l'induzione e l'espansione CIK. I risultati rappresentativi della strategia di gating per l'analisi del...

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Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire l'isolamento e l'espansione delle cellule mononucleari periferiche derivate dalle cellule citochine- indotte CD3-CD56- cellule killer e illustrare il loro effetto di citotossicità contro le cellule tumorali ematologiche e solide utilizzando un sistema di citometria di flusso di diagnosi invitro.

Isolamento ed espansione delle cellule T Killer citotokine indotte da citokine per il trattamento del cancro

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Abbiamo ottimizzato un metodo altamente qualificato e clinicamente applicabile per l'espansione delle cellule T killer indotte da citochine derivate da PBMC e per la valutazione della loro citotossicità contro i tumori. Il vantaggio di questa tecnica è quello di fornire una procedura operativa standard per tecnici e medici per quantificare la potenza delle cellule killer indotte da citochine sia nella ricerca scientifica che nella valutazione clinica. Iniziare questa procedura con una preparazione di cellule CIK come descritto nel protocollo di testo, quindi lavare le cellule CIK con 10 millilitri di PBS sterile.Centrifugare per 10 minuti a 300 volte G e da 18 a 20 gradi Celsius. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule con cinque millilitri di PBS. Contare i numeri di cella e testare la vitalità della cella utilizzando il test di esclusione blu del trypan.Aliquote le cellule CIK in sei tubi steril da 1,5 millilitri ad una densità di circa 5-1 milioni di cellule per millilitro di PBS. Etichettare e trattare le celle come dettagliate nel protocollo di testo. Mescolare delicatamente le cellule CIK con gli anticorpi tubazionando delicatamente su e giù almeno tre volte con una pipetta steril da un millilitro.Incubare le cellule per 15 minuti a temperatura ambiente al buio. Centrifuga i tubi per 10 minuti a 300 volte G e da 18 a 20 gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare con un millilitro di PBS, quindi pipettare delicatamente le cellule su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da un millilitro.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo inferiore rotondo sterile in polistirolo a cinque millilitri con un tappo del filtro cellulare tubazionando delicatamente attraverso il cappuccio, quindi posizionare i tubi sul carosello in ordine. Aprire il software di analisi della citometria di flusso e creare una cartella sperimentale, quindi fare clic sul nuovo pulsante del campione per aggiungere un campione e un tubo all'esperimento. Assegnare ai tubi il nome elencato nel protocollo di testo.Per creare un sistema di gating a dispersione per le popolazioni di celle CIK, selezionare prima il tubo uno e fare clic sul pulsante del grafico a punti per creare un plottaggio FSCA SSCA. Disegnare un cancello rettangolare sull'intera popolazione cellulare con una soglia FSCA maggiore di 5000 per escludere i detriti cellulari. Selezionate il parametro FSCA FSCH per il nuovo plottaggio punti e disegnate un cancello poligonale attorno a tutte le singole celle.Selezionare il conteggio rispetto al CD3 coniugato FITC e il parametro CD56 coniugato da APC per il nuovo grafico istogramma. Selezionate il parametro CD3 coniugato FITC rispetto al CD56 coniugato da APC per il nuovo plottaggio di punti e disegnate un cancello a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni. Registrare i dati da 20.000 singole celle in ogni campione.Fare clic sul pulsante di esempio di caricamento per analizzare prima l'esempio di controllo vuoto. Identificare l'intera popolazione di celle CIK utilizzando i parametri del canale CD56 e CD3. Aprire i file contenenti i valori statistici del singolo campione per analizzare le popolazioni di celle CIK e ristamparle in file di analisi.Per eseguire il saggio citotossico, la cocultura CIK e le cellule leucemia mieloide cronica umana K562 aggiungendo un millilitro di cellule K562 ad ogni pozzo in una piastra a sei pozzetti ad una densità di 5 milioni di cellule per millilitro, quindi aggiungere un millilitro di mezzo basale con o senza cellule CIK alla piastra a sei pozzi come elencato nel protocollo di testo. Mescolare le sospensioni cellulari tubazionando delicatamente su e giù almeno tre volte. Posizionare la piastra nell'incubatore per 24 ore.Ora, coculare cellule CIK e OC-3 ovarico aggiungendo un millilitro di mezzo basale con o senza cellule CIK alla piastra a sei pozzi come elencato nel protocollo di testo. Mescolare le sospensioni cellulari tubazionando delicatamente su e giù almeno tre volte. Metti la piastra nell'incubatrice per 24 ore.Dopo l'incubazione, raccogliere la sospensione cellulare CIK K562 direttamente in un tubo sterile da 15 millilitri. Per raccogliere sia le cellule di sospensione che di aderenza dai gruppi CIK OC-3, trasferire prima la sospensione cellulare in un tubo sterile da 15 millilitri. Lavare il pozzo con un millilitro di PBS steril, raccogliere il PBS e aggiungerlo al tubo, quindi aggiungere 5 millilitri di soluzione enzimatica di dissociazione cellulare e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Aggiungere un millilitro della soluzione dallo stesso tubo al pozzo corrispondente e mescolare delicatamente le cellule tubazioni su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da un millilitro. Raccogliere tutte le celle nello stesso tubo. Centrifuga a 300 volte G per 10 minuti.Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in un millilitro di PBS sterile. Pellettare le cellule a 300 volte G per 10 minuti, quindi aspirare il supernatante e rimescolare le cellule in 100 microlitri di PBS sterile. Aggiungere cinque microlitri di colorante 7-AAD alla sospensione cellulare.Mescolare delicatamente le cellule con pipettando su e giù almeno tre volte con una pipetta sterile da un millilitro. Incubare per 10 minuti e lasciare al buio prima dell'analisi. Per eseguire il test di capacità citolitica, mescolare la sospensione cellulare e ripetere la preparazione per la citometria del flusso.Fate clic sul nuovo pulsante campione per aggiungere un campione e un tubo all'esperimento. Assegnare ai tubi il nome elencato nel protocollo di testo. Per creare un sistema di gating a dispersione per il saggio citolitico, selezionare prima il tubo uno e fare clic sul pulsante del grafico a punti per creare un plottaggio FSCA SSCA.Disegnare un cancello rettangolare su tutti gli eventi con una soglia FSCA maggiore di 50.000 per escludere i detriti cellulari. Selezionate il parametro SSCA CFSE per il nuovo plottaggio punti, quindi selezionate il parametro CFSE 7-AAD per il nuovo plottaggio punti e disegnate un gate a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni. Fare clic sul pulsante di esempio di caricamento per analizzare prima l'esempio di controllo vuoto.Regolare la tensione di SSCA e FSCA. Identificare la popolazione di cellule morte utilizzando i parametri del canale CFSE e 7-AAD. Registrare i dati da più di 20.000 cellule positive CFSE in ogni campione.Aprire i file contenenti i valori statistici di ogni singolo campione per analizzare le popolazioni di celle non disponibili ed esportare i dati in file di analisi. I risultati rappresentativi della strategia di gating per l'analisi della sottopopolazione delle cellule T positive CD-3 CD56 da donatori sani sono mostrati con l'analisi statistica della proporzione CIK da tre individui. La proporzione positiva di cellule CD56 positive cd-3 è aumentata significativamente dopo 14 giorni di espansione.Ciò è evidente attraverso il 65% per il PBMC originale che è aumentato al 27,4% per le cellule CIK raccolte il giorno 14. In questo sistema di coltura, le cellule CIK hanno prodotto circa mezzo centinaio di cambiamenti di piega rispetto al numero originale di PBPC. Le cellule K562 sono state macchiate con un CFSE colorante non fluorescente, che viene scissi da esterases intracellulari all'interno di cellule vitali e diventa un colorante altamente fluorescente.Vengono illustrate le dimensioni e la granularità delle cellule cik e cfse-positive. Le cellule K562 macchiate di CFSE sono state co-trattate con cellule CIK con un rapporto di zero a uno, cinque a uno e 10 a uno. Queste celle sono state macchiate con colorante 7-AAD come sonda di vitalità per l'esclusione delle cellule morte.Le cellule positive 7-AAD delle cellule CFSE positive K562 sono state tutte valutate. Le celle OC-3 macchiate di CFSE sono state co-trattate con cellule CIK con un rapporto di 10 a uno. L'evidente citotossicità del CIK contro le cellule OC-3 è dimostrata qui dopo 24 ore di incubazione.È stato riferito che le cellule T CIK esercitano effetti citotossici significativi contro le cellule tumorali e riducono gli effetti avversi della chirurgia, delle radiazioni e della chemioterapia nei trattamenti contro il cancro. L'immunoterapia è un trattamento promettente per un certo numero di tumori. Il CIK può essere espanso in modo efficiente in vitro mediante incubazione di PC derivati dal paziente in condizioni di grado GMP per un'ulteriore infusione autologa.Seguendo questo protocollo, potremmo eseguire la terapia cellulare immunitaria in una struttura di grado GTP o GMP per ulteriori trattamenti clinici contro il cancro.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generazione e l'isolamento delle cellule ciclo cellulare-arrestato con Karyotypes complessi

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Un modello di linfoma della B-cellula Syngeneic del topo per la valutazione pre-clinica delle cellule di T di CD19 auto

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Preparazione degli esosomi per siRNA consegna alle cellule tumorali

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Produzione Chimeric Antigen Receptor (CAR) Cellule T per l'immunoterapia adottiva

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Utilizzo di cellule staminali pluripotenti indotte umane per la generazione di cellule T specifiche dell'antigene tumorale

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generazione di tumori pancreatici ortotopici e caratterizzazione ex vivo della citotossicità delle cellule T infiltranti di tumore

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico umano e delle cellule T CD4+ da pazienti con sindrome di Sézary per la profilazione trascrittomica

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Metodo di espansione cellulare Natural Killer (NK) e CAR-NK utilizzando la linea cellulare B modificata Membrane Bound-IL-21-Modified

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta &#947;&#948; T Cells from Apheresed Human Product

Espansione e arricchimento di cellule T Gamma-Delta (γδ) da prodotto umano afereso

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Non-Destructive Evaluation of Regional Cell Density Within Tumor Aggregates Following Drug Treatment

Valutazione non distruttiva della densità cellulare regionale all'interno degli aggregati tumorali dopo il trattamento farmacologico

Multicellular tumor spheroid (MCTSs) models have demonstrated increasing utility for in vitro study of cancer progression and drug discovery. These ...