Name: isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment
Uploaded: 2020-01-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Это исследование было поддержано больницей Китайского медицинского университета (DMR-Cell-1809).

Клинический протокол был выполнен и утвержден в соответствии с руководящими принципами Институционального наблюдательного совета Китайского медицинского университета и Комитета по этике исследований больниц. Образцы периферийной крови были собраны у здоровых добровольцев с их инф...

<ol>
	<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors:+The+paradigm+of+Cytokine-Induced+Killer+(CIK)+cells.">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).</li><li>Schmidt-Wolf, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+large+numbers+of+T+cells+with+natural+killer+cell+markers.">Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers.</a> British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).</li><li>Grainger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+in+Hematological+Malignancies.">Wnt Signaling in Hematological Malignancies.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+combined+PD-L1/PD-1+blockade+with+cytokine-induced+killer+cells+as+a+synergistic+immunotherapy+for+gastrointestinal+cancer.">Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer.</a> Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).</li><li>Schmidt-Wolf, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+SCID+mouse/human+lymphoma+model+to+evaluate+cytokine-induced+killer+cells+with+potent+antitumor+cell+activity.">Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity.</a> TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).</li><li>Introna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+massive+expansion+of+cord+blood-derived+cytokine-induced+killer+cells:+an+innovative+proposal+for+the+treatment+of+leukemia+relapse+after+cord+blood+transplantation.">Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).</li><li>Schmeel, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+cancer+immunotherapy:+report+of+the+international+registry+on+CIK+cells+(IRCC).">Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC).</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).</li><li>Rutella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+with+cytokine-induced+killer+cells+generated+with+a+new+good+manufacturing+practice-grade+protocol.">Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol.</a> Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).</li><li>Nausch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+in+tumor+immunity.">NKG2D ligands in tumor immunity.</a> Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).</li><li>Gammaitoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+activity+of+cytokine-induced+killer+cells+against+autologous+metastatic+melanoma+including+cells+with+stemness+features.">Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features.</a> Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).</li><li>Rettinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+potential+of+interleukin-15-stimulated+cytokine-induced+killer+cells+against+leukemia+cells.">The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells.</a> Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+cytokine-induced+killer+cell+infusion+as+consolidation+after+nonmyeloablative+allogeneic+transplantation+for+myeloid+neoplasms.">Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).</li><li>Castiglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+killer+cells+produced+in+good+manufacturing+practices+conditions:+identification+of+the+most+advantageous+and+safest+expansion+method+in+terms+of+viability,+cellular+growth+and+identity.">Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).</li><li>Bonanno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoglobulin,+interferon-&#947;+and+interleukin-2+efficiently+expand+cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+clinical-grade+cultures.">Thymoglobulin, interferon-&#947; and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).</li><li>Iudicone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+enhances+cytokine+induced+killer+(CIK)+cytotoxic+potential+against+epithelial+cancer+cell+lines+via+an+innate+pathway.">Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway.</a> Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+anticancer+capacity+of+CD8++cytokine-induced+killer+cells+after+antigen-induced+expansion.">Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion.</a> PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+cells+as+a+feasible+adoptive+immunotherapy+for+the+treatment+of+lung+cancer.">Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 366 (2018).</li><li>Tario, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+proliferation+by+dye+dilution:+considerations+for+probe+selection.">Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).</li><li>Last'ovicka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+natural+killer+cells+in+tamarins:+a+technical+basis+for+studies+of+innate+immunity.">Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity.</a> Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).</li></ol>

Описанный метод представляет собой быстрый, удобный и надежный протокол для изоляции и расширения цитотоксических цитокинов- индуцированных киллером (CIK) Т-клеток из цельных образцов крови здоровых доноров. Он также показывает цитотоксический эффект CIK против лейкемии (K562) и раковых кл...

Цитотоксические Т-лимфоциты являются специфической популяцией клеток иммунного эффектора, которая опосредует иммунные реакции против рака. Несколько популяций эпреторных клеток, включая лимфокин-активированный убийца (LAK) клетки, опухолевые лимфоциты (TILs), естественные клетки убийцы (НК), Т-клетки, и цитокин-индуцированных убийца (CIK) клетки были разработаны для приемной Т-клеточной терапии (ACT) целей1. Существует растущий интерес к клеткам CIK, потому что они представляют собой смесь цитокинов индуцированных цитотоксических клеток населения расширена от аутологичных периферических клеток крови (PMBCs)2.
Неконтролируемый рост клеток-прародителей лимфоидов, миелобластов и лимфобластов приводит к трем основным видам рака крови (например, лейкемии, лимфомы и миеломы), твердых опухолей, включая рак , рак легких, рак желудка, рак шейки матки) и саркомы, среди других видов рака3. Клетки CIK представляют собой смесь клеточных популяций, которые демонстрируют широкий спектр основных комплекс гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности и, таким образом, держать обещание для лечения гематологических и передовых опухолей4,5,6,7. Клетки CIK состоят из комбинации ячеек, в том числе Т-клеток (CD3иCD56),НК-Т-клеток (CD3иCD56)и НК-клеток (CD3-CD56). Оптимизация протокола индукции CIK с использованием фиксированного графика для добавления IFN-З, анти-CD3 антител и IL-2, приводит к расширению ciK-клеток8. Цитотоксические возможности клеток CIK против раковых клеток в основном зависит от участия НК группы 2 член D (член C-типа лектин-подобных рецепторов семьи) NKG2D лиганды на опухолевые клетки, и на перфорин-опосредованных путей9. Результаты доклинического исследования показали, что IL-15-стимулировали клетки CIK индуцированной мощной цитотоксичности против первичной и острой миелоидной лейкемии клеточных линий в пробирке и выставлены более низкую алореактивность против нормальных ПБМК и фибробластов9. В последнее время, результат ы одноразовый здоровый донора полученных CIK (1 х 108/ кг CD3- клетки) инфузии, как консолидация после немиелоаблятивной аллогенной трансплантации для лечения миелоидных неоплазм в фазе II клинического исследования было опубликовано10.
В настоящем исследовании мы разработали оптимизированную формулу культуры клеток, состоящую из IFN-Я, IL-1, антител анти-CD3 и IL-2, добавленных в гематопоиетическую среду для увеличения производства CIK, и исследовали цитотоксический эффект клеток CIK против хронических человеческих миелоидный лейкоз (K562) клетки рака яичников (OC-3) клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-Amino Actinomycin D</td>
			<td>BD</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD56 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555518</td>
			<td>B159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555751</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
			<td>SN: R33896202856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>BD</td>
			<td>565082</td>
			<td></td>
			<td>Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
			<td>For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.02</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for OC-3 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
			<td>For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>71101700-EK</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555332</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555748</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-CD3 mAb</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T210</td>
			<td>OKT3</td>
			<td>Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin</td>
			<td>NOVARTIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of Proleukin Powder (22x106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interferon-gamma</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>1425-050</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of rh IFN-g (5x105 IU/50 &#181;g) with 200 &#181;L of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-1 alpha</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>200-01A</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution rh IL-1&#945; (10 &#181;g) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 3-18K Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10295</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
			<td>Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment

Приемная клеточная иммунотерапия фокусируется на восстановлении распознавания рака через иммунную систему и улучшает эффективное убийство опухолевых клеток. Цитокин индуцированных убийца (CIK) Т-клеточная терапия, как сообщается, оказывают значительное цитотоксиче эффекты против раковых клеток и уменьшить неблагоприятные последствия хирургии, радиации и химиотерапии в лечении рака. CIK может быть получен из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК), костного мозга и пуповинной крови. Клетки CIK представляют собой разнородную субпопуляцию Т-клеток с CD3иCD56 и природными фенотипическими характеристиками убийцы (NK), которые включают в себя основные комплексы гистосовместимости (MHC)-неограниченной противоопухолевой активности. Это исследование описывает квалифицированный, клинически применимый, поток цитометрии на основе метода для количественной цитолической способности ПБМК полученных клеток CIK против гематологических и твердых раковых клеток. В цитолическом анализе, клетки CIK совместно инкубируются в различных соотношениях с заранее целевыми опухолевыми клетками. После инкубационного периода, количество клеток-мишеней определяется нуклеиновой кислотой-связывающей пятно для обнаружения мертвых клеток. Этот метод применим как к исследованиям, так и к диагностическим приложениям. Клетки CIK обладают мощной цитотоксичностью, которая может быть изучена в качестве альтернативной стратегии для лечения рака после его доклинической оценки с помощью установки цитометра и отслеживания (CS и T) на основе цитометрии потока системы.

Цель юристого протокола состоит в том, чтобы изолировать и расширить цитокин-индуцированных киллеров (CIK) Т-клеток из периферических моноцитов крови и оценить цитотоксический эффект CIK против гематологической злокачественности и твердых раковых клеток, соответственно. Индукция CIK был?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Здесь мы представляем протокол для выполнения изоляции и расширения периферической крови моноядерных клеток, полученных цитокиновых CD3cd56- клетки-убийцы и иллюстрируем их цитотоксический эффект против гематологических и твердых раковых клеток с помощью системы цитометрии в пробирке диагностики.

Изоляция и расширение цитотоксических цитотинов индуцированных Killer T-клеток для лечения рака

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Мы оптимизировали высококвалифицированный и клинически применимый метод для расширения цитокиных Т-клеток, полученных из ПБМК, и для оценки их цитотоксичности против рака. Преимущество этого метода заключается в том, чтобы обеспечить стандартную операционную процедуру для техников и клиницистов для количественной оценки потенции цитокинов индуцированных клеток-убийц как в научных исследованиях, так и в клинической оценке. Начните эту процедуру с подготовки клеток CIK, как описано в текстовом протоколе, а затем мыть клетки CIK с 10 миллилитров стерильных PBS.Центрифуга в течение 10 минут при 300 раз G и от 18 до 20 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант и повторное распределение клеток с пятью миллилитров PBS. Подсчитайте числа ячееок и проверьте жизнеспособность ячейки с помощью анализа trypan blue exclusion.Aliquot клетки CIK в шесть стерильных 1,5 миллилитровых труб при плотности примерно от 5 до одного миллиона клеток на миллилитр PBS. Этикетка и лечение ячеек, как подробно описано в текстовом протоколе. Аккуратно смешайте клетки CIK с антителами, аккуратно трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза с одним миллилитровым стерильным пипеткой.Инкубировать клетки в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Центрифуга труб в течение 10 минут при 300 раз G и 18 до 20 градусов по Цельсию. После центрифугации, аспирировать супернатант и повторно гранулы клетки с одним миллилитром PBS, а затем осторожно пипетки клетки вверх и вниз, по крайней мере три раза с одним миллилитров стерильной пипетки.Передача клеточной подвески в стерильные пять миллилитров полистирола круглой нижней трубки с крышкой клетки ситечко, мягко трубы через крышку, а затем поместить трубки на карусели в порядке. Откройте программное обеспечение для анализа цитометрии потока и создайте экспериментальную папку, а затем нажмите кнопку нового образца, чтобы добавить образец и трубку в эксперимент. Назовите трубки, перечисленные в текстовом протоколе.Чтобы создать систему рассеяния для популяций ячеек CIK, сначала выберите трубку одну и нажмите на кнопку точечного участка для создания участка FSCA SSCA. Нарисуйте прямоугольные ворота над всей популяцией клеток с порогом FSCA более 5000, чтобы исключить клеточный мусор. Выберите параметр FSCA FSCH для нового точечного участка и нарисуйте полигональные ворота вокруг всех одиночных ячеек.Выберите количество по сравнению с FITC-спряженный CD3 и подсчитайте по сравнению с параметром CD56, спряженным APC, для нового сюжета гистограммы. Выберите спряжку CD3 с FITC по сравнению с параметром CD56 с APC и нарисуйте четыре квадрантных ворот для определения четырех субпопуляций. Завехать данные с 20 000 одиночных ячеек в каждом экземпляре.Нажмите кнопку образца нагрузки, чтобы сначала проанализировать пустой образец управления. Определите всю популяцию клеток CIK с помощью параметров канала CD56 и CD3. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельного образца, для анализа популяций клеток CIK и перепечатки их в файлы анализа.Для выполнения цитотоксического анализа, кокультура CIK и человека хронический миелоидный лейкоз K562 клетки, добавив один миллилитр клеток K562 к каждому хорошо в шесть хорошо пластины при плотности 5 миллионов клеток на миллилитр, а затем добавить один миллилитр базальной среды с или без клеток CIK в шесть хорошо пластины, как у перечислены в текстовом протоколе. Смешайте подвески клеток, аккуратно трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза. Поместите тарелку в инкубатор на 24 часа.Теперь, кокультура CIK и яичников OC-3 клеток, добавив один миллилитр базальной среды с или без клеток CIK на шесть хорошо пластины, перечисленные в текстовом протоколе. Смешайте подвески клеток, аккуратно трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза. Поставь тарелку в инкубатор на 24 часа.После инкубации, урожай CIK K562 клеточной подвески непосредственно в 15 миллилитров стерильной трубки. Для сбора как суспензии, так и клеток соблюдения из групп CIK OC-3 сначала перенесите подвесную клетку в стерильную трубку на 15 миллилитров. Вымойте колодец одним миллилитров стерильного PBS, соберите PBS, и добавить его в трубку, а затем добавить 5 миллилитров раствора фермента диссоциации клеток и инкубировать в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию.Добавьте один миллилитр раствора из той же трубки в соответствующий колодец и аккуратно смешайте клетки, трубя вверх и вниз по крайней мере три раза с помощью одноми миллилитров стерильной пипетки. Соберите все клетки в одной трубке. Центрифуга 300 раз G в течение 10 минут.Аспирировать супернатант и повторное распределение клеток в один миллилитр стерильных PBS. Пеллет клетки в 300 раз G в течение 10 минут, а затем аспирировать супернатант и повторного перерасхода клеток в 100 микролитров стерильных PBS. Добавьте пять микролитров 7-ААД красителя к клеточной подвеске.Аккуратно смешайте клетки, трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза с одним миллилитровым стерильным пипеткой. Инкубировать в течение 10 минут и оставить в темноте до анализа. Для выполнения анализа цитолитических возможностей смешайте подвеску клетки и повторите подготовку к цитометрии потока.Нажмите на новую кнопку образца, чтобы добавить образец и трубку в эксперимент. Назовите трубки, перечисленные в текстовом протоколе. Чтобы создать систему рассеяния для цитолитических анализов, сначала выберите трубку одну и нажмите на кнопку точечного участка, чтобы создать участок FSCA SSCA.Нарисуйте прямоугольные ворота над всеми событиями с порогом FSCA более 50 000, чтобы исключить клеточный мусор. Выберите параметр SSCA CFSE для нового точечного участка, затем выберите параметр 7-AAD CFSE для нового точечного участка и нарисуйте четыре квадрантных ворот для определения четырех субпопуляций. Нажмите кнопку образца нагрузки, чтобы сначала проанализировать пустой образец управления.Отрегулируйте напряжение SSCA и FSCA. Определите популяцию мертвых клеток с помощью параметров канала CFSE и 7-AAD. Запись данных из более чем 20 000 положительных клеток CFSE в каждом образце.Откройте файлы, содержащие статистические значения каждого отдельного образца, чтобы проанализировать необязаемые популяции клеток и экспортировать данные в файлы анализа. Репрезентативные результаты стратегии анализа субпопуляции положительных Т-клеток CD-3 CD56 у здоровых доноров показаны статистическим анализом доли CIK от трех особей. Cd-3 положительная положительная доля клеток CD56 значительно увеличилась после 14 дней расширения.Это видно через 65% для оригинального PBMC, который увеличился до 27,4% для клеток CIK, собранных на 14-й день. В этой системе культуры, клетки CIK дали около половины сотни раз изменения по сравнению с первоначальным числом PBMCs. K562 клетки были окрашены нефлуоресцентным красителем CFSE, который расщепляется внутриклеточных эстера в жизнеспособных клетках и становится высоко флуоресцентным красителем.Иллюстрируются размеры и детализация клеток CIK и CFSE.positive. Клетки CFSE, окрашенные K562, были совместно обработаны клетками CIK в соотношении ноль к одному, пять к одному и 10 к одному. Эти клетки были окрашены 7-AAD красителя в качестве зонда жизнеспособности для исключения мертвых клеток.Оценивались 7-AAD положительные клетки положительных клеток CFSE K562. Клетки, окрашенные CFSE OC-3, были совместно обработаны клетками CIK в соотношении 10 к одному. Очевидная цитотоксичность CIK против клеток OC-3 демонстрируется здесь после 24 часов инкубации.CIK Т-клеток, как сообщается, оказывают значительное цитотоксическое воздействие против раковых клеток и уменьшить неблагоприятные последствия хирургии, радиации и химиотерапии в лечении рака. Иммунотерапия является перспективным методом лечения ряда видов рака. CIK может быть эффективно расширен в пробирке путем инкубации пациентов полученных PMBCs в GMP-класса состояние для дальнейшего аутологичного вливания.Следуя этому протоколу, мы могли бы выполнить иммунную клеточную терапию в GTP-или GMP-классе для дальнейшего клинического лечения рака.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Поколение и изоляции арестован клеточного цикла клетки с сложных получен

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Мышь сингенных B-клеточной лимфомы модель для предварительно клинической оценки CD19 автомобилей Т-клеток

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Подготовка Exosomes siRNA доставки раковых клеток

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Производство химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток для приемной иммунотерапии

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Использование человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для поколения опухолевых антигенов конкретных Т-клеток

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Поколение ортотопических опухолей поджелудочной железы и Ex vivo Характеристика опухоли-проникновения T клеточной цитотоксичности

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Выделение мононуклеарных клеток периферической крови человека и CD4+ Т-клеток у пациентов с синдромом Сезари для транскриптомного профилирования

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Естественный киллер (NK) и метод расширения клеток CAR-NK с использованием мембранно-связанной IL-21-модифицированной В-клеточной линии

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Расширение и обогащение гамма-дельта (γδ) Т-клеток из аферезированного продукта человека

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Генерация и расширение первичных, злокачественных опухолевых линий мезотелиомы плевры

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...