Name: isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment
Uploaded: 2020-01-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Denna studie stöddes av China Medical University Hospital (DMR-Cell-1809).

Det kliniska protokollet utfördes och godkändes i enlighet med riktlinjerna från Institutional Review Board i China Medical University and Hospital Research Ethics Committee. Perifert blod exemplar skördades från friska frivilliga med deras informerade samtycke.
1. Beredning av material
<ol><li>Lagra reagenser, antikroppar och kemikalier enligt det materialsäkerhetsdatablad (MSDS). Lös upp drogerna eller cytokinerna i lösningsmedel som lagerlösningar och sedan alikvot för förvarin...

<ol>
	<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors:+The+paradigm+of+Cytokine-Induced+Killer+(CIK)+cells.">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).</li><li>Schmidt-Wolf, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+large+numbers+of+T+cells+with+natural+killer+cell+markers.">Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers.</a> British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).</li><li>Grainger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+in+Hematological+Malignancies.">Wnt Signaling in Hematological Malignancies.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+combined+PD-L1/PD-1+blockade+with+cytokine-induced+killer+cells+as+a+synergistic+immunotherapy+for+gastrointestinal+cancer.">Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer.</a> Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).</li><li>Schmidt-Wolf, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+SCID+mouse/human+lymphoma+model+to+evaluate+cytokine-induced+killer+cells+with+potent+antitumor+cell+activity.">Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity.</a> TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).</li><li>Introna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+massive+expansion+of+cord+blood-derived+cytokine-induced+killer+cells:+an+innovative+proposal+for+the+treatment+of+leukemia+relapse+after+cord+blood+transplantation.">Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).</li><li>Schmeel, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+cancer+immunotherapy:+report+of+the+international+registry+on+CIK+cells+(IRCC).">Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC).</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).</li><li>Rutella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+with+cytokine-induced+killer+cells+generated+with+a+new+good+manufacturing+practice-grade+protocol.">Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol.</a> Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).</li><li>Nausch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+in+tumor+immunity.">NKG2D ligands in tumor immunity.</a> Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).</li><li>Gammaitoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+activity+of+cytokine-induced+killer+cells+against+autologous+metastatic+melanoma+including+cells+with+stemness+features.">Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features.</a> Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).</li><li>Rettinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+potential+of+interleukin-15-stimulated+cytokine-induced+killer+cells+against+leukemia+cells.">The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells.</a> Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+cytokine-induced+killer+cell+infusion+as+consolidation+after+nonmyeloablative+allogeneic+transplantation+for+myeloid+neoplasms.">Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).</li><li>Castiglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+killer+cells+produced+in+good+manufacturing+practices+conditions:+identification+of+the+most+advantageous+and+safest+expansion+method+in+terms+of+viability,+cellular+growth+and+identity.">Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).</li><li>Bonanno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoglobulin,+interferon-&#947;+and+interleukin-2+efficiently+expand+cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+clinical-grade+cultures.">Thymoglobulin, interferon-&#947; and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).</li><li>Iudicone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+enhances+cytokine+induced+killer+(CIK)+cytotoxic+potential+against+epithelial+cancer+cell+lines+via+an+innate+pathway.">Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway.</a> Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+anticancer+capacity+of+CD8++cytokine-induced+killer+cells+after+antigen-induced+expansion.">Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion.</a> PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+cells+as+a+feasible+adoptive+immunotherapy+for+the+treatment+of+lung+cancer.">Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 366 (2018).</li><li>Tario, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+proliferation+by+dye+dilution:+considerations+for+probe+selection.">Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).</li><li>Last'ovicka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+natural+killer+cells+in+tamarins:+a+technical+basis+for+studies+of+innate+immunity.">Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity.</a> Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).</li></ol>

Den beskrivna metoden är ett snabbt, bekvämt och tillförlitligt protokoll för isolering och expansion av cytotoxiska cytokin-inducerad mördare (CIK) T-celler från hela blodprov av friska givare. Det visar också cytotoxiskeffekt av CIK mot leukemi (K562) och äggstockscancer celler (OC-3) med hjälp av ett flöde cytometri setup och spårning (CS & T) system. CIK-celler kan induceras och utvidgas i god manufactory praxis (GMP) villkor med hjälp av GMP-klass cytokiner och serumfritt medium för ytterligare klinisk ...

Cytotoxiska T-lymfocyter är en specifik immuneffekteller cellpopulation som förmedlar immunsvar mot cancer. Flera effektorcellpopulationer inklusive celler med lymfokinaktiverad mördare (LAK), tumörinfiltrerande lymfocyter (TILs), naturliga mördarceller (NK), γδ T-celler och cytokininducerade mördarceller (CIK) har utvecklats för adoptiv- T-cellterapi (ACT) ändamål1. Det finns ett växande intresse för CIK celler, eftersom de utgör en blandning av cytokin-inducerad cytotoxiska cellpopulationer expanderat från autologperifera blod mononukleära celler (PMBC)2.
Den okontrollerade tillväxten av lymfoida stamceller, myeloblaster och lymfoblaster leder till tre huvudtyper av blodcancer (dvs leukemi, lymfom och myelom), solida tumörer, inklusive carinomcas (t.ex. lungcancer, magcancer, livmoderhalscancer) och sarkom, bland andra cancerformer3. CIK celler är en blandning av cell populationer som uppvisar ett brett spektrum av stora histocompatibility komplex (MHC)-obegränsad antitumör aktivitet och därmed hålla löfte om behandling av hematologiska och avancerade tumörer4,5,6,7. CIK-celler består av en kombination av celler, inklusive T-celler (CD3+CD56−), NK-T-celler (CD3+CD56+) och NK-celler (CD3–CD56+). Optimering av CIK-induktionsprotokollet med hjälp av ett fast schema för tillsats av IFN-γ, anti-CD3-antikroppar och IL-2, resulterar i expansionav CIK-celler8. Cikcellers cytotoxiska förmåga mot cancerceller beror främst på nkgrupp 2-medlem D:s engagemang (medlem i C-typ lektinliknande receptorfamiljen) NKG2D-ligander på tumörceller och på perforinmedierade vägar9. Resultaten av en preklinisk studie visade att IL-15-stimulerade CIK celler inducerad potent cytotoxicitet mot primära och akut myeloisk leukemi cellinjer in vitro och uppvisade en lägre alloreactivity mot normala PBMC och fibroblaster9. Nyligen publicerades resultatet av engångsbehandling med friska donatorderivat CIK (1 x 108/kg CD3+ celler) som konsolidering efter nonmyeloablaative allogentransplantation för myeloisk neoplasmer behandling i en klinisk fas II-studie10.
I denna studie utvecklade vi en optimerad cellkulturformel bestående av IFN-γ, IL-1α, anti-CD3-antikroppar och IL-2 som lagts till hematopoietiska cellmediet för att öka CIK-produktionen och undersökte cikcellernas cytotoxiska effekt mot humankronisk myeloisk leukemi (K562) celler och äggstockscancer (OC-3) celler.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-Amino Actinomycin D</td>
			<td>BD</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD56 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555518</td>
			<td>B159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555751</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
			<td>SN: R33896202856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>BD</td>
			<td>565082</td>
			<td></td>
			<td>Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
			<td>For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.02</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for OC-3 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
			<td>For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>71101700-EK</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555332</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555748</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-CD3 mAb</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T210</td>
			<td>OKT3</td>
			<td>Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin</td>
			<td>NOVARTIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of Proleukin Powder (22x106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interferon-gamma</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>1425-050</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of rh IFN-g (5x105 IU/50 &#181;g) with 200 &#181;L of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-1 alpha</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>200-01A</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution rh IL-1&#945; (10 &#181;g) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 3-18K Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10295</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
			<td>Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment

Adoptiv cellulär immunterapi fokuserar på att återställa cancer erkännande via immunsystemet och förbättrar effektiv tumör cell dödande. Cytokin-inducerad mördare (CIK) T cell terapi har rapporterats att utöva betydande cytotoxiska effekter mot cancerceller och för att minska de negativa effekterna av kirurgi, strålning och kemoterapi i cancerbehandlingar. CIK kan härledas från perifert blod mononukleära celler (PBM), benmärg och navelsträngsblod. CIK celler är en heterogen subpopulation av T-celler med CD3+CD56+ och naturliga mördare (NK) fenotypiska egenskaper som inkluderar stora histocompatibility komplex (MHC)-obegränsad antitumör aktivitet. Denna studie beskriver en kvalificerad, kliniskt tillämplig, flödecytometribaserad metod för kvantifiering av cytolytisk förmåga PBMC-härledda CIK-celler mot hematologiska och solida cancerceller. I cytolytisk analys, CIK celler är co-incubated vid olika förhållanden med prestained mål tumörceller. Efter inkubationstiden bestäms antalet målceller av en nukleinsyrabindande fläck för att upptäcka döda celler. Denna metod är tillämplig på både forsknings- och diagnostiktillämpningar. CIK-celler har potent cytotoxicitet som kan utforskas som en alternativ strategi för cancerbehandling vid sin prekliniska utvärdering av en cytometer setup och spårning (CS & T) baserat flöde cytometri system.

Syftet med detta protokoll är att isolera och expandera cytokin-inducerad mördare (CIK) T-celler från perifera blodmonocyter och utvärdera cytotoxiska effekten av CIK mot hematologiska malignitet och solida cancerceller, respektive. Induktionen av CIK identifierades genom CD3/CD56-igenkänningen. Figur 1A visar protokollet för CIK-induktion och expansion. De representativa resultaten av gating strategi för att analysera subpopulationen av CD3+CD56+</sup...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Här presenterar vi ett protokoll för att utföra isolering och expansion av perifert blod mononukleära celler-härledda cytokin-inducerad CD3+CD56+ mördarceller och illustrera deras cytotoxicitet effekt mot hematologiska och solida cancerceller med hjälp av en in vitro diagnos flöde cytometri system.

Isolering och expansion av cytotoxiska Cytokin-inducerad Killer T-celler för cancerbehandling

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

Vi optimerade en högt kvalificerad och kliniskt tillämplig metod för expansion av PBMC-härledda cytokin-inducerad killer T-celler och för utvärdering av deras cytotoxicitet mot cancer. Fördelen med denna teknik är att tillhandahålla ett standardförfarande för tekniker och kliniker att kvantifiera styrkan hos cytokin-inducerad mördarceller i både vetenskaplig forskning och klinisk utvärdering. Påbörja denna procedur med en beredning av CIK-celler som beskrivs i textprotokollet, tvätta sedan CIK-cellerna med 10 milliliter steril PBS.Centrifugera i 10 minuter vid 300 gånger G och 18 till 20 grader Celsius. Aspirera supernatanten och resuspend cellerna med fem milliliter av PBS. Räkna cellnumren och testa cellens viabilitet med hjälp av analysen trypan blå uteslutning.Aliquot CIK cellerna i sex sterila 1,5 milliliter rör vid en densitet av cirka 5 till en miljon celler per milliliter PBS. Märk och behandla cellerna som detaljerade i textprotokollet. Blanda försiktigt CIK-cellerna med antikropparna genom att försiktigt pipettera upp och ner minst tre gånger med en en milliliter sterilpipett.Inkubera cellerna i 15 minuter vid rumstemperatur i mörker. Centrifugera rören i 10 minuter vid 300 gånger G och 18 till 20 grader Celsius. Efter centrifugeringen aspirerar du supernatanten och återanvänder cellpelleten med en milliliter PBS, och pipettera sedan försiktigt cellerna upp och ner minst tre gånger med en en milliliter steril pipet.Överför cellupphängningen till ett sterilt fem milliliter polystyrenrunt bottenrör med en cellsillock genom att försiktigt pipettera genom locket och placera sedan rören på karusellen i ordning. Öppna flödet cytometry analysprogram och skapa en experimentell mapp, klicka sedan på den nya exemplaret knappen för att lägga till ett prov och rör till experimentet. Namnge rören som listade i textprotokollet.För att skapa en scatter gating system för CIK cellen populationer, välj först rör ett och klicka på pricken tomt knappen för att skapa en FSCA SSCA tomt. Rita en rektangelgrind över hela cellpopulationen med ett FSCA-tröskelvärde som är större än 5000 för att utesluta cellskräp. Välj FSCA FSCH-parametern för den nya punktritningen och rita en polygongrind runt alla enstaka celler.Välj antal kontra FITC-konjugerad CD3 och räkna kontra APC-konjugerad CD56 parameter för den nya histogram plot. Välj fitc-konjugerade CD3 kontra APC-konjugerad CD56-parameter för den nya punkttomten och rita en fyrakvadrantgrind för att definiera de fyra delpopulationerna. Registrera data från 20, 000 enstaka celler i varje exemplar.Klicka på knappen för att ta del av provknappen för belastning för att först analysera blankkontrollprovet. Identifiera hela CIK-cellpopulationen med hjälp av cd56- och CD3-kanalparametrarna. Öppna filerna som innehåller de enskilda exemplarens statistiska värden för att analysera CIK-cellpopulationer och skriva ut dem på nytt till analysfiler.För att utföra den cytotoxiska analysen, kokultur CIK och human kronisk myeloisk leukemi K562 celler genom att lägga till en milliliter av K562 celler till varje brunn i en sex-väl platta vid en densitet av 5 miljoner celler per milliliter, lägg sedan till en milliliter basalt medium med eller utan CIK celler till sex-well plattan som anges i textprotokollet. Blanda cellupphängningar genom att försiktigt pipettera upp och ner minst tre gånger. Placera plattan i inkubatorn i 24 timmar.Nu, kokultur CIK och äggstockscancer OC-3 celler genom att lägga till en milliliter av basalt medium med eller utan CIK-celler till sex-well plattan som anges i textprotokollet. Blanda cellupphängningar genom att försiktigt pipettera upp och ner minst tre gånger. Lägg plattan i inkubatorn i 24 timmar.Efter inkubationen skördar du CIK K562-cellupphängningen direkt i ett 15 milliliter sterilt rör. För att skörda både suspensionen och vidhäftningscellerna från CIK OC-3-grupperna, överför du först cellupphängningen till ett 15 milliliter sterilt rör. Tvätta brunnen med en milliliter steril PBS, samla pbs, och tillsätt den i röret, tillsätt sedan 5 milliliter cell dissociation enzymlösning och inkubera i fem minuter vid 37 grader Celsius.Tillsätt en milliliter av lösningen från samma rör till motsvarande brunn, och blanda försiktigt cellerna genom pipettering upp och ner minst tre gånger med en en milliliter steril pipetter. Samla alla celler i samma rör. Centrifugera vid 300 gånger G i 10 minuter.Aspirera supernatanten och resuspend cellerna i en milliliter av sterila PBS. Pellet cellerna på 300 gånger G i 10 minuter, sedan aspirera supernatant och resuspend cellerna i 100 mikroliter av sterila PBS. Tillsätt fem mikroliter av 7-AAD färgämne till cellen suspension.Blanda försiktigt cellerna genom pipettering upp och ner minst tre gånger med en en milliliter steril pipetter. Inkubera i 10 minuter och låt i mörker innan analysen. För att utföra den cytolytiska förmåga assay, blanda cellen suspension och upprepa förberedelserna för flödescytometri.Klicka på den nya provknappen om du vill lägga till ett prov och ett rör i experimentet. Namnge rören som listade i textprotokollet. För att skapa en scatter gating system för cytolytisk analysen, välj först rör ett och klicka på punkt plot knappen för att skapa en FSCA SSCA tomt.Rita en rektangel grind över alla händelser med en FSCA tröskel större än 50, 000 att utesluta cell skräp. Välj SSCA CFSE-parametern för den nya punkttomten och välj sedan 7-AAD CFSE-parametern för den nya punkttomten och rita en fyrakvadrantgrind för att definiera de fyra delpopulationerna. Klicka på knappen för att ta del av provknappen för belastning för att först analysera blankkontrollprovet.Justera spänningen i SSCA och FSCA. Identifiera den döda cellpopulationen genom att använda parametrarna CFSE och 7-AAD-kanal. Registrera data från större än 20, 000 CFSE positiva celler i varje exemplar.Öppna filerna som innehåller de statistiska värdena för varje enskilt exemplar för att analysera de icke-avundsvärda cellpopulationerna, och exportera data till analysfiler. De representativa resultaten av den gating strategin för att analysera subpopulationen av CD-3 positiva CD56 positiva T-celler från friska givare visas med den statistiska analysen av CIK andelen från tre individer. CD-3 positiva CD56 positiva cellen proportionen ökade avsevärt efter 14 dagars expansion.Detta är tydligt genom 65%för den ursprungliga PBMC som ökade till 27,4%för CIK celler skördas på dag 14. I detta odlingssystem gav CIK-cellerna ungefär ett halvt hundrafaldigt förändringar jämfört med det ursprungliga antalet PBMCs. K562 celler var färgas med en nonfluorescent färgämne CFSE, som är klyvda av intracellulära esterases inom livskraftiga celler och blir en mycket fluorescerande färgämne.Storleken och granulariteten på CIK- och CFSE-positiva cellerna illustreras. CFSE-färgade K562-cellerna sambehandlades med CIK-celler vid ett förhållande på noll till ett, fem till ett och 10 till en. Dessa celler var färgas med 7-AAD färgämne som en livsduglig sond för döda cell utslagning.De 7-AAD positiva cellerna av CFSE positiva K562 celler utvärderades alla. De CFSE-färgade OC-3 cellerna var co-behandlade med CIK celler vid ett förhållande av 10 till en. Den uppenbara cytotoxicitet CIK mot OC-3 celler påvisas här efter 24 timmars inkubation.CIK T-celler har rapporterats utöva betydande cytotoxiska effekter mot cancerceller och minska de negativa effekterna av kirurgi, strålning, och kemoterapi i cancerbehandlingar. Immunterapi är en lovande behandling för ett antal cancerformer. CIK kan effektivt byggas ut in vitro genom inkubation av patient-derived PMBCs i GMP-grade skick för ytterligare autolog infusion.Efter detta protokoll, vi kunde utföra immun cellulära terapi i en GTP-eller GMP-grade anläggning för ytterligare klinisk cancerbehandling.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Generation och isolering av cellcykeln-arresterade celler med komplexa Karyotypes

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngena mus B-cells lymfom modell för preklinisk utvärdering av CD19 CAR T-celler

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

Beredning av Exosomes för siRNA leverans till cancerceller

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

Tillverkning chimeric antigen receptor (bil) T celler för adoptiv immunterapi

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Använda humana inducerade pluripotenta stamceller för generering av tumör antigen-specifika T-celler

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generering av ortotopisk Pankreastumörer och ex vivo karakterisering av tumörinfiltrerande T-cell cytotoxicitet

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolering av humana mononukleära celler i perifert blod och CD4+ T-celler från patienter med Sézarys syndrom för transkriptomisk profilering

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer (NK) och CAR-NK cellexpansionsmetod med membranbunden IL-21-modifierad B-cellinje

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Expansion och anrikning av Gamma-Delta (γδ) T-celler från Apheresed Human Product

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Generering och expansion av primära, maligna pleuramesoteliom tumörlinjer

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...