Name: isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment
Uploaded: 2020-01-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Bu çalışma Çin Tıp Üniversitesi Hastanesi (DMR-Cell-1809) tarafından desteklenmiştir.

Klinik protokol çin Tıp Üniversitesi ve Hastane Araştırma Etik Komitesi Kurumsal İnceleme Kurulu yönergelerine uygun olarak yapıldı ve onaylandı. Periferik kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden bilgilendirilmiş rızaları ile alındı.
1. Malzemelerin hazırlanması
<ol><li>Malzeme Güvenliği Veri Formu'nda (MSDS) gösterildiği şekilde reaktifleri, antikorları ve kimyasalları depolayın. İlaçları veya sitokinleri çözücülerde stok çözeltisi olarak çözün ve da...

<ol>
	<li>Cappuzzello, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+for+the+induction+of+antitumor+effectors:+The+paradigm+of+Cytokine-Induced+Killer+(CIK)+cells.">Cytokines for the induction of antitumor effectors: The paradigm of Cytokine-Induced Killer (CIK) cells.</a> Cytokine &amp; Growth Factor Reviews. 36, 99-105 (2017).</li><li>Schmidt-Wolf, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+large+numbers+of+T+cells+with+natural+killer+cell+markers.">Propagation of large numbers of T cells with natural killer cell markers.</a> British Journal of Haematology. 87 (3), 453-458 (1994).</li><li>Grainger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+Signaling+in+Hematological+Malignancies.">Wnt Signaling in Hematological Malignancies.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 153, 321-341 (2018).</li><li>Dai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implication+of+combined+PD-L1/PD-1+blockade+with+cytokine-induced+killer+cells+as+a+synergistic+immunotherapy+for+gastrointestinal+cancer.">Implication of combined PD-L1/PD-1 blockade with cytokine-induced killer cells as a synergistic immunotherapy for gastrointestinal cancer.</a> Oncotarget. 7 (9), 10332-10344 (2016).</li><li>Schmidt-Wolf, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+SCID+mouse/human+lymphoma+model+to+evaluate+cytokine-induced+killer+cells+with+potent+antitumor+cell+activity.">Use of a SCID mouse/human lymphoma model to evaluate cytokine-induced killer cells with potent antitumor cell activity.</a> TheJournal of Experimental Medicine. 174 (1), 139-149 (1991).</li><li>Introna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+massive+expansion+of+cord+blood-derived+cytokine-induced+killer+cells:+an+innovative+proposal+for+the+treatment+of+leukemia+relapse+after+cord+blood+transplantation.">Rapid and massive expansion of cord blood-derived cytokine-induced killer cells: an innovative proposal for the treatment of leukemia relapse after cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 38 (9), 621-627 (2006).</li><li>Schmeel, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+cancer+immunotherapy:+report+of+the+international+registry+on+CIK+cells+(IRCC).">Cytokine-induced killer (CIK) cells in cancer immunotherapy: report of the international registry on CIK cells (IRCC).</a> Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 141 (5), 839-849 (2015).</li><li>Rutella, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+immunotherapy+with+cytokine-induced+killer+cells+generated+with+a+new+good+manufacturing+practice-grade+protocol.">Adoptive immunotherapy with cytokine-induced killer cells generated with a new good manufacturing practice-grade protocol.</a> Cytotherapy. 14 (7), 841-850 (2012).</li><li>Nausch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKG2D+ligands+in+tumor+immunity.">NKG2D ligands in tumor immunity.</a> Oncogene. 27 (45), 5944-5958 (2008).</li><li>Gammaitoni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+activity+of+cytokine-induced+killer+cells+against+autologous+metastatic+melanoma+including+cells+with+stemness+features.">Effective activity of cytokine-induced killer cells against autologous metastatic melanoma including cells with stemness features.</a> Clinical Cancer Research. 19 (16), 4347-4358 (2013).</li><li>Rettinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+potential+of+interleukin-15-stimulated+cytokine-induced+killer+cells+against+leukemia+cells.">The cytotoxic potential of interleukin-15-stimulated cytokine-induced killer cells against leukemia cells.</a> Cytotherapy. 14 (1), 91-103 (2012).</li><li>Narayan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Donor-derived+cytokine-induced+killer+cell+infusion+as+consolidation+after+nonmyeloablative+allogeneic+transplantation+for+myeloid+neoplasms.">Donor-derived cytokine-induced killer cell infusion as consolidation after nonmyeloablative allogeneic transplantation for myeloid neoplasms.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 19, 1083 (2019).</li><li>Castiglia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokines+induced+killer+cells+produced+in+good+manufacturing+practices+conditions:+identification+of+the+most+advantageous+and+safest+expansion+method+in+terms+of+viability,+cellular+growth+and+identity.">Cytokines induced killer cells produced in good manufacturing practices conditions: identification of the most advantageous and safest expansion method in terms of viability, cellular growth and identity.</a> Journal of Translational Medicine. 16 (1), 237 (2018).</li><li>Bonanno, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymoglobulin,+interferon-&#947;+and+interleukin-2+efficiently+expand+cytokine-induced+killer+(CIK)+cells+in+clinical-grade+cultures.">Thymoglobulin, interferon-&#947; and interleukin-2 efficiently expand cytokine-induced killer (CIK) cells in clinical-grade cultures.</a> Journal of Translational Medicine. 8, 129 (2010).</li><li>Iudicone, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+enhances+cytokine+induced+killer+(CIK)+cytotoxic+potential+against+epithelial+cancer+cell+lines+via+an+innate+pathway.">Interleukin-15 enhances cytokine induced killer (CIK) cytotoxic potential against epithelial cancer cell lines via an innate pathway.</a> Human Immunology. 77 (12), 1239-1247 (2016).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+characterization+and+anticancer+capacity+of+CD8++cytokine-induced+killer+cells+after+antigen-induced+expansion.">Phenotypic characterization and anticancer capacity of CD8+ cytokine-induced killer cells after antigen-induced expansion.</a> PLoS One. 12 (4), 0175704 (2017).</li><li>Chen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokine-induced+killer+cells+as+a+feasible+adoptive+immunotherapy+for+the+treatment+of+lung+cancer.">Cytokine-induced killer cells as a feasible adoptive immunotherapy for the treatment of lung cancer.</a> Cell Death &amp; Disease. 9 (3), 366 (2018).</li><li>Tario, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+cell+proliferation+by+dye+dilution:+considerations+for+probe+selection.">Monitoring cell proliferation by dye dilution: considerations for probe selection.</a> Methods in Molecular Biology. 1678, 249-299 (2018).</li><li>Last'ovicka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular Immunology. 256 (1-2), 79-85 (2009).</li><li>Yoshida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+natural+killer+cells+in+tamarins:+a+technical+basis+for+studies+of+innate+immunity.">Characterization of natural killer cells in tamarins: a technical basis for studies of innate immunity.</a> Frontiers in Microbiology. 1, 1-9 (2010).</li></ol>

Açıklanan yöntem, sağlıklı donörlerin tam kan örneklerinden sitotoksik sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücrelerinin izole edilmesi ve genişlemesi için hızlı, kullanışlı ve güvenilir bir protokoldür. Ayrıca bir akış sitometri kurulum ve izleme (CS & T) sistemi kullanarak lösemi (K562) ve yumurtalık kanseri hücrelerine (OC-3) karşı CIK sitotoksik etkisini gösterir. CIK hücreleri iyi fabrikauygulamaları (GMP) koşullarında GMP dereceli sitokinler ve daha ileri klinik infüzyon için serumsuz or...

Sitotoksik T lenfositler kansere karşı bağışıklık yanıtları aracılık belirli bir bağışıklık efektörü hücre popülasyonuvardır. Lenfokin aktive katil (LAK) hücreleri, tümöre infiltrasyon lu lenfositler (TILs), doğal öldürücü (NK) hücreleri, γδ T hücreleri ve sitokin kaynaklı öldürücü (CIK) hücreleri de dahil olmak üzere çeşitli efektör hücre popülasyonları benimseyen T hücre tedavisi (ACT)amaçlarıiçin geliştirilmiştir 1 . Cik hücrelerine artan bir ilgi vardır, çünkü otolog periferik kan mononükleer hücrelerden (PMBCs) 2'ye kadargenişlemiş sitokin kaynaklı sitotoksik hücre popülasyonlarının bir karışımını temsil ederler.
Lenfoid progenitor hücrelerinin kontrolsüz büyüme, miyeloblastlar, ve lenfoblastlar kan kanserlerinin üç ana türüne yol açar (yani, lösemi, lenfoma, ve miyelom), katı tümörler, karsinomlar dahil (örneğin, akciğer kanseri, mide kanseri, servikal kanser), ve sarkomlar, diğer kanserler arasında3. CIK hücreleri büyük histokompatibilite kompleksi geniş bir yelpazede sergileyen hücre popülasyonlarının bir karışımıdır (MHC)-sınırsız antitümör aktivitesi ve böylece hematolojik ve ileri tümörlerin tedavisi için söz tutun4,5,6,7. CIK hücreleri, T hücreleri (CD3+CD56−), NK-T hücreleri (CD3+CD56+ )ve NK hücreleri (CD3-CD56+ )dahil olmak üzere hücrelerin bir birleşimini oluşturur. IFN-γ, anti-CD3 antikor ve IL-2 eklenmesi için sabit bir program kullanarak CIK indüksiyon protokolünün optimizasyonu, CIK hücrelerinin genişlemesiile sonuçlanır8. Kanser hücrelerine karşı CIK hücrelerinin sitotoksik yeteneği esas olarak NK grup 2 üyesi D (C-tipi lektin benzeri reseptör ailesinin bir üyesi) Tümör hücreleri üzerinde NKG2D ligands nişan bağlıdır, ve perforin aracılı yollar9. Preklinik bir çalışmanın sonuçları IL-15-uyarılmış CIK hücrelerinin primer ve akut miyeloid lösemi hücre hatlarına infeksiyöz güçlü sitotoksisite indüklediği ve normal PBMC'lere ve fibroblastlara karşı daha düşük alloreaktivite sergilediği ni saptandı9. Son zamanlarda faz II klinik çalışmada miyeloid neoplazm tedavisi için nonmiyeloablatif allojeneik transplantasyon sonrası konsolidasyon olarak bir kerelik sağlıklı donör kaynaklı CIK (1 x 108/kg CD3+ hücre) infüzyonunun sonucuyayınlanmıştır.
Bu çalışmada, CIK üretimini artırmak için hematopoetik hücre ortamına IFN-γ, IL-1α, anti-CD3 antikor ve IL-2'den oluşan optimize edilmiş bir hücre kültürü formülü geliştirdik ve CIK hücrelerinin insan kroniklerine karşı sitotoksik etkisini araştırdık. miyeloid lösemi (K562) hücreleri ve yumurtalık kanseri (OC-3) hücreleri.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>7-Amino Actinomycin D</td>
			<td>BD</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse Anti-Human CD56 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555518</td>
			<td>B159</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555751</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSCanto II Flow Cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>338962</td>
			<td></td>
			<td>SN: R33896202856</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>BD</td>
			<td>565082</td>
			<td></td>
			<td>Reconstritution of CFSE dye (500 mg) with 90 mL of DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose solution</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>G8644</td>
			<td></td>
			<td>For K562 cell culture. Add 12.5 mL to 500 mL of complete medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/F12</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30023.02</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for OC-3 cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30084.03</td>
			<td></td>
			<td>For K562 and OC-3 cell culture. Complete medium contains 10% of FBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>71101700-EK</td>
			<td></td>
			<td>Density gradient solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse Anti-Human CD3 antibody</td>
			<td>BD</td>
			<td>555332</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC Mouse IgG1, &#954; Isotype Control</td>
			<td>BD</td>
			<td>555748</td>
			<td>MOPC-21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human anti-CD3 mAb</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>T210</td>
			<td>OKT3</td>
			<td>Add 2.5 mL of stock (1 mg/1 mL) to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
			<td>Add 5 mL of stock (10,000 U/mL) to 500 mL of complete medium. Storage stock at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proleukin</td>
			<td>NOVARTIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of Proleukin Powder (22x106 IU) with 1.2 mL of sterile water and add 2.7 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interferon-gamma</td>
			<td>CellGenix</td>
			<td>1425-050</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution of rh IFN-g (5x105 IU/50 &#181;g) with 200 &#181;L of sterile water and add 20 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human Interleukin-1 alpha</td>
			<td>PEPROTECH</td>
			<td>200-01A</td>
			<td></td>
			<td>Reconstitution rh IL-1&#945; (10 &#181;g) with 1 mL of sterile water and add 5 mL to 50 mL of Induction medium. Storage stock at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI1640 medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for K562 cell culture. Storage stock at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma 3-18K Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10295</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605028</td>
			<td></td>
			<td>Cell dissociation enzyme; For deattachment of adheren cells. Storage at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>X-VIVO 15 medium</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>04-418Q</td>
			<td></td>
			<td>Basal medium for PBMC and CIK cells. Storage at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and expansion of cytotoxic cytokine-induced killer t cells for cancer treatment

Benimseyen hücresel immünoterapi bağışıklık sistemi üzerinden kanser tanıma geri odaklanır ve etkili tümör hücre öldürme geliştirir. Sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücre tedavisi kanser hücrelerine karşı önemli sitotoksik etkileri uygulamak ve kanser tedavilerinde cerrahi, radyasyon ve kemoterapi nin olumsuz etkilerini azaltmak için bildirilmiştir. CIK periferik kan mononükleer hücreleri (PBMCs), kemik iliği ve göbek kordon kanı elde edilebilir. CIK hücreleri CD3+CD56+ ve doğal öldürücü (NK) fenotipik özellikleri ile T hücrelerinin heterojen bir alt popülasyonudur ve majör histokompatibilite kompleksi (MHC)-sınırsız antitümör aktivitesi içerir. Bu çalışmada PBMC kaynaklı CIK hücrelerinin hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitolitik yeteneğinin nicelleştirilmesi için klinik olarak uygulanabilir, akış sitometrisi esaslı bir yöntem açıklanmaktadır. Sitiyolitik sitalöz deyiş, CIK hücreleri prestained hedef tümör hücreleri ile farklı oranlarda birlikte inkübe edilir. Kuluçka döneminden sonra, hedef hücrelerin sayısı ölü hücreleri tespit etmek için nükleik asit bağlayıcı bir leke ile belirlenir. Bu yöntem hem araştırma hem de tanı uygulamaları için geçerlidir. CIK hücreleri, sitometre kurulumu ve takibi (CS & T) tabanlı akış sitometri sistemi ile klinik öncesi değerlendirme sonucunda kanser tedavisi için alternatif bir strateji olarak keşfilebilen güçlü sitotoksisiteye sahiptir.

Bu protokolün amacı, sitokin kaynaklı katil (CIK) T hücrelerini periferik kan monositlerinden izole etmek ve genişletmek ve CIK'in hematolojik malignite ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksik etkisini değerlendirmektir. CIK indüksiyonu CD3/CD56 tanıma ile tanımlanmıştır. Şekil 1A, CIK indüksiyonu ve genişlemesi için protokolü gösterir. Sağlıklı donörlerden CD3+CD56+ T hücrelerinin alt popülasyonunun analiz ine yönelik g...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment at JoVE.com

Isolation and Expansion of Cytotoxic Cytokine-induced Killer T Cells for Cancer Treatment

Burada periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyon ve genleşmesini gerçekleştirmek için bir protokol sunmaktayız- periferik kan mononükleer hücrelerden türetilmiş sitokin kaynaklı CD3+CD56+ öldürücü hücreler ve in vitro tanı akış sitometri sistemi kullanarak hematolojik ve katı kanser hücrelerine karşı sitotoksisite etkilerini göstermek.

Kanser Tedavisi için Sitotoksik Sitokin Kaynaklı Katil T Hücrelerinin İzolasyon ve Genişlemesi

Adoptive cellular immunotherapy focuses on restoring cancer recognition via the immune system and improves effective tumor cell killing. Cytokine-induced ...

PBMC kaynaklı sitokin kaynaklı katil T hücrelerinin genişlemesi ve kanserlere karşı sitotoksisitelerinin değerlendirilmesi için yüksek nitelikli ve klinik olarak uygulanabilir bir yöntemi optimize ettik. Bu tekniğin avantajı, hem bilimsel araştırma hem de klinik değerlendirmede sitokin kaynaklı öldürücü hücrelerin gücünü ölçmek için teknisyenler ve klinisyenler için standart bir işletim prosedürü sağlamaktır. Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi CIK hücrelerinin hazırlanmasıyla başlayın, ardından CIK hücrelerini 10 mililitre steril PBS ile yıkayın.Santrifüj 300 kez G ve 18-20 santigrat derece 10 dakika. Supernatant aspire ve PBS beş mililitre ile hücreleri resuspend. Trypan mavi dışlama testini kullanarak hücre numaralarını ve test hücrecanlılığını sayın.Aliquot CIK hücreleri altı steril 1.5 mililitre tüpler pBS mililitre başına yaklaşık 5 ila bir milyon hücre yoğunluğu. Metin protokolünde ayrıntılı olarak hücreleri etiketleyin ve tedavi edin. Cik hücrelerini en az üç kez bir mililitrelik steril pipetle hafifçe yukarı ve aşağı borulandırarak antikorlarla hafifçe karıştırın.Karanlıkta oda sıcaklığında hücreleri 15 dakika kuluçkaya yatırın. Tüpleri 300 kez G ve 18-20 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Santrifüjden sonra, süpernatant aspire ve PBS bir mililitre ile hücre pelet resuspend, sonra yavaşça bir mililitre steril pipet ile en az üç kez hücreleri pipet.Hücre süspansiyonunu steril beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpe aktarın ve bir hücre süzgeci kapağı ile kapağı hafifçe borulayarak, sonra tüpleri sırayla atlıkarıncaya yerleştirin. Akış sitometri sitometrisi analiz yazılımını açın ve deneysel bir klasör oluşturun, ardından deneye bir örnek ve tüp eklemek için yeni numune düğmesini tıklatın. Metin protokolünde listelenen tüpleri adlandırın.CIK hücre popülasyonları için bir dağılım gating sistemi oluşturmak için, önce tüp bir seçin ve bir FSCA SSCA çizimi oluşturmak için nokta çizim düğmesine tıklayın. Hücre enkazını dışlamak için FSCA eşiği 5000'den büyük olan tüm hücre popülasyonuna dikdörtgen bir geçit çizin. Yeni nokta çizimi için FSCA FSCH parametresini seçin ve tüm tek hücrelerin etrafına bir çokgen kapısı çizin.Yeni histogram çizimi için FITC konjuge CD3'e karşı sayım ve APC konjuge CD56 parametresine karşı sayma seçeneğini belirleyin. Yeni nokta çizimi için FITC konjuge CD3 ile APC konjuge CD56 parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört bir çeyrek kapısı çizin. Her numunedeki 20.000 tek hücreden gelen verileri kaydedin.Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için yük örneği düğmesini tıklatın. CD56 ve CD3 kanal parametrelerini kullanarak tüm CIK hücre popülasyonunu tanımlayın. CIK hücre popülasyonlarını analiz etmek ve analiz dosyalarına yeniden yazdırmak için tek tek numunenin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın.Sitotoksik titreci, coculture CIK ve insan kronik miyeloid lösemi K562 hücrelerini, her bir kuyuya mililitre K562 hücrelerini mililitrelik bir yoğunlukta, mililitre başına 5 milyon hücre ye ekleyerek gerçekleştirmek için, daha sonra altı kuyulu plakaya CIK hücreleri veya CIK hücresi olmayan bir mililitre bazal ortam ekleyin. Hücre süspansiyonlarını en az üç kez hafifçe yukarı ve aşağı boruile karıştırarak karıştırın. Plakayı 24 saat boyunca kuvöze yerleştirin.Şimdi, coculture CIK ve yumurtalık OC-3 hücreleri altı iyi plaka olarak metin protokolü listelenen veya CIK hücreleri olmadan bazal orta bir mililitre ekleyerek. Hücre süspansiyonlarını en az üç kez hafifçe yukarı ve aşağı boruile karıştırarak karıştırın. Tabağı 24 saat boyunca kuvöze koy.Kuluçkadan sonra CIK K562 hücre süspansiyonunu doğrudan 15 mililitrelik steril bir tüpe dönüştürün. CIK OC-3 gruplarından hem süspansiyon hem de yapışma hücrelerini hasat etmek için, önce hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik steril tüp aktarın. Steril PBS bir mililitre ile iyi yıkayın, PBS toplamak ve tüp ekleyebilirsiniz, sonra hücre ayrıştırma enzim çözeltisi 5 mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece beş dakika kuluçka.Çözeltinin bir mililitresini aynı tüpten ilgili kuyuya ekleyin ve hücreleri en az üç kez bir mililitresteril pipetle karıştırarak hafifçe karıştırın. Aynı tüp tüm hücreleri toplamak. 10 dakika boyunca 300 kez G santrifüj.Supernatant aspire ve steril PBS bir mililitre hücreleri resuspend. 10 dakika boyunca 300 kez G'deki hücreleri peletleyin, sonra süpernatantı aspire edin ve 100 mikrolitre steril PBS'de hücreleri yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna beş mikrolitre 7-AAD boya ekleyin.Bir mililitresteril pipet ile en az üç kez yukarı ve aşağı boru ile hücreleri yavaşça karıştırın. 10 dakika kuluçkaya yat ve analizden önce karanlıkta bırak. Sitoklitik yetenek tayini gerçekleştirmek için hücre süspansiyonu karıştırın ve akış sitometrisi için hazırlığı tekrarlayın.Deneye numune ve tüp eklemek için yeni numune düğmesini tıklatın. Metin protokolünde listelenen tüpleri adlandırın. Sitolitik töz için bir dağılım gating sistemi oluşturmak için, ilk tube bir seçin ve bir FSCA SSCA çizim oluşturmak için nokta çizim düğmesine tıklayın.Hücre enkazını dışlamak için 50.000'den büyük bir FSCA eşiği olan tüm olayların üzerine dikdörtgen bir kapı çizin. Yeni nokta çizimi için SSCA CFSE parametresini seçin, ardından yeni nokta çizimi için 7-AAD CFSE parametresini seçin ve dört alt popülasyonu tanımlamak için dört çeyreklikli bir kapı çizin. Önce boş kontrol örneğini analiz etmek için yük örneği düğmesini tıklatın.SSCA ve FSCA gerilimini ayarlayın. CFSE ve 7-AAD kanal parametrelerini kullanarak ölü hücre popülasyonunu belirleyin. Her numunede 20.000 CFSE pozitif hücreden daha fazla veri kaydedin.Canlı olmayan hücre popülasyonlarını çözümlemek için her bir örneğin istatistiksel değerlerini içeren dosyaları açın ve verileri analiz dosyalarına aktarın. Sağlıklı donörlerden CD-3 pozitif CD56 pozitif T-hücrelerinin alt popülasyonunun analiz ine yönelik gating stratejisinin temsili sonuçları, üç bireyden gelen CIK oranının istatistiksel analizi ile gösterilmiştir. CD-3 pozitif CD56 pozitif hücre oranı 14 günlük genişlemeden sonra önemli ölçüde artmıştır.Bu durum, 14. Bu kültür sisteminde, CIK hücreleri PBMCs orijinal sayısına göre yaklaşık yarım yüz kat değişiklikler verdi.CIK ve CFSE pozitif hücrelerin boyutu ve tanecikleri gösterilmiştir. CFSE lekeli K562 hücreleri, cik hücreleri ile sıfırdan bire bire, beşe bir ve 10'a bir oranında birlikte tedavi edildi. Bu hücreler ölü hücre dışlanması için canlılık sondası olarak 7-AAD boyaile boyanmıştır.CFSE pozitif K562 hücrelerinin 7-AAD pozitif hücrelerinin hepsi değerlendirildi. CFSE lekeli OC-3 hücreleri CIK hücreleri ile 10'a 1 oranında birlikte tedavi edildi. CIK'in OC-3 hücrelerine karşı belirgin sitotoksisitesi 24 saatlik kuluçka dan sonra burada gösterilmiştir.CIK T-hücrelerinin kanser hücrelerine karşı önemli sitotoksik etkiler uyguladığı ve kanser tedavilerinde cerrahi, radyasyon ve kemoterapinin olumsuz etkilerini azalttığı bildirilmiştir. İmmünoterapi kanserlerin bir dizi için umut verici bir tedavi yöntemidir. CIK, daha fazla otolog infüzyon için GMP dereceli durumda hasta kaynaklı PMCB'lerin kuluçkaya yatarak invitro olarak verimli bir şekilde genişletilebilir.Bu protokolü takiben, daha fazla klinik kanser tedavisi için GTP veya GMP dereceli bir tesiste bağışıklık hücreli tedavi uygulayabiliriz.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Generation and Isolation of Cell Cycle-arrested Cells with Complex Karyotypes

Üretimi ve yalıtım karmaşık Karyotypes içeren hücrelerin hücre döngüsü tutuklandı

Chromosome mis-segregation leads to aneuploidy, a condition in which cells harbor an imbalanced chromosome number. Several lines of evidence strongly ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

Syngeneic fare B hücreli lenfoma manken CD19 araba T hücrelerinin önceden klinik değerlendirme için

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Preparation of Exosomes for siRNA Delivery to Cancer Cells

SiRNA kanser hücrelerinin teslim için Exosomes hazırlanması

Extracellular vesicles, in particular exosomes, have recently gained interest as novel drug delivery vectors due to their biological origin, abundance, ...

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cells for Adoptive Immunotherapy

Manufacturing Chimeric Antigen Receptor CAR T Cells for Adoptive Immunotherapy

İmal İmmünoterapi için İmkanerik Antijen Reseptör (CAR) T Hücreleri

Adoptive immunotherapy holds promise for the treatment of cancer and infectious disease. We describe a simple approach to transduce primary human T cells ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from SÃƒÆ’Ã‚Â©zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Transkriptomik Profilleme için İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin ve CD4 + T hücrelerinin Sézary Sendromu Hastalarından İzole Edilmesi

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta ÃƒÅ½Ã‚Â³ÃƒÅ½Ã‚Â´ T Cells from Apheresed Human Product

Aferezli İnsan Ürününden Gama-Delta (φδ) T Hücrelerinin Genişlemesi ve Zenginleştirilmesi

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Primer, Malign Plevral Mezotelyoma Tümör Hatlarının Oluşumu ve Genleşmesi

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...