Subcellulære fraktionering af primære kroniske Lymfocytiske leukæmiceller til at overvåge nuklear/cytoplasmisk protein handel

Udvikling af teknikker til at undersøge transport af makromolekyler mellem kernen og cytoplasmaet, og identificere fejllokalisering af tumor suppressor proteiner er afgørende for at få en dybere forståelse af CLL patogenese og støtte i udviklingen af nye behandlingsformer. Denne protokol giver en hurtig og effektiv metode til generering af nukleare og cytoplasmatiske fraktioner fra primære CLL-celler. Disse fraktioner kan anvendes i downstream-forsøg, herunder enzymaktivitetsanalyser, proteomisk analyse og vestlig blotting.

Denne teknik vil udvide vores forståelse af, hvordan behandlinger og mikro-miljømæssige signaler i tumorer ændre shuttling af proteiner mellem kernen og cytoplasmaet i CLL-celler og potentielt andre B-celle maligniteter. Denne metode kan bruges til at bestemme placeringen af proteiner og/eller tiltrække proteinbevægelser efter gældende. Udfør et vaskemiddelgradient på hver enkelt cellelinje, du planlægger at bruge for at sikre den optimale generering af højt berigede nukleare og cytoplasmatiske fraktioner.

Sammen med Jodie Hay og Michael Moles, der viser denne procedure vil være Jennifer Cassels, en tekniker fra mit laboratorium. Få perifere blodprøver fra tidligere samtykkede kronisk lymfocytiske leukæmi patienter i EDTA blodprøvetagningsrør, ledsaget af den hvide celletal. Humane blodprøver bør betragtes som farlige, da de potentielt indeholder blodbårne vira.

Sørg for, at disse prøver håndteres i et klasse to biosikkerhedsskab, og at brugeren altid har en laboratoriekittel og handsker på. Bortskaf blodforurenede materialer i desinfektionsmidler. Hvis antallet af hvide celler er lig med eller større end 40 millioner celler pr. milliliter, fortyndes prøven i et forhold på 1-1 med RT CLL-vaskebuffer.

Derefter aliquot RT tæthed gradient medium i en passende størrelse konisk centrifuge rør til prøven. Lag forsigtigt prøven oven på mediet og centrifugen ved 400 x g i 30 minutter ved RT. Ved hjælp af en plast Pasteur pipette, forsigtigt høste det hvide lag af mononukleare celler, der indsamles på grænsefladen af densitet gradient medium i CLL vask buffer. Dette isolerede monolag overføres til et friskt konisk centrifugerør på 50 milliliter.

For at vaske cellerne tilsættes 40 milliliter CLL-vaskebuffer til dette monolag og centrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Kassér supernatanten, svirp bunden af røret for at re-suspendere pellet, og gentag denne vask. Kassér supernatanten, svirp bunden af røret igen, og ophæng derefter cellepellet igen i et sæt volumen CLL-vaskebuffer afhængigt af pellets størrelse.

Efter optælling af cellerne og efter flow cytometri for at kontrollere celle renhed, placere cellerne i væv kultur plader på den krævede celletæthed klar til stimulation eller narkotikabehandling. Efter stimulation og/eller lægemiddelbehandling er inkubationen afsluttet. Cellerne overføres til individuelt mærkede 1,5 milliliter mikrofugerør og pellet ved centrifugering ved 200 x g i fem minutter ved fire grader Celsius.

Efter udsmid af supernatanten skal cellepellet igen hænges i en milliliter iskold PBS med fosfatasehæmmere. Centrifuge ved 200 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatant og holde disse hele celle ekstrakt pellets på is til yderligere præparater.

For at forberede cytoplasmatiske fraktioner, forsigtigt re-suspendere celle pellets i 50 mikroliter af 1x hypertonisk buffer. For at lade cellerne svulme op, inkubere dem på is i 15 minutter. Efter en udførelse af et vaskemiddelgradient for at bestemme den optimale koncentration af vaskemiddel, der skal anvendes til en bestemt celletype, tilsættes 0,8 til 2,5 mikroliter vaskemiddel i hver prøve og vortex på den højeste indstilling i 10 sekunder.

For at kontrollere cellelyse observeres cellerne under et fasekontrastmikroskop før og efter tilsætning af vaskemiddel. Alle celler har en tæt, mørk kerne omgivet af cytoplasmaet, der vises som en lys glorie. Når lysed, centrifuge prøverne ved 14, 000 x g i 30 sekunder ved fire grader Celsius.

Forsigtigt, uden at forstyrre pellet, overføre supernatant i en pre-kølet mærket mikrofuge rør og gemme denne cytoplasmatiskfraktion ved 80 grader Celsius indtil videre analyse. Sørg for fuldstændig fjernelse af den cytoplasmatiske fraktion for at forhindre kontaminering af den nukleare fraktion. Til den resterende pellet, som indeholder den nukleare fraktion, tilsættes 50 mikroliter af komplet lysis buffer og re-suspendere ved pipettering op og ned.

For at opløse proteiner forbundet med den nukleare membran, tilsæt 2,5 mikroliter af vaskemiddel, vortex på den højeste indstilling i 10 sekunder, og inkubere på is i 30 minutter. Vortex på den højeste indstilling i 30 sekunder og centrifuge. Overfør derefter supernatanten til et forkølet mikrofugerør og opbevar denne kernefraktion ved 80 grader Celsius indtil videre analyse.

For hele cellelysater skal hele celleekstraktpillerne suspenderes igen i 100 mikroliter af komplet lysisbuffer ved at pipettere op og ned. For at sikre fuldstændig cellelyse tilsættes fem mikroliter vaskemiddel og inkuberes på is i 30 minutter. Vortex på den højeste indstilling i 30 sekunder og derefter centrifuge ved 14, 000 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius.

Overfør supernatanten til et forkølet mikrofugerør og opbevar hele denne celle lysate ved 80 grader Celsius indtil videre analyse. For at kvantificere proteinhandel mellem nukleare og cytoplasmatiske fraktioner, udføre kvantitative vestlige blot analyse og importere billederne. Hvis du vil have vist billedet på båndet Billede, skal du klikke på knappen Vælg i gruppen Vis og klikke på Chemi Channel.

Dialogboksen Vælg skærm åbnes for at aktivere yderligere justeringer, hvis det er nødvendigt. Implementer yderligere forbedringer ved hjælp af de justerbare skydere på billedet LUT's fane, herunder lysstyrke eller kontrast. Brug fanen Kurver til finere justeringer.

Klik først på båndet Analyse for at få dataanalyse. Hvis du kun vil analysere én kanal, skal du fravælge de kanaler, der ikke analyseres, ved at klikke på en kanals Miniaturebillede Af kanal, så kun den ønskede kanal vises. Hvis du vil kvantificere signalintensiteten, skal du klikke på Tilføj rektangel for at føje rektangler til billedet.

Klik på midten af en funktion, f.eks. Når du har tilføjet de ønskede figurer, skal du klikke på Marker for at returnere markøren til markeringsværktøjet. Hvis du vil trække baggrundsstøjen fra, skal du klikke på den første knap i gruppen Baggrund og vælge Median i rullemenuen.

Angiv kantbredden til tre i dialogboksen Baggrund, og vælg de segmenter, der bedst repræsenterer den billedbaggrund, der skal bruges til baggrundsberegning. Hvis du vil eksportere dataene, skal du klikke på fanen Figurer over tabellen. For densitometri kræves der værdier i kolonnen Signal.

Signal er summen af pixelintensitetsværdierne eller totalen for en figur minus produktet af baggrunden i området. Klik derefter på knappen Rapport, klik på Gem som eller Start regneark. For at beregne normaliseret udtryk for det protein af interesse for hvert plan eller variabel i det gemte regneark, dividere det opnåede signal for protein af interesse ved signalet for det tilsvarende protein belastning kontrolbånd.

Hvis du vil eksportere billedet, skal du klikke på fanen Billeder, der findes over tabellen, og derefter klikke på det billede, der skal eksporteres. Hvis du bruger billedet til en diaspræsentation eller andre digitale formater, skal du klikke på softwareikonet, holde markøren over Eksporter, klikke på Billede til Digitale Medier og derefter gemme billedet efter behov. Berigelse af CLL-celler med en WCC på over 40 millioner pr. milliliter ved hjælp af massecentrifugering muliggør en høj cellegendannelse.

Analyse af prøven efter flowcytometri efter gating på FSC og SSC viser, at renheden af CLL-celler er mere end 95%, som det fremgår af det dobbelte overfladeudtryk af CLL-cellemærker, CD19 og CD5. Når immunafler blev udført på de resulterende fraktioner af CLL-cellelinjen, Mac-1 og primære CLL-celler, indikerede fraktionering, at det optimale rengøringsmiddelniveau for Mac-1-celler var en til 60 fortynding sammenlignet med en til 30 for primære CLL-celler. Ved subcellulær lokalisering af FOXO1 i nukleare og cytoplasmatiske fraktioner blev bestemt i Mac-1 og primære CLL-celler, blev generering af højt berigede fraktioner vist ved det næsten eksklusive udtryk for lamin i det nukleare og beta Tubulin i de cytoplasmatiske fraktioner.

FOXO1-udtrykket blev reduceret i cytoplasmaet efter behandling med AZD 8055 sammenlignet med NDC, ledsaget af en stigning i FOXO1-udtrykket i det nukleare rum, hvilket viste proteintranslokation. Efter at individuelle immunbloks fra fem primære CLL-prøver blev kvantificeret inden for delcellulære fraktioner, blev AZD 8055 fundet at reducere niveauet af FOXO1 udtryk i cytoplasmaet og øge udtrykket i kernen. BCR krydsbinding øget cytoplasmatisk FOXO1 udtryk.

Husk at opbevare alle reagenser og prøver på is for at forhindre proteinnedbrydning. De delcellulære fraktioner, der genereres i denne procedure, kan også anvendes i enzymaktivitetsanalyser såsom en FOXO-aktivitetsanalyse, som gør det muligt at drage paralleller mellem FOXO1's cellulære placering og dens DNA-bindingsaktivitet. Udviklingen af denne teknik har gjort det muligt for os at håndtere handel med specifikke proteiner i CLL-celler som reaktion på selektive inhibitorer og understøtter vores parallelle immunfluorescensundersøgelser for at generere et robust og kvantificerbart datasæt.