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October 23rd, 2019
DOI :
October 23rd, 2019
•0:05
Title
1:22
Isolation of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) Cells from Patient Blood Samples
3:23
Preparation of Subcellular Fractions from CLL Cells
5:54
Preparation of Whole Cell Lysates (WCL) from CLL Cells
6:32
Downstream Analysis of Subcellular Fractions
8:59
Results: Analysis of Subcellular Fractionation of Primary Chronic Lymphocytic Leukemia Cells
10:47
Conclusion
Transcript
नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच मैक्रोमॉलिक्यूल्स के परिवहन की जांच करने के लिए तकनीकों का विकास करना, और ट्यूमर दबाने वाले प्रोटीन के गलत तरीके की पहचान करना सीएलएल रोगजननों की गहरी समझ हासिल करने और उपन्यास उपचारों के विकास में सहायता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। यह प्रोटोकॉल प्राथमिक सीएलएल कोशिकाओं से परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंश पैदा करने के लिए एक तेज और कुशल विधि प्रदान करता है। इन अंशों का उपयोग एंजाइम गतिविधि परख, प्रोटेओमिक विश्लेषण और पश्चिमी ब्लॉटिंग सहित डाउनस्ट्रीम प्रयोगों में किया जा सकता है।
यह तकनीक ट्यूमर के भीतर उपचार और सूक्ष्म पर्यावरणीय संकेतों के बारे में हमारी समझ को व्यापक करेगी कि सीएलएल कोशिकाओं और संभावित अन्य बी सेल घातक में नाभिक और साइटोप्लाज्म के बीच प्रोटीन की शटल को कैसे बदल दिया जाता है। इस विधि का उपयोग प्रोटीन के स्थान को निर्धारित करने और/या लागू प्रोटीन आंदोलन को आकर्षित करने के लिए किया जा सकता है । प्रत्येक व्यक्तिगत सेल लाइन पर डिटर्जेंट ढाल का प्रदर्शन करें, जिसे आप अत्यधिक समृद्ध परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों की इष्टतम पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए उपयोग करने की योजना बना रहे हैं।
Jodie सूखी घास और माइकल Moles के साथ, इस प्रक्रिया का प्रदर्शन जेनिफर Cassels, मेरी प्रयोगशाला से एक तकनीशियन होगा । सफेद सेल गिनती के साथ, EDTA रक्त संग्रह ट्यूबों में पहले से सहमति पुरानी लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया रोगियों से परिधीय रक्त के नमूने प्राप्त करें। मानव रक्त के नमूनों को खतरनाक माना जाना चाहिए क्योंकि उनमें संभावित रूप से रक्त जनित वायरस होते हैं ।
कृपया सुनिश्चित करें कि इन नमूनों को एक वर्ग दो जैव सुरक्षा कैबिनेट में संभाला जाता है और उपयोगकर्ता हर समय एक प्रयोगशाला कोट और दस्ताने पहने हुए है । कीटाणुनाशक में रक्त-दूषित सामग्रियों का निपटान करें। यदि सफेद कोशिका गिनती प्रति मिलीलीटर 40 मिलियन कोशिकाओं के बराबर या उससे अधिक है, तो नमूना को आरटी सीएलएल वॉश बफर के साथ एक से एक के अनुपात में पतला करें।
फिर नमूने के लिए उचित आकार की शंकुकेंद्रित्र ट्यूब में एलिकोट आरटी घनत्व ढाल माध्यम। ध्यान से आर टी पर 30 मिनट के लिए 400 x ग्राम पर मध्यम और अपकेंद्रित्र के शीर्ष पर नमूना परत। एक प्लास्टिक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके, सीएलएल वॉश बफर में घनत्व ढाल माध्यम के इंटरफेस पर एकत्र मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं की सफेद परत को धीरे-धीरे फसल करें। इस पृथक मोनोलेयर को एक ताजा 50-मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें।
कोशिकाओं को धोने के लिए, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर इस मोनोलेयर और अपकेंद्रित्र में सीएलएल धोने बफर के 40 मिलीलीटर जोड़ें। सुपरनैंट को त्यागें, गोली को फिर से निलंबित करने के लिए ट्यूब के नीचे झटका, और इस धोने को दोहराएं। सुपरनैंट को त्यागें, ट्यूब के नीचे फिर से झटका दें, और फिर गोली के आकार के आधार पर सीएलएल वॉश बफर की एक निर्धारित मात्रा में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें।
कोशिकाओं की गिनती के बाद और प्रवाह साइटोमेट्री के बाद कोशिका शुद्धता की जांच करने के लिए, उत्तेजना या दवा उपचार के लिए तैयार आवश्यक सेल घनत्व पर ऊतक संस्कृति प्लेटों में कोशिकाओं जगह है । उत्तेजना और/या दवा उपचार के बाद, इनक्यूबेशन पूरा हो गया है । कोशिकाओं को व्यक्तिगत रूप से लेबल १.५-मिलीलीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब और गोली में स्थानांतरित करने के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए २०० x g पर अपकेंद्रित्र द्वारा ।
सुपरनेट को छोड़ने के बाद, फॉस्फेट अवरोधकों के साथ बर्फ-ठंडे पीबीएस के एक मिलीलीटर में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें। चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए २०० एक्स जी पर सेंट्रलाइज । सुपरनेट निकालें और आगे की तैयारी के लिए बर्फ पर इन पूरे सेल निकालने छर्रों रखें।
साइटोप्लाज्मिक अंश तैयार करने के लिए, धीरे-धीरे 1x हाइपरटॉनिक बफर के 50 माइक्रोलीटर में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। कोशिकाओं को प्रफुल्लित करने की अनुमति देने के लिए, उन्हें 15 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। एक विशिष्ट सेल प्रकार के लिए उपयोग करने के लिए डिटर्जेंट की इष्टतम एकाग्रता निर्धारित करने के लिए डिटर्जेंट ढाल प्रदर्शन करने के बाद, प्रत्येक नमूने में डिटर्जेंट के 0.8 से 2.5 माइक्रोलीटर जोड़ें और 10 सेकंड के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर।
सेल लाइसिस को सत्यापित करने के लिए, डिटर्जेंट के अलावा और बाद में एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें। सभी कोशिकाओं में एक घना, अंधेरा नाभिक होता है जो साइटोप्लाज्म से घिरा होता है जो एक उज्ज्वल प्रभामंडल के रूप में दिखाई देता है। एक बार lysed, चार डिग्री सेल्सियस पर 30 सेकंड के लिए 14, 000 x ग्राम पर नमूनों अपकेंद्रित्र ।
ध्यान से, गोली को परेशान किए बिना, सुपरनिटेंट को पूर्व-ठंडा लेबल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और आगे के विश्लेषण तक 80 डिग्री सेल्सियस पर इस साइटोप्लाज्मिक अंश को स्टोर करें। परमाणु अंश के संदूषण को रोकने के लिए साइटोप्लाज्मिक अंश को पूरी तरह से हटाना सुनिश्चित करें। शेष गोली, जिसमें परमाणु अंश होता है, में पूर्ण लाइसिस बफर के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे पाइपिंग करके फिर से निलंबित करें।
परमाणु झिल्ली से जुड़े प्रोटीन को घुलनशील बनाने के लिए, डिटर्जेंट के 2.5 माइक्रोलीटर, 10 सेकंड के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर जोड़ें, और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 30 सेकंड और अपकेंद्रित्र के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर। फिर सुपरनिटेंट को पूर्व-ठंडा लेबल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और आगे के विश्लेषण तक इस परमाणु अंश को 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
पूरी सेल लाइसेट्स के लिए, पूरी तरह से लाइसिस बफर के 100 माइक्रोलीटर में पूरे सेल निकालने छर्रों को फिर से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके निलंबित करें। पूरी तरह से सेल लाइसिस सुनिश्चित करने के लिए, डिटर्जेंट के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। 30 सेकंड के लिए उच्चतम सेटिंग पर भंवर और फिर चार डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 14, 000 x g पर अपकेंद्रित्र ।
सुपरनेट को प्री-ठंडा माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और आगे के विश्लेषण तक इस पूरे सेल को 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों के बीच प्रोटीन तस्करी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, मात्रात्मक पश्चिमी दाग विश्लेषण करें और छवियों का आयात करें । इमेज रिबन में इमेज डिस्प्ले करने के लिए डिस्प्ले ग्रुप में चुनें बटन पर क्लिक करें और केमी चैनल पर क्लिक करें।
यदि आवश्यक हो तो आगे समायोजन सक्षम करने के लिए चुनें डिस्प्ले संवाद खुलेगा। चमक या विपरीत सहित छवि LUT के टैब पर समायोज्य स्लाइडर्स का उपयोग कर अतिरिक्त संवर्द्धन लागू करें। महीन समायोजन के लिए घटता टैब का उपयोग करें।
डेटा विश्लेषण के लिए, सबसे पहले विश्लेषण रिबन पर क्लिक करें। केवल एक चैनल का विश्लेषण करने के लिए, चैनल के नॉट शो चैनल थंबनेल पर क्लिक करके विश्लेषण नहीं किए जा रहे चैनलों का चयन करें, केवल वांछित चैनल प्रदर्शित किया गया है। सिग्नल की तीव्रता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, छवि में आयत जोड़ने के लिए आयत जोड़ें क्लिक करें।
इसके चारों ओर आयत रखने के लिए प्रोटीन बैंड जैसी सुविधा के केंद्र पर क्लिक करें। वांछित आकृतियों को जोड़ने के बाद, चयन उपकरण पर कर्सर वापस करने के लिए चुनें पर क्लिक करें। बैकग्राउंड शोर को घटाने के लिए बैकग्राउंड ग्रुप में पहले बटन पर क्लिक करें और ड्रॉपडाउन मेन्यू से मीडियन का चयन करें ।
पृष्ठभूमि संवाद में सीमा की चौड़ाई तीन तक सेट करें और उन सेगमेंट का चयन करें जो पृष्ठभूमि गणना के लिए उपयोग की जाने वाली छवि पृष्ठभूमि का सबसे अच्छा प्रतिनिधित्व करते हैं। डेटा निर्यात करने के लिए, टेबल के ऊपर आकृतियों टैब पर क्लिक करें। घनत्व के लिए, सिग्नल कॉलम में मानों की आवश्यकता होती है।
सिग्नल पिक्सेल तीव्रता मूल्यों का योग है या क्षेत्र में पृष्ठभूमि के उत्पाद को शून्य से आकार के लिए कुल है। इसके बाद रिपोर्ट बटन पर क्लिक करें, सेव एएस या लॉन्च स्प्रेडशीट पर क्लिक करें। सहेजे गए स्प्रेडशीट के भीतर प्रत्येक विमान या चर के लिए ब्याज के प्रोटीन की सामान्यीकृत अभिव्यक्ति की गणना करने के लिए, संबंधित प्रोटीन लोडिंग नियंत्रण बैंड के लिए संकेत द्वारा ब्याज के प्रोटीन के लिए प्राप्त संकेत को विभाजित करें।
छवि को निर्यात करने के लिए, तालिका के ऊपर पाए गए इमेज टैब पर क्लिक करें और फिर निर्यात की जाने वाली छवि पर क्लिक करें। यदि स्लाइड प्रस्तुति या अन्य डिजिटल प्रारूपों के लिए छवि का उपयोग कर रहे हैं, तो सॉफ्टवेयर आइकन पर क्लिक करें, निर्यात पर मंडराएं, डिजिटल मीडिया के लिए छवि पर क्लिक करें, और फिर आवश्यकतानुसार छवि को सहेजें। घनत्व अपकेंद्रित्र का उपयोग करके 40 मिलियन प्रति मिलीलीटर से अधिक डब्ल्यूसीसी के साथ सीएलएल कोशिकाओं का संवर्धन एक उच्च सेल वसूली में सक्षम बनाता है।
एफएससी और एसएससी पर गेटिंग के बाद फ्लो साइटोमेट्री द्वारा नमूने के विश्लेषण से पता चलता है कि सीएलएल कोशिकाओं की शुद्धता 95% से अधिक है जैसा कि सीएलएल सेल मार्कर, सीडी 19 और सीडी 5 की दोहरी सतह अभिव्यक्ति द्वारा इंगित किया गया है। जब सीएलएल सेल लाइन, मैक-1 और प्राथमिक सीएलएल कोशिकाओं के परिणामी अंशों पर इम्यूनो ब्लॉट्स किए गए थे, तो अंश ने संकेत दिया कि मैक-1 कोशिकाओं के लिए इष्टतम डिटर्जेंट स्तर एक से 60 कमजोर पड़ने पर था, जबकि प्राथमिक सीएलएल कोशिकाओं के लिए एक से 30 की तुलना में। जब मैक-1 और प्राथमिक सीएलएल कोशिकाओं में परमाणु और साइटोप्लाज्मिक अंशों में फॉक्सओ 1 का उपकोशिकीय स्थानीयकरण निर्धारित किया गया था, तो अत्यधिक समृद्ध अंशों की पीढ़ी को परमाणु और बीटा तुबुलिन में लैमिन की लगभग अनन्य अभिव्यक्ति द्वारा साइटोप्लाज्मिक अंशों में दिखाया गया था।
ओज़डी 8055 के साथ उपचार के बाद साइटोप्लाज्म में FOXO1 अभिव्यक्ति कम हो गई थी, एनडीसी की तुलना में, परमाणु डिब्बे में FOXO1 अभिव्यक्ति की वृद्धि के साथ, इस प्रकार प्रोटीन स्थानांतरण का प्रदर्शन किया गया। पांच प्राथमिक सीएलएल नमूनों से व्यक्तिगत इम्यूनो ब्लॉट्स को उपकोशिकीय अंशों के भीतर निर्धारित किया गया था, AZD 8055 को साइटोप्लाज्म में FOXO1 अभिव्यक्ति के स्तर को कम करने और नाभिक में अभिव्यक्ति को बढ़ाने के लिए पाया गया था। बीसीआर क्रॉस-लिंकिंग बढ़ी हुई साइटोप्लाज्मिक FOXO1 अभिव्यक्ति।
प्रोटीन क्षरण को रोकने के लिए बर्फ पर सभी अभिकर्ण और नमूने रखना याद रखें। इस प्रक्रिया में उत्पन्न उपकोशिकीय अंशों का उपयोग एंजाइम गतिविधि परख में भी किया जा सकता है जैसे कि फॉक्सओ गतिविधि परख, जो फॉक्सओ1 के सेलुलर स्थान और इसकी डीएनए बाध्यकारी गतिविधि के बीच समानांतरों को तैयार करने में सक्षम बनाता है। इस तकनीक के विकास ने हमें चुनिंदा अवरोधकों के जवाब में सीएलएल कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट प्रोटीन की तस्करी को संबोधित करने में सक्षम बनाया है और एक मजबूत और मात्रात्मक डेटासेट उत्पन्न करने के लिए हमारे समानांतर इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययनों का समर्थन करता है।
इस प्रोटोकॉल अनुकूलन और प्राथमिक क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं से परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों के बाद कुशल पीढ़ी सक्षम बनाता है। इन नमूनों को प्रोटीन स्थानीयकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन की तस्करी है कि सेल उत्तेजना और दवा उपचार पर परमाणु और कोशिका द्रव्य डिब्बों के बीच जगह ले में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
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