Subcellulære Fraksjonering av primær kronisk lymfatisk leukemi celler til å overvåke kjernefysisk/cytoplasmatiske protein smugling

Utvikle teknikker for å undersøke transport av makromolekyler mellom kjernen og cytoplasma, og identifisere mislokalisering av tumor suppressor proteiner er viktig for å få en dypere forståelse av KLL patogenese og hjelp i utviklingen av nye terapier. Denne protokollen gir en rask og effektiv metode for å generere kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner fra primære KLL-celler. Disse brøkene kan brukes i nedstrøms eksperimenter, inkludert enzymaktivitetsanalyser, proteomisk analyse og vestlig blotting.

Denne teknikken vil utvide vår forståelse av hvordan terapier og mikromiljøsignaler innen svulster endrer stenging av proteiner mellom kjernen og cytoplasma i KLL-celler og potensielt andre B-celle maligniteter. Denne metoden kan brukes til å bestemme plasseringen av proteiner og / eller tiltrekke proteinbevegelse som aktuelt. Utfør en vaskemiddelgradient på hver enkelt cellelinje du planlegger å bruke for å sikre den optimale generasjonen av høyt berikede kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner.

Sammen med Jodie Hay og Michael Moles, viser denne prosedyren vil være Jennifer Cassels, en tekniker fra laboratoriet mitt. Få perifere blodprøver fra tidligere samtykket kronisk lymfatisk leukemi pasienter i EDTA blodinnsamling rør, ledsaget av hvite blodlegemer. Blodprøver fra mennesker bør betraktes som farlige, da de potensielt inneholder blodbårne virus.

Pass på at disse prøvene håndteres i et biosikkerhetsskap i klasse to, og at brukeren har på seg laboratoriefrakk og hansker til enhver tid. Kast blodforurensede materialer i desinfeksjonsmidler. Hvis antallet hvite celler er lik eller større enn 40 millioner celler per milliliter, fortynne prøven i forholdet mellom én og én med RT KLL-vaskebuffer.

Deretter aliquot RT tetthet gradient medium i en passende størrelse konisk sentrifuge rør for prøven. Lag prøven forsiktig på toppen av mediet og sentrifuge ved 400 x g i 30 minutter ved RT. Ved hjelp av en limesaltte av plast høster du forsiktig det hvite laget av mononukleære celler som samles i grensesnittet til tetthetsgradientmediet i KLL-vaskebuffer. Overfør denne isolerte monolayeren til et friskt konisk sentrifugrør på 50 milliliter.

For å vaske cellene, tilsett 40 milliliter KLL vaskebuffer til denne monolayer og sentrifuge ved 300 x g i 10 minutter ved romtemperatur. Kast det overnaturlige, knips bunnen av røret for å suspendere pelleten på nytt, og gjenta denne vasken. Kast det overnaturlige, knips bunnen av røret igjen, og deretter suspendere cellepelleten på nytt i et angitt volum av KLL-vaskebuffer avhengig av størrelsen på pelleten.

Etter å ha talt cellene og etter strømningcytometri for å sjekke cellerensiteten, legg cellene i vevskulturplater ved ønsket celletetthet klar for stimulering eller medikamentbehandling. Etter stimulering og/eller medikamentbehandling er inkubasjonen fullført. Overfør cellene til individuelt merkede 1,5-milliliter mikrofuge rør og pellet ved sentrifuging på 200 x g i fem minutter ved fire grader Celsius.

Etter å ha kastet det overnaturante, må du suspendere cellepelleten på en milliliter iskald PBS med fosfatasehemmere. Sentrifuge på 200 x g i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern supernatanten og hold disse hele celleekstraktpellets på is for ytterligere preparater.

For å forberede cytoplasmatiske fraksjoner, forsiktig re-suspendere cellepellets i 50 mikroliter av 1x hypertonisk buffer. For å la cellene hovne opp, inkuber dem på is i 15 minutter. Etter en utførende vaskemiddelgradient for å bestemme den optimale konsentrasjonen av vaskemiddel som skal brukes for en bestemt celletype, legg til 0,8 til 2,5 mikroliter vaskemiddel i hver prøve og virvel på høyeste innstilling i 10 sekunder.

For å verifisere cellelys, observere cellene under et fasekontrastmikroskop før og etter tilsetning av vaskemiddel. Alle celler har en tett, mørk kjerne omgitt av cytoplasma som vises som en lys glorie. Når lysed, sentrifugere prøvene på 14, 000 x g i 30 sekunder ved fire grader Celsius.

Forsiktig, uten å forstyrre pelleten, overfør supernatanten til et forhåndskjølt merket mikrodrivstoffrør og lagre denne cytoplasmatiske fraksjonen ved 80 grader Celsius til videre analyse. Sørg for fullstendig fjerning av cytoplasmatisk fraksjon for å hindre forurensning av atomfraksjonen. Til den gjenværende pelleten, som inneholder atomfraksjonen, legger du til 50 mikroliter med komplett lysisbuffer og re-suspendere ved å pipettere opp og ned.

For å løse proteiner forbundet med kjernemembranen, tilsett 2,5 mikroliter vaskemiddel, vortex på høyeste innstilling i 10 sekunder, og inkuber på is i 30 minutter. Vortex på høyeste innstilling i 30 sekunder og sentrifuge. Overfør deretter supernatanten til et forhåndskjølt merket mikrodrivstoffrør og lagre denne kjernefysiske fraksjonen ved 80 grader Celsius til videre analyse.

For hele cellelylater, re-suspendere hele cellen ekstrakt pellets i 100 mikroliter med komplett lysis buffer ved å pipettering opp og ned. For å sikre fullstendig cellelys, tilsett fem mikroliter vaskemiddel og inkuber på is i 30 minutter. Vortex på høyeste innstilling i 30 sekunder og deretter sentrifuge på 14, 000 x g i 20 minutter ved fire grader Celsius.

Overfør supernatanten til et forkjølet mikrodrivstoffrør og lagre hele denne cellen lysate på 80 grader Celsius til videre analyse. For å kvantifisere proteinhandel mellom kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner, utfør kvantitativ vestlig flekkanalyse og importer bildene. For å vise bildet på Bilde-båndet, klikk på Velg knappen i Skjerm-gruppen og klikk på Chemi Channel.

Dialogboksen Velg skjerm åpnes for å aktivere ytterligere justeringer om nødvendig. Implementer flere forbedringer ved hjelp av de justerbare glidebryterne på bildet LUT-fanen, inkludert lysstyrke eller kontrast. Bruk Kategorien Kurver for finere justeringer.

For dataanalyse klikker du først Analyse-båndet. Hvis du bare vil analysere én kanal, fjerner du merket for kanalene som ikke analyseres, ved å klikke på miniatyrbildet av Ikke vis kanal på en kanal, slik at bare den ønskede kanalen vises. Hvis du vil kvantifisere signalintensiteten, klikker du Legg til rektangel for å legge til rektangler i bildet.

Klikk midten av en funksjon, for eksempel et proteinbånd for å plassere et rektangel rundt den. Når du har lagt til de ønskede figurene, klikker du Velg for å gå tilbake til markeringsverktøyet. Hvis du vil trekke fra bakgrunnsstøy, klikker du den første knappen i Bakgrunn-gruppen og velger Median fra rullegardinmenyen.

Angi kantlinjebredden til tre i bakgrunnsdialogboksen, og velg segmentene som best representerer bildebakgrunnen som skal brukes til bakgrunnsberegning. Hvis du vil eksportere dataene, klikker du kategorien Figurer over tabellen. For tettsitometri kreves verdier i Signal-kolonnen.

Signal er summen av pikselintensitetsverdiene eller totalen for en figur minus produktet av bakgrunnen i området. Klikk deretter på Rapport-knappen, klikk Lagre som eller Start regneark. For å beregne normalisert uttrykk for protein av interesse for hvert plan eller variabel i det lagrede regnearket, del det oppnådde signalet for protein av interesse ved signalet for det tilsvarende proteinlastekontrollbåndet.

Hvis du vil eksportere bildet, klikker du kategorien Bilder som finnes over tabellen, og deretter klikker du på bildet som skal eksporteres. Hvis du bruker bildet for en lysbildepresentasjon eller andre digitale formater, klikker du programvareikonet, holder musepekeren over Eksporter, klikker på Bilde for digitale medier og lagrer deretter bildet etter behov. Berikelse av KLL-celler med en WCC større enn 40 millioner per milliliter ved hjelp av tetthet sentrifugering muliggjør en høy celle utvinning.

Analyse av prøven ved flytcytometri etter gating på FSC og SSC avslører renheten av KLL-celler er mer enn 95%som indikert av det doble overflateuttrykket for KLL-cellemarkører, CD19 og CD5. Når immunslots ble utført på de resulterende fraksjonene av KLL-cellelinjen, Mac-1 og primære KLL-celler, indikerte fraksjonering at det optimale vaskemiddelnivået for Mac-1-celler var på en til 60 fortynning, sammenlignet med en til 30 for primære KLL-celler. Når subcellulær lokalisering av FOXO1 i kjernefysiske og cytoplasmatiske fraksjoner ble bestemt i Mac-1 og primære KLL-celler, ble generering av høyt berikede fraksjoner vist av det nesten eksklusive uttrykket av lamin i kjernefysisk og beta Tubulin i cytoplasmatiske fraksjoner.

FOXO1-uttrykket ble redusert i cytoplasma etter behandling med AZD 8055, sammenlignet med NDC, ledsaget av en økning av FOXO1-uttrykket i kjernerommet, og viste dermed proteintranslokasjon. Etter at individuelle immunslots fra fem primære KLL-prøver ble kvantifisert innenfor subcellulære fraksjoner, ble AZD 8055 funnet å redusere nivåene av FOXO1-uttrykk i cytoplasma og øke uttrykket i kjernen. BCR kryss-linking økt cytoplasmatisk FOXO1 uttrykk.

Husk å holde alle reagenser og prøver på is for å forhindre proteinnedbrytning. De subcellulære fraksjonene som genereres i denne prosedyren, kan også brukes i enzymaktivitetsanalyser som en FOXO-aktivitetsanalyse, som gjør det mulig å trekke paralleller mellom den cellulære plasseringen av FOXO1 og dnabindingsaktiviteten. Utviklingen av denne teknikken har gjort oss i stand til å håndtere smugling av spesifikke proteiner i KLL-celler som svar på selektive hemmere og støtter våre parallelle immunfluorescence-studier for å generere et robust og kvantifiserbart datasett.