Subcellulär fraktionering av primära kroniska Lymfocytiska leukemiceller för att övervaka nukleär/Cytoplasmatisk protein handel

Utveckla tekniker för att undersöka transport av makromolekyler mellan kärnan och cytoplasman, och identifiera fellokalisering av tumör suppressor proteiner är viktigt att få en djupare förståelse av KLL patogenes och stöd i utvecklingen av nya terapier. Detta protokoll ger en snabb och effektiv metod för att generera nukleära och cytoplasmatiska fraktioner från primära KLL-celler. Dessa fraktioner kan användas i nedströms experiment inklusive enzym aktivitetsanalyser, proteomisk analys, och västra blotting.

Denna teknik kommer att bredda vår förståelse för hur terapier och mikro-miljömässiga signaler inom tumörer ändra shuttling av proteiner mellan kärnan och cytoplasman i KLL celler och potentiellt andra B-cell maligniteter. Denna metod kan användas för att bestämma placeringen av proteiner och/eller locka till sig proteinrörelse som tillämpligt. Utför en tvättmedelsgradient på varje enskild cellinje som du planerar att använda för att säkerställa den optimala genereringen av högberikade nukleära och cytoplasmatiska fraktioner.

Vid sidan av Jodie Hay och Michael Moles, visar detta förfarande kommer att Jennifer Cassels, en tekniker från mitt laboratorium. Få perifert blodprov från tidigare samtyckt kronisk lymfatisk leukemi patienter i EDTA blod insamling rör, åtföljs av den vita cellen räkna. Blodprover från människor bör betraktas som farliga eftersom de potentiellt innehåller blodburna virus.

Var god att se till att dessa prover hanteras i ett klass två-biosäkerhetsskåp och att användaren hela tiden bär labbrock och handskar. Kassera blodförorenade material i desinfektionsmedel. Om antalet vita celler är lika stort eller större än 40 miljoner celler per milliliter, späd provet med ett förhållande till ett med RT CLL-tvättbuffert.

Sedan alikvot RT densitet gradient medium i en lämpligt storlek koniska centrifugröret för provet. Försiktigt skikt provet ovanpå mediet och centrifug vid 400 x g i 30 minuter vid RT. Med hjälp av en pasteurpipett av plast, skörda försiktigt det vita lagret av mononukleära celler som samlats vid gränssnittet för densitetsgradientmediet i CLL-tvättbuffert. Överför detta isolerade monolayer till ett färskt 50-milliliter koniskt centrifugrör.

För att tvätta cellerna, tillsätt 40 milliliter KLL tvättbuffert till denna monolayer och centrifug vid 300 x g i 10 minuter vid rumstemperatur. Kasta supernatanten, snärta på rörets botten för att åter upphäva pelleten och upprepa denna tvätt. Kassera supernatanten, snärta till botten av röret igen och dra sedan upp cellpelleten på nytt i en inställd volym av KLL-tvättbuffert beroende på pelletens storlek.

Efter att ha räknat cellerna och efter flödescytometri för att kontrollera cellens renhet, placera cellerna i vävnadskulturplattor vid den celltäthet som krävs redo för stimulering eller läkemedelsbehandling. Efter stimulering och/eller läkemedelsbehandling är inkuberingen fullständig. Överför cellerna till individuellt märkta 1,5-milliliter mikrofuktrör och pellet genom centrifugering vid 200 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius.

Efter att du kastat supernatanten, återuppstäng cellpelletsen i en milliliter av iskall PBS med fosfatashämmare. Centrifugera vid 200 x g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten och förvara hela dessa cellextraktpellets på is för ytterligare beredningar.

För att förbereda cytoplasmatiska fraktioner, försiktigt åter upphäva cellen pellets i 50 mikroliter av 1x hypertonic buffert. För att låta cellerna svälla, inkubera dem på is i 15 minuter. Efter en utför en tvättmedel gradient för att bestämma den optimala koncentrationen av tvättmedel att använda för en specifik celltyp, tillsätt 0,8 till 2,5 mikroliter tvättmedel i varje prov och virvel på den högsta inställningen i 10 sekunder.

För att verifiera celllys, observera cellerna under ett faskontrastmikroskop före och efter tillsats av rengöringsmedel. Alla celler har en tät, mörk kärna omgiven av cytoplasman som visas som en ljus gloria. När lyst, centrifug proverna på 14, 000 x g i 30 sekunder vid fyra grader Celsius.

Försiktigt, utan att störa pelleten, överföra supernatanten till ett förkylt märkt mikrofugeringsrör och förvara denna cytoplasmatiska fraktion i 80 grader Celsius tills vidare analys. Se till att den cytoplasmatiska fraktionen fullständigt avlägsnas för att förhindra kontaminering av kärnfraktionen. Till den återstående pelleten, som innehåller den nukleära fraktionen, tillsätt 50 mikroliter av komplett lysbuffert och åter avbryta genom pipettering upp och ner.

För att solubilisera proteiner i samband med det nukleära membranet, tillsätt 2,5 mikroliter tvättmedel, virvel på den högsta inställningen i 10 sekunder, och inkubera på is i 30 minuter. Vortex på den högsta inställningen i 30 sekunder och centrifug. Överför sedan supernatanten till ett förkyldt märkt mikrofugeringsrör och förvara denna kärnfraktion vid 80 grader Celsius tills vidare analys.

För helcells-lysates, åter upphäva hela cellen extrakt pellets i 100 mikroliter av komplett lysbuffert genom pipettering upp och ner. För att säkerställa fullständig celllys, tillsätt fem mikroliter av tvättmedel och inkubera på is i 30 minuter. Vortex på den högsta inställningen i 30 sekunder och sedan centrifug vid 14, 000 x g i 20 minuter vid fyra grader Celsius.

Överför supernatanten till ett förkyld mikrofugeringsrör och förvara hela cellen vid 80 grader Celsius tills vidare analys. För att kvantifiera proteinhandel mellan nukleära och cytoplasmatiska fraktioner, utföra kvantitativa västerländska blot analys och importera bilderna. För att visa bilden i bild-menyfliksområdet klickar du på knappen Välj i gruppen Display och klickar på Chemi Channel.

Dialogrutan Välj visning öppnas för att möjliggöra ytterligare justeringar om det behövs. Implementera ytterligare förbättringar med hjälp av de justerbara skjutreglagen på bild LUT:s flik inklusive ljusstyrka eller kontrast. Använd fliken Kurvor för finare justeringar.

För dataanalys klickar du först på menyfliksområdet Analys. Om du bara vill analysera en kanal avmarkerar du de kanaler som inte analyseras genom att klicka på en kanals Don't Show Channel-miniatyrbild, och lämnar bara önskad kanal visad. Om du vill kvantifiera signalintensiteten klickar du på Lägg till rektangel för att lägga till rektanglar i bilden.

Klicka på mitten av en funktion som ett proteinband för att placera en rektangel runt den. När du har lagt till önskade former klickar du på Markera för att returnera markören till markeringsverktyget. Om du vill subtrahera bakgrundsbrus klickar du på den första knappen i gruppen Bakgrund och väljer Median på rullgardinsmenyn.

Ange kantbredden till tre i dialogen Bakgrund och välj de segment som bäst representerar den bildbakgrund som ska användas för bakgrundsberäkning. Om du vill exportera informationen klickar du på fliken Former ovanför tabellen. För densitometri krävs värden i kolumnen Signal.

Signal är summan av pixelintensitetsvärdena eller summan för en form minus produkten av bakgrunden i området. Klicka sedan på knappen Rapport, klicka på Spara som eller Starta kalkylblad. För att beräkna normaliserade uttryck av proteinet av intresse för varje plan eller variabel inom den sparade kalkylblad, dela den erhållna signalen för proteinet av intresse av signalen för motsvarande protein lastning kontrollband.

För att exportera bilden, klicka på fliken Bilder som finns ovanför tabellen och klicka sedan på bilden som ska exporteras. Om du använder bilden för en bildpresentation eller andra digitala format klickar du på programikonen, hovrar över Export, klickar på Bild för digitala medier och sparar sedan bilden enligt vad som krävs. Anrikning av KLL-celler med en WCC större än 40 miljoner per milliliter med hjälp av densitetscentrifugering möjliggör en hög cellåtervinning.

Analys av provet genom flödescytometri efter gating på FSC och SSC avslöjar renheten hos KLL-celler är mer än 95%vilket indikeras av den dubbla ytan uttryck för CLL cell markörer, CD19 och CD5. När immuno blots utfördes på de resulterande fraktionerna av CLL cellinje, Mac-1 och primära KLL celler, fractionation anges att den optimala tvättmedel nivå för Mac-1 celler var på en till 60 utspädning, jämfört med en till 30 för primära KLL celler. När subcellulära lokalisering av FOXO1 i nukleära och cytoplasmatiska fraktioner fastställdes i Mac-1 och primära CLL celler, fram generering av högberikade fraktioner visades av nästan exklusiva uttryck för lamin i den nukleära och beta Tubulin i cytoplasmatiska fraktioner.

FOXO1 uttryck minskades i cytoplasman efter behandling med AZD 8055, jämfört med NDC, åtföljs av en ökning av FOXO1 uttryck i kärnfacket, vilket visar protein flyttning. Efter enskilda immuno blots från fem primära CLL prover kvantifierades inom subcellulära fraktioner, AZD 8055 konstaterades för att minska nivåerna av FOXO1 uttryck i cytoplasman och öka uttrycket i kärnan. BCR tvärbindning ökad cytoplasmatisk FOXO1 uttryck.

Kom ihåg att hålla alla reagenser och prover på is för att förhindra att proteinnedbrytning. De subcellulära fraktioner som genereras i detta förfarande kan också användas i enzymaktivitetsanalyser såsom en FOXO-aktivitetsanalys, vilket gör det möjligt att dra paralleller mellan den cellulära platsen för FOXO1 och dess DNA-bindningsaktivitet. Utvecklingen av denna teknik har gjort det möjligt för oss att ta itu med handeln med specifika proteiner inom CLL-celler som svar på selektiva hämmare och stöder våra parallella immunofluorescensstudier för att generera en robust och kvantifierbar datauppsättning.