Name: mapping alzheimer's disease variants to their target genes using computational analysis of chromatin configuration
Uploaded: 2020-01-09T13:00:00
Duration: 4 min 41 s
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この研究は、NIH助成金R00MH113823(H.W.へ)とR35GM128645(D.H.P.へ)、NARSAD若手研究者賞(H.W.へ)、サイモンズ財団自閉症研究イニシアチブ(SFARI、N.M.およびH.W.へ)からのSPARK助成金によって支援されました。

1. ワークステーションのセットアップ
<ol><li>R (バージョン 3.5.0) と RStudio デスクトップをインストールします。RStudio を開きます。</li>
	<li>RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、R に次のライブラリをインストールします。 if (!BiocManager" %in% 行名(インストール済み.パッケージ())) install.packages("BiocManager", リポジトリ="https://cran.r-project.org") バイオクマネージャー::インストール(「ゲノム範囲」) バイオクマネージャー::インストール(「バイオマート」) バイオクマネージャー::インストール(「WGCNA」) install.packages("形状変更") インストール.パッケージ("ggplot2") インストール.パッケージ("corrplot") インストール.パッケージ("gProfileR") install.packages("きちんとしたバース") install.packages("ggpubr")</li>
	<li>ファイルをダウンロードします。 注: このプロトコルでは、すべてのファイルを ~/work ディレクトリにダウンロードする必要があります。<ol>
<li>資料の表に記載されているリンクをクリックして、次のファイルをダウンロードします。<ol>
<li>AD 用の細かくマッピングされた信頼できる SP をダウンロードします (補足表 8 から Jansen et al.14)。 注 : 分析の前に、41588_2018_311_MOESM3_ESM.xlsx でシート 8 を開き、最初の 3 行を削除し、シートをタブ区切り形式でSupplementary_Table_8_Jansen.txt として保存します。</li>
			<li>サイチェンコードから成人脳内の10 kb解像度Hi-C相互作用プロファイルをダウンロードします(以下のプロモーター-anchored_chromatin_loops.bedと説明します)。 注: このファイルの形式は、染色体、TSS_start、TSS_end、Enhancer_start、およびEnhancer_endです。他の Hi-C データセットを使用する場合、このプロトコルでは高解像度(5~20 kb)で処理される Hi-C データセットが必要です。</li>
			<li>PsychENCODE から単一セル式データセットをダウンロードします。 メモ:これらは神経型対照サンプルからのものです。</li>
			<li>BrainSpan から発達表現データセットをダウンロードします (以下のdevExpr.rdaと説明します)。 注: 267666527 は zip ファイルであるため、267666527 を解凍して "columns_metadata.csv"、"expression_matrix.csv"、および "rows_metadata.csv" を抽出して devExpr.rda を生成します (セクション 3 を参照)。</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gencode バージョン 19 からエキサニック座標(Gencode19_exon.bedおよびGencode19_promoter.bedとして説明) のエキサニック座標をダウンロードします。 注: プロモーターは、転写開始サイト (TSS) の上流に 2 kb として定義されます。これらのファイルの形式は、染色体、開始、終了、および遺伝子です。</li>
		<li>バイオマートから遺伝子注釈ファイル(下記geneAnno.rdaとして説明する補足ファイルを参照)をダウンロードしてください。 注:このファイルは、Ensembl遺伝子IDとHUGO遺伝子命名法委員会(HGNC)シンボルに基づいて遺伝子を一致させるために使用することができます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 信頼できる SP の G範囲オブジェクトの生成
<ol><li>RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、R で設定します。 図書館(ゲノム範囲) オプション(文字列AsFactors = F) setwd("~/work") # これは作業ディレクトリへのパスです。 credSNP = read.delim("Supplementary_Table_8_Jansen.txt", ヘッダー = T) credSNP = credSNP[credSNP$信頼できる.コーサル=="はい",]</li>
	<li>RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、GRanges オブジェクトを作成します。 クレドランジ = GRanges (credSNP$Chr, IRanges (credSNP$bp, credSNP$bp), rsid=credSNP$SNP, P=credSNP$P) 保存(クレドレンジ、ファイル="AD_credibleSNP.rda")</li>
</ol>3. 位置マッピング
注: 各手順で、RStudio のコンソール ウィンドウに対応するコードを入力します。
<ol><li>R で設定します。 オプション(文字列AsFactors=F) 図書館(ゲノム範囲) load("AD_credibleSNP.rda") # (2を参照)</li>
	<li>プロモーター/エキソニックSNの遺伝子への位置マッピング<ol>
<li>プロモーターとエキゴニック領域をロードし、GRange オブジェクトを生成します。 exon = read.table("Gencode19_exon.bed") エキソン範囲 = GRanges(エキソン[,1],IRanges(エキソン[,2],エキソン[,3]),遺伝子=エキソン[,4]) プロモーター = 読み取り.テーブル("Gencode19_promoter.ベッド") プロモーター範囲 = GRanges(プロモーター[1], IRanges(プロモーター[,2], プロモーター[,3]), 遺伝子=プロモーター[,4])</li>
		<li>信頼できる SP とエキサニック領域を重複させます。 olap = 検索オーバーラップ(クレドレンジ、エクソンレンジ) クレデキソン = クレドレンジ[クエリヒット(olap)] mcols(クレデクソン) = cbind(mcols(クレデキソン),mcols(エキソンレンジス[被験者ヒット(olap)]))</li>
		<li>信頼できる SP とプロモーター領域を重複させます。 olap = 検索オーバーラップ(クレドレンジ、プロモーターレンジ) クレドプロモーター = クレドレンジ[クエリヒット(olap)] mcols(クレドプロモーター) = cbind(mcols(クレドプロモーター)、mcols(プロモーターランジュ[サブジェクトヒット(olap)]))</li>
	</ol>
</li>
	<li>クロマチン相互作用を用いてSPをその段階標的遺伝子にリンクする。<ol>
<li>Hi-C データセットを読み込み、GRange オブジェクトを生成します。 hic = read.table("プロモーター-anchored_chromatin_loops.ベッド", スキップ = 1) コル名(hic) = c("chr","TSS_start","TSS_end", "Enhancer_start", "Enhancer_end") ヒクロスジ = GRanges(hic$chr,IRanges(TSS_start、TSS_end)、エンハンサー=ハイク$Enhancer_start) olap = 検索オーバーラップ(ヒスクション、プロモーター範囲) ヒカピュア = ヒクション[クエリヒット(olap)] mcols(ヒクプロモーター) = cbind(mcols(ヒップロモーター)、mcols(プロモーター範囲[サブジェクトヒット(olap)])) ヒカエンサー = GRanges(セクネーム(ヒップロモーター)、IRanges(ヒップロモーター$エンハンサー、ヒップロモーター$エンハンサー+10000)、遺伝子=ヒップロモーター$遺伝子)</li>
		<li>信頼できる SP を Hi-C GRange オブジェクトと重なっています。 olap = 重複する(クレドランジ、ヒカエンブラー) クレドシック = クレドレンジ[クエリヒット(olap)] mcols(クレディック) = cbind(mcols(クレディック), mcols(ヒカエンブラー[サブジェクトヒット(olap)]))</li>
	</ol>
</li>
	<li>位置マッピングおよびクロマチン相互作用プロファイルによって定義されるAD候補遺伝子をコンパイルする。 ### AD の結果として得られる候補遺伝子: ADgenes = Reduce(ユニオン、リスト(クレデキソン$遺伝子、クレデキソン$遺伝子、クレドプロモーター$遺伝子)) ### を変換すると、Ensembl ジーン ID が HGNC シンボルに変換されます。 負荷(「geneAnno.rda」) ADhgnc = geneAnno1[一致(ADgenes, geneAnno1$ensembl_gene_id), "hgnc_symbol"] ADhgnc = ADhgnc[ADhgnc!="" 保存(ADgenes, ADhgnc, ファイル="ADgenes.rda") write.table(ADhgnc, ファイル="ADgenes.txt", 行名 =F, col.names=F, 見積もり =F, sep="\t")</li>
</ol>4. 発達表現軌道
注: 各手順で、RStudio のコンソール ウィンドウに対応するコードを入力します。
<ol><li>R で設定します。 ライブラリ(形状変更);図書館(ggplot2);図書館(ゲノム範囲);図書館(バイオマート) 図書館("WGCNA") オプション(文字列AsFactors=F)</li>
	<li>プロセス式とメタ データ。 datExpr = 読み取り.csv("expression_matrix.csv"、ヘッダー = FALSE) datExpr = datExpr[,-1] datMeta = read.csv("columns_metadata.csv") datProbes = read.csv("rows_metadata.csv") datExpr = datExpr[datProbes$ensembl_gene_id!="",] datProbes = datProbes[datProbes$ensembl_gene_id!="",] datExpr.cr= 折りたたみ行(datExpr、行グループ = datProbes$ensembl_gene_id、行 ID= 行名(datExpr)) datExpr = datExpr.cr$datET 折りたたみ gename = データフレーム(datExpr.cr$group2row) 行名(datExpr) = ゲナメ$グループ<ol>
<li>開発段階を指定します。 datMeta$ユニット = "出生後" idx = grep("pcw", datMeta$age) datMeta$ユニット[idx] = "出生前" idx = grep("yrs", datMeta$age) datMeta$ユニット[idx] = "出生後" datMeta$ユニット = 係数(ダットメタ$ユニット、レベル=c("出生前"、"出生後"))</li>
		<li>皮質領域を選択します。 datMeta$Region = "サブCTX" r = c("A1C"、"STC"、"ITC"、"TCx"、"OFC"、"DFC"、"VFC"、"MFC"、"M1C"、"S1C"、"IPC"、"M1C-S1C"、"PCx"、"V1C"、"Ocx") datMeta$Region[datMeta$structure_acronym %in% r] = "CTX" datExpr = datExpr[, datMeta = datMeta[ 保存(ダットエクスププル、ダットメタ、ファイル="devExpr.rda")</li>
	</ol>
</li>
	<li>ADリスク遺伝子の発達発現プロファイルを抽出する。 負荷(「アドゲネス.rda」) exprdat = 適用(datExpr[一致(ADgenes,行名(datExpr)),],2,平均,na.rm=T) dat = data.frame(領域 = datMeta$領域、単位=datMeta$ユニット、Expr=exprdat)</li>
	<li>ADリスク遺伝子の出生前および出生後発現レベルを比較する。 pdf(ファイル="developmental_expression.pdf") ggplot(dat,aes(x=単位,y=Expr,fill=Unit,α=単位)) + ylab("正規化式") + geom_boxplot(外れ値.サイズ = NA) + ggtitle("脳表現") + scale_alpha_manual(値=c(0.2, 1)) + theme_classic() + テーマ(伝説) dev.off()</li>
</ol>5. セル型式プロファイル
注: 各手順で、RStudio のコンソール ウィンドウに対応するコードを入力します。
<ol><li>R で設定します。 オプション(文字列AsFactors=F) 負荷(「アドゲネス.rda」) 負荷(「geneAnno.rda」) ターゲット名 = "AD" ターゲット遺伝子 = ADhgnc cellexp = read.table("DER-20_Single_cell_expression_processed_TPM_backup.tsv",ヘッダ=T,塗りつぶし=T) cellexp[1121,1] = cellexp[1120,1] cellexp = cellexp[-1120,] 行名(セルエクスプ) = セルエクスプ[,1] cellexp = cellexp[,1] datExpr = スケール(セルエクスプ、センター=T、スケール=F) datExpr = datExpr[,789:ncol(datExpr)]</li>
	<li>ADリスク遺伝子の細胞発現プロファイルを抽出する。 exprdat = 適用(datExpr[一致(ターゲットジーン、行名(datExpr)))、]、2、平均、na.rm=T) dat = data.frame(グループ=ターゲット名、セル=名前(exprdat)、Expr=exprdat) dat$celltype = リストなし(lapply(strsplit(dat$cell, split="[.]"),'[[',1)) dat = dat[-grep("Ex|In",dat$celltype),] dat$celltype = gsub("Dev","胎児",dat$celltype) dat$celltype = 因子(dat$celltype, レベル=c("ニューロン","アストロサイト","ミクログリア","内皮", オリゴデンドロサイト","OPC","胎児")) pdf(ファイル="singlecell_expression_ADgenes.pdf") ggplot(dat,aes(x=セルタイプ, y=Expr, 塗りつぶし=セルタイプ)) + ylab("正規化式") + xlab(") + geom_violin() + テーマ(軸.テキスト.x=element_text(角度 = 90, hjust=1)) + テーマ(凡例.位置="なし") + ggtitle(ペースト0(「ADリスク遺伝子の細胞発現プロファイル」)) dev.off()</li>
</ol>6. ADリスク遺伝子の遺伝子アノテーション濃縮解析
<ol><li>ターミナルに以下のコマンドを入力して HOMER をダウンロードして設定します。 mkdir ホーマー cd ホーマー wget http://homer.ucsd.edu/homer/configureHomer.pl perl ./configureHomer.pl -install perl ./configureHomer.pl -人間をインストールします。 perl ./configureHomer.pl -人間をインストールします。</li>
	<li>ターミナルに以下のコマンドを入力してHOMERを実行します。 エクスポート PATH=$PATH:~/仕事/ホーマー/ビン findMotifs.pl ~/仕事/ADgenes.txt ヒト ~/仕事/</li>
	<li>RStudio のコンソール ウィンドウに次のコードを入力して、強化された用語をプロットします。 図書館(ggpubr) オプション(文字列AsFactors=F) pdf("GO_enrichment.pdf",幅 = 15,高さ=8) plot_barplot = 関数(dbname,name,color){ 入力 = 読み取り.delim(貼り付け0(dbname,.txt")、ヘッダー =T) 入力 = 入力[,c(-1,-10,-11)] 入力 = 一意(入力) 入力$FDR = p.調整(入力$ログP)) input_sig = 入力[入力$FDR < 0.1,] input_sig$FDR = -log10(input_sig$FDR) input_sig = input_sig[オーダー(input_sig$FDR),] p = input_sig、x = "用語"、y = "FDR"、塗りつぶし = 色、色 = "白"、 sort.val = "asc", ylab = expression(-log[10](FDR))), xlab = paste0(名前,用語"), 回転 = = TRUE, ラベル = input_sigターゲット.Genes.in.Term,/",input_sig$Genes.in.Term), font.label = list(色 = 白", サイズ = 9) p = p+geom_hline(yintercept = -log10(0.05)、線種 = 2、色 = "ライトグレー") リターン(p) } p1 = plot_barplot(「biological_process」「生物学的プロセスに従#00AFBB)。 p2 = plot_barplot("kegg","KEGG","#E7B800") p3 = plot_barplot("反応","反応#FC4E07") ggarrange(p1, p2, p3, ラベル = c("A", "B", "C"), ncol = 2, nrow = 2) dev.off()</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dekker, J., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Range+Chromatin+Interactions.">Long-Range Chromatin Interactions.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (10), a019356 (2015).</li><li>Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-range+interaction+landscape+of+gene+promoters.">The long-range interaction landscape of gene promoters.</a> Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).</li><li>Plank, J. L., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+function:+mechanistic+and+genome-wide+insights+come+together.">Enhancer function: mechanistic and genome-wide insights come together.</a> Molecular Cell. 55 (1), 5-14 (2014).</li><li>Dekker, J., Marti-Renom, M. A., Mirny, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+three-dimensional+organization+of+genomes:+interpreting+chromatin+interaction+data.">Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data.</a> Nature Reviews Genetics. 14 (6), 390-403 (2013).</li><li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+Hi-C+reveals+novel+candidate+genes+and+complex+long-range+interactions+with+related+autoimmune+risk+loci.">Capture Hi-C reveals novel candidate genes and complex long-range interactions with related autoimmune risk loci.</a> Nature Communications. 6, 10069 (2015).</li><li>Won, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+conformation+elucidates+regulatory+relationships+in+developing+human+brain.">Chromosome conformation elucidates regulatory relationships in developing human brain.</a> Nature. 538 (7626), 523-527 (2016).</li><li>J&#228;ger, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+Hi-C+identifies+the+chromatin+interactome+of+colorectal+cancer+risk+loci.">Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci.</a> Nature Communications. 6, 6178 (2015).</li><li>Chen, J. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Joint+genome-wide+association+study+of+progressive+supranuclear+palsy+identifies+novel+susceptibility+loci+and+genetic+correlation+to+neurodegenerative+diseases.">Joint genome-wide association study of progressive supranuclear palsy identifies novel susceptibility loci and genetic correlation to neurodegenerative diseases.</a> Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 41 (2018).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+functional+genomic+resource+and+integrative+model+for+the+adult+brain.">Comprehensive functional genomic resource and integrative model for the adult brain.</a> Science. 362 (6420), eaat8464 (2018).</li><li>Demontis, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+first+genome-wide+significant+risk+loci+for+attention+deficit/hyperactivity+disorder.">Discovery of the first genome-wide significant risk loci for attention deficit/hyperactivity disorder.</a> Nature Genetics. 51 (1), 63-75 (2019).</li><li>Grove, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+common+genetic+risk+variants+for+autism+spectrum+disorder.">Identification of common genetic risk variants for autism spectrum disorder.</a> Nature Genetics. 51 (3), 431-444 (2019).</li><li>Lee, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+meta-analysis+identifies+genomic+relationships,+novel+loci,+and+pleiotropic+mechanisms+across+eight+psychiatric+disorders.">Genome wide meta-analysis identifies genomic relationships, novel loci, and pleiotropic mechanisms across eight psychiatric disorders.</a> bioRxiv. , 528117 (2019).</li><li>Mah, W., Won, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+three-dimensional+landscape+of+the+genome+in+human+brain+tissue+unveils+regulatory+mechanisms+leading+to+schizophrenia+risk.">The three-dimensional landscape of the genome in human brain tissue unveils regulatory mechanisms leading to schizophrenia risk.</a> Schizophrenia Research. , (2019).</li><li>Jansen, I. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+meta-analysis+identifies+new+loci+and+functional+pathways+influencing+Alzheimer's+disease+risk.">Genome-wide meta-analysis identifies new loci and functional pathways influencing Alzheimer's disease risk.</a> Nature Genetics. 51 (3), 404-413 (2019).</li><li>Viola, K. L., Klein, W. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+quantitative+enhancer+activity+maps+identified+by+STARR-seq.">Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq.</a> Science. 339 (6123), 1074-1077 (2013).</li><li>Kent, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+genome+browser+at+UCSC.">The human genome browser at UCSC.</a> Genome Research. 12 (6), 996-1006 (2002).</li><li>Kang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+transcriptome+of+the+human+brain.">Spatio-temporal transcriptome of the human brain.</a> Nature. 478 (7370), 483-489 (2011).</li></ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

ここでは、位置マッピングとクロマチン相互作用に基づいてGWS遺伝子座に機能的に注釈を付けるために使用できる分析フレームワークについて説明します。このプロセスには複数の手順が含まれます (詳細については、このレビュー13を参照してください)。まず、クロマチン相互作用プロファイルが高度に細胞特異的であることを考えると、疾患の基礎となる生物学を最もよく捕捉する適切な細胞/組織型から得られたHi-Cデータを使用する必要がある。ADが神経変性疾患であることを考えると、成人脳Hi-Cデータ9を使用してGWS遺伝子座に注釈を付けた。第二に、 各GWS軌跡は、多くの場合、結合不衡(LD)のために形質に関連する数百のSNを持っているので、因果関係を計算的に予測することによって、形質的因果関係(「信頼できる」)SNを得ることが重要です ファインマッピングアルゴリズム21、22、または超並列レポーターアッセイ(MPRA)23または自己転写アクティブな規制領域シーケンシング()などのハイスループットアプローチを使用して、規制活動を実験的にテストすることによるSTARR-seq)24.ここで説明した作業では、Jansen et al.14で報告された信頼できる SP を使用しました。第3に、プロモーターおよびエキサニックSNPsは、位置マッピングに基づいてアテンショナル・マッピングに基づいてアテンションされる。我々は、SNがプロモーター(転写開始部位の2kb上流として定義される)またはエキソンと重なったときに遺伝子にマッピングされる単純な位置マッピング戦略を使用した。ただし、このアプローチは、SNP がナンセンス仲介減衰、誤った意味の変動、またはナンセンス変動を誘発するかどうかなど、エキソニック SNP の機能的な結果を評価することによってさらに詳しく説明できます。第4に、適切な組織/細胞型からのクロマチン相互作用プロファイルを使用して、物理的近接性に基づいてSPをその位置付け標的遺伝子に割り当てることができます。プロモーターに固定された相互作用プロファイルを使用しましたが、エンハンサー活性(ヒストンH3 K27アセチル化またはクロマチンアクセシビリティによって導かれる)またはエキソン相互作用を考慮に入れて、相互作用プロファイルをさらに改良または拡張することができます。このプロセスにおける重要な考慮事項の1つは、一貫したヒトゲノム構築を使用することです。例えば、要約統計量のゲノム位置がhg19(すなわちhg18またはhg38)に基しくない場合、参照ゲノムの適切なバージョンを取得するか、リフトオーバー25を使用して要約統計量をhg19に変換する必要がある。
このフレームワークを適用してAD GWASの可分標的遺伝子を同定し、284個のSNを112個のADリスク遺伝子に割り当てた。発達発現プロファイル26および細胞型特異的発現プロファイル9を用いて、この遺伝子セットがAD病理について知られているものと一致し、細胞型(ミクログリア)、生物学的機能(免疫応答およびアミロイドベータ)、および年齢時のリスクの上昇を明らかにした。
ADとその基礎となる生物学の潜在的な標的遺伝子を描くフレームワークを提示しましたが、Hi-Cベースのアノテーションを拡張して非コーディングのバリエーションに注釈を付けることができることに注意してください。より多くの全ゲノムシーケンシングデータが利用可能になり、非コーディング希少変動に関する理解が高まるにつれて、Hi-Cは疾患関連遺伝的変異体の解釈に重要なリソースを提供します。したがって、複数の組織および細胞型から得られたHi-Cリソースのコンペンディウムは、様々なヒトの形質や疾患に生物学的洞察を得るために、このフレームワークの広範な適用を促進するために重要である。

ゲノム全体の関連研究(GWAS)は、人間の形質や疾患の範囲の遺伝的基礎を明らかにする上で極めて重要な役割を果たしてきました。この大規模なジェノタイピングは、高さから統合失調症のリスクに至るまで、表現型に関連する何千ものゲノム変異体を発見しました。しかし、GWASが疾患および形質関連遺伝子座を同定することに大きな成功を収めたにもかかわらず、これらの変異体が表現型にどのように寄与するかについての機械的理解は、ほとんどの表現型関連変異体が非コーディングに存在するため、困難であった。ヒトゲノムの一部。これらの変異体は予測される調節要素と重なり合うことが多いため、近くの遺伝子の転写制御を変化させる可能性が高い。しかし、非コードロチは、1メガベースを超える直線距離での遺伝子の転写に影響を与え、各変異体の影響を受ける遺伝子を同定することが困難になります。三次元(3D)クロマチン構造は、遠くの調節遺伝子遺伝子遺伝子基数との間の接続を媒次的に媒役とし、フェノタイプ関連の一塩基多型(SN)の影響を受ける遺伝子を同定するために使用することができる。
遺伝子調節は、転写機構が1、2、3に向けることができる遺伝子プロモーターにエンハンサーを物理的に接続するエンハンサー活性化およびクロマチンループ形成を含む複雑なプロセスによって媒介される。クロマチンループは数百キロベース(kb)に及ぶことが多いため、遺伝子調節機構を解読するには3Dクロマチンアーキテクチャの詳細な地図が必要です。複数のクロマチン立体構造捕捉技術が発明され、3Dクロマチンアーキテクチャ4を同定した。これらの技術の中で、Hi-Cはゲノム全体の3Dクロマチン相互作用プロファイルをキャプチャするので、最も包括的なアーキテクチャを提供します。Hi-Cデータセットは、クロマチン相互作用プロファイルに基づいて非コード化変異体をその可因標的遺伝子にリンクできるため、非コードゲノムワイド有意(GWS)loci5、6、7、8、9、10、11、12、13を解釈するように迅速に適応されています。
この記事では、クロマチン相互作用プロファイルを用いてGWASリスク変異体の可計算的標的遺伝子を計算的に予測するプロトコルの概要を説明する。このプロトコルを適用して、成人脳9のHi-Cデータセットを用いてAD GWS loci14を標的遺伝子にマッピングします。得られたADリスク遺伝子は、単一細胞転写および発達発現プロファイルを含む他の機能ゲノムデータセットによって特徴付けられます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 kb resolution Hi-C interaction profiles in the adult brain from psychencode</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a target="_blank" href="http://adult.psychencode.org/Datasets/Integrative/Promoter-anchored_chromatin_loops.bed">http://adult.psychencode.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Developmental expression datasets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a target="_blank" href="http://www.brainspan.org/api/v2/well_known_file_download/267666527">http://www.brainspan.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-mapped credible SNPs for AD (Supplementary Table 8 from Jansen et al.14)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a target="_blank" href="https://static-content.springer.com/esm/art%3A10.1038%2Fs41588-018-0311-9/MediaObjects/41588_2018_311_MOESM3_ESM.xlsx">https://static-content.springer.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOMER</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a target="_blank" href="http://homer.ucsd.edu/homer/configureHomer.pl">http://homer.ucsd.edu/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R (version 3.5.0)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RStudio Desktop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a target="_blank" href="https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/">https://www.rstudio.com/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single cell expression datasets</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td><a target="_blank" href="http://adult.psychencode.org/Datasets/Derived/SC_Decomp/DER-20_Single_cell_expression_processed_TPM_backup.tsv">http://adult.psychencode.org/</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mapping alzheimer's disease variants to their target genes using computational analysis of chromatin configuration

ゲノム全体の関連研究(GWAS)は、ヒトの形質や疾患に関連する何百ものゲノム遺伝子座を同定しました。しかしながら、ゲノムワイド有意(GWS)遺伝子座の大部分は非コードゲノム上に落ちるので、多くの機能的影響は未知のままである。Hi-Cまたはその誘導体によって同定される3次元クロマチン相互作用は、非コード変異体をそれらの作用可能な遺伝子に連結することによってこれらの遺伝子座に注釈を付ける有用なツールを提供することができる。ここでは、アルツハイマー病(AD)GWASおよびヒト成人脳組織からのHi-Cデータセットを用いて、GWAS非コード変異体をその遺伝子にマッピングするプロトコルの概要を説明する。位置因果単一ヌクレオチド多型(SP)は、微細マッピングアルゴリズムの適用によって同定される。次に、Hi-Cに基づくエンハンサー・プロモーター相互作用を用いて、SPをその可組み標的遺伝子にマッピングします。得られた遺伝子セットはADリスク遺伝子を表し、ADリスク変異体によって調節される可能性がある。ADの基礎となる分子機構に関する生物学的洞察をさらに得るために、発達脳発現データと脳単細胞発現プロファイルを用いてADリスク遺伝子を特徴付ける。このプロトコルは、任意のGWASおよびHi-Cデータセットに拡張して、様々なヒトの形質や疾患の根底にある可愛い標的遺伝子や分子機構を特定することができます。

ここで説明するプロセスは、元の研究14によって定義された 800 の信頼できる SP のセットに適用されました。位置マッピングにより、103個のSNPがプロモーター(43個のユニーク遺伝子)と重なり合い、42個のSNがエキソン(27個のユニークな遺伝子)と重なっていることが明らかになりました。位置マッピングの後、84% (669) SN は無調のままであった。成人脳のHi-Cデータセットを用いて、物理的な近接性に基づいて追加の208個のSNPを64個の遺伝子にリンクすることができました。合計で、284 AD の信頼できる SP を 112 個の AD リスク 遺伝子にマップしました (図 1A)。ADリスク遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質、アミロイドβ形成、および免疫応答と関連し、AD15、16、17、18の既知の生物学を反映した(図1B-D)。ADリスク遺伝子の発達発現プロファイルは、顕著な出生後濃縮を示し、ADの加齢に伴う上昇リスクを示す(図2A)。最後に、ADリスク遺伝子はミクログリア、脳内の原発性免疫細胞で高度に発現した(図2B)。これは、ADが強い免疫基盤を有し、ミクログリアがAD病因14、19、20の中心的なプレーヤーであるという再発所見と一致している。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60428/60428fig1b.jpg"> 図1:AD GWS遺伝子の可%)。(A)上位29 AD lociから得られた信頼できるSPは、プロモーターSNP、エキサニックSNPs、および無調の非コーディング性SPに分類され、プロモーターおよびエキサニックSNPsは位置マッピングによって標的遺伝子に直接割り当てられ、成人脳におけるクロマチン相互作用プロファイルは物理的相互作用に基づいてSNPをマッピングするために追加的に使用された。(B-D)ADリスク遺伝子におけるGO(B)、KEGG(C)および反応形(D)用語の濃縮は、プロトコルセクション6で説明されているようにHOMERを用いて行った。x 軸は、修正された誤検出率 (FDR) -log10 (P 値) を表します。FDR < 0.1 との充実した用語をプロットしました。灰色の垂直線は FDR = 0.05 を表します。APPアミロイド前駆体タンパク質。分子は、各項で表されるADリスク遺伝子の数;分母は、各項における遺伝子の数である。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60428/60428fig1alarge.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60428/60428fig2.jpg"> 図2:ADリスク遺伝子の特性評価(A)ADリスク遺伝子は出生前皮質と比較して出生後皮質において高度に発現される。(B)皮質とは異なる細胞型における遺伝子発現値(正規化発現)の分布を表すバイオリンプロット。これらの結果は、ADリスク遺伝子がミクログリアで高度に発現していることを示し、以前の研究14と一致する。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60428/60428fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル 1.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60428/Gencode19_exon.bed" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
補足ファイル 2.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60428/Gencode19_promoter.bed" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>
補足ファイル 3.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60428/geneAnno.rda" target="_blank">このファイルを表示するには、ここをクリックしてください (右クリックしてダウンロードしてください)。</a>

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Mapping Alzheimer's Disease Variants to Their Target Genes Using Computational Analysis of Chromatin Configuration

我々は、三次元クロマチン相互作用を用いてゲノム全体の関連研究(GWAS)によって同定される非コード変異体の機能的影響を同定するプロトコルを提示する。

クロマチン構成の計算解析を用いたアルツハイマー病変異体の標的遺伝子へのマッピング

Genome-wide association studies (GWAS) have successfully identified hundreds of genomic loci that are associated with human traits and disease. However, ...

GWASはヒトの形質や疾患に関連するゲノム領域の同定に成功したが、これらのリスク変異体の生物学的影響は不明である。ここでクロマチン相互作用プロファイルを用いたGWASリスク変異体の推定標的遺伝子を計算的に予測するプロトコルの概要を説明する。しばしばリスク遺伝子の同定は、疾患のメカニズムを理解し、通常の治療アプローチを可能にする第一歩である。この研究の結果が、最終的にはアルツハイマー病を診断し、治療するための最終的な戦略につながることを願っています。この技術の主な利点は、3Dクロモトン接触周波数を使用することで、アルツハイマー病のリスク分散の影響を受ける遺伝子を特定できることです。このプロトコルを試す際には、RまたはXペアシステムに精通していることが重要です。この計算プロトコルを実行するには、テキスト原稿または画面上のコードを参照してください。まず、Rに設定して、信頼できる単核間多型またはSNPS用のG範囲オブジェクトを生成する。位置マッピングの場合、Rで設定するとプロモーターとエキポニック領域がロードされ、G範囲オブジェクトが生成されます。信頼できるSNPSをエキソン領域およびプロモーター領域と重ね合う。クロマトン相互作用を使用してSNPSを推定対象遺伝子にリンクするには、Hi C データセットをロードして G 範囲オブジェクトを生成します。信頼できる SNPS を Hi C G 範囲オブジェクトとオーバーラップします。そして、位置マッピングおよびクロモトン相互作用プロファイルによって定義されるAD候補遺伝子をコンパイルする。次に、発達軌道を探ります。R でセットアップし、式のメタデータを処理します。発達段階を指定し、皮質領域を選択します。ADリスク遺伝子の発達発現プロファイルを抽出し、出生前と出生後の発現レベルを比較します。Rで設定し、ADリスクの細胞発現プロファイルを抽出することによって細胞型発現プロファイルを調査する。最後に、ADリスク遺伝子の遺伝子注釈濃縮解析を行う。ホーマーをダウンロードして設定します。その後、ホーマーを実行し、R Studioで豊富な用語をプロット.このプロセスを使用して、800の信頼できるSPのセットが調査されました。位置マッピングにより、103のSPがプロモーターと重なり、42のSPがExonsと重なっているのに対し、84%のSPは無名のままであった。成人の脳でHi-Cデータセットを使用して、さらに208のSPが物理的な近接性に基づいて64個の遺伝子にリンクされました。合計で、284のAD信頼できるSPが112のADリスク遺伝子にマッピングされました。ADリスク遺伝子は、アミロイド前駆体タンパク質、アミロイドベータ形成および免疫応答と関連しており、これは疾患の既知の生物学を反映している。ADリスク遺伝子の発達発現プロファイルは、疾患の年齢に関連する高いリスクを示す顕著な出生後濃縮を示した。最後に、遺伝子は、ADが強い免疫基盤を有するという再発知見を支える脳内の原発性免疫細胞をミクログリアで高発現した。ここでは、脳組織からのHi-Cデータを使用して、アルツハイマー病リスク分散の生物学的影響を分析します。しかし、この方法を別のGWAS研究に適用するには、関連する組織における新しいHi-Cデータのレベルが重要である。これらの結果は、より鮮明なベースの技術、エンハンサーレポーターアッセイ、またはEQTLなどの他の機能的ゲノムデータセットと交差することによって、さらに研究され、検証することができます。ここでは、アルツハイマー病リスク遺伝子の数十を識別し、これらの遺伝子の同定は、アルツハイマー病における彼らの未知の役割を理解するのに役立つと期待しています。

Research

JoVE Journal

Genetics

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

ビオチン化ソラレンを用いたRNA-RNA相互作用のマッピング

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Sequential Salt Extractions for the Analysis of Bulk Chromatin Binding Properties of Chromatin Modifying Complexes

クロマチン複合体を変更するのプロパティをバインド一括クロマチンの分析の逐次塩抽出

Elucidation of the binding properties of chromatin-targeting proteins can be very challenging due to the complex nature of chromatin and the heterogeneous ...

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Retroviral Scanning: Mapping MLV Integration Sites to Define Cell-specific Regulatory Regions

レトロウイルススキャン：細胞特異的調節領域を定義するためのMLV統合サイトのマッピング

Moloney murine leukemia (MLV) virus-based retroviral vectors integrate predominantly in acetylated enhancers and promoters. For this reason, mLV ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Using Sniper-Cas9 to Minimize Off-target Effects of CRISPR-Cas9 Without the Loss of On-target Activity Via Directed Evolution

進化を介してターゲットの活性を失うことがなく CRISPR Cas9 のオフターゲット効果を最小限に抑えるための狙撃兵 Cas9 を使用してください。

The development of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) into therapeutic modalities requires the ...

An In Vitro Protocol for Evaluating MicroRNA Levels, Functions, and Associated Target Genes in Tumor Cells

腫瘍細胞におけるマイクロRNAレベル、機能、および関連する標的遺伝子を評価するためのインビトロプロトコル

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory RNAs which are recognized to modulate numerous intracellular signaling pathways in several diseases including ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

ショウジョウバエを用した疾患関連希少ヒト変異体の生体内機能的研究

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...