Name: preparation of mitochondria from ovarian cancer tissues and control ovarian tissues for quantitative proteomics analysis
Uploaded: 2019-11-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door het Hunan Provincial Hundred talent plan (to X.Z.), de Xiangya Hospital funds for talent Introduction (to XZ), de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81572278 en 81272798 tot XZ), de subsidies uit China "863" plan Project (Grant No. 2014AA020610-1 tot en met XZ), en de Hunan Provincial Natural Science Foundation van China (Grant No. 14JJ7008 tot XZ). X.Z. bedacht het concept voor het huidige manuscript, verkreeg de itraq kwantitatieve proteomica gegevens van mitochondriën samples, schreef en reviseerde het manuscript, coördineerde het relevante werk en was verantwoordelijk voor de financiële steun en de bijbehorende Werk. H.L. bereide mitochondriën monsters. S.Q. deelgenomen aan gedeeltelijk werk. X. H. Z nam deel aan schriftelijke en bewerkte Engelse taal. N.L. analyseerden de itraq proteomica-gegevens. Alle auteurs keurden het eind manuscript goed.

Voor dit protocol werden eierstokweefsel monsters met inbegrip van eierstokkanker weefsels (n = 7) en normale controle ovariële weefsels (n = 11) gebruikt. Het huidige protocol3,4,5 is goedgekeurd door het xiangya ziekenhuis medisch ethisch comité van Central South University, China.
1. bereiding van mitochondriën van menselijke ovariële kanker weefsels
<ol><li>Bereid 250 mL van de mitochondrial...

<ol>
	<li>Sakhuja, S., Yun, H., Pisu, M., Akinyemiju, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Availability+of+healthcare+resources+and+epithelial+ovarian+cancer+stage+of+diagnosis+and+mortality+among+Blacks+and+Whites.">Availability of healthcare resources and epithelial ovarian cancer stage of diagnosis and mortality among Blacks and Whites.</a> Journal of Ovarian Research. 10, 57 (2017).</li><li>Gadducci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+procedures+for+patients+treated+for+epithelial+ovarian+cancer:+a+review+of+the+literature.">Surveillance procedures for patients treated for epithelial ovarian cancer: a review of the literature.</a> International Journal of Gynecological Cancer. 17, 21-31 (2007).</li><li>Li, N., Li, H., Cao, L., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+the+mitochondrial+proteome+in+human+ovarian+carcinomas.">Quantitative analysis of the mitochondrial proteome in human ovarian carcinomas.</a> Endocrine-Related Cancer. 25, 909-931 (2018).</li><li>Li, N., Zhan, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lncRNA+SNHG3+regulates+energy+metabolism+of+ovarian+cancer+by+an+analysis+of+mitochondrial+proteomes.">The lncRNA SNHG3 regulates energy metabolism of ovarian cancer by an analysis of mitochondrial proteomes.</a> Gynecologic Oncology. 150, 343-354 (2018).</li><li>Li, N., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathway+network+alterations+in+human+ovarian+cancers+identified+with+quantitative+mitochondrial+proteomics.">Signaling pathway network alterations in human ovarian cancers identified with quantitative mitochondrial proteomics.</a> EPMA Journal. 10, 153-172 (2019).</li><li>Deng, P., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+in+cancer:+Potential+roles+of+ATF5+and+the+mitochondrial+UPR.">Mitochondrial dysfunction in cancer: Potential roles of ATF5 and the mitochondrial UPR.</a> Semin Cancer Biology. 47, 43-49 (2017).</li><li>Georgieva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+dysfunction+and+redox+imbalance+as+a+diagnostic+marker+of+"free+radical+diseases".">Mitochondrial dysfunction and redox imbalance as a diagnostic marker of "free radical diseases".</a> Anticancer Research. 37, 5373-5381 (2017).</li><li>Sotgia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mitochondrial+based+oncology+platform+for+targeting+cancer+stem+cells+(CSCs):+MITO-ONC-RX.">A mitochondrial based oncology platform for targeting cancer stem cells (CSCs): MITO-ONC-RX.</a> Cell Cycle. 17, 2091-2100 (2018).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individualized+metabolic+profiling+stratifies+pancreatic+and+biliary+tract+cancer:+a+useful+tool+for+innovative+screening+programs+and+predictive+strategies+in+healthcare.">Individualized metabolic profiling stratifies pancreatic and biliary tract cancer: a useful tool for innovative screening programs and predictive strategies in healthcare.</a> EPMA Journal. 9, 287-297 (2018).</li><li>Zhan, X., Long, Y., Lu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploration+of+variations+in+proteome+and+metabolome+for+predictive+diagnostics+and+personalized+treatment+algorithms:+Innovative+approach+and+examples+for+potential+clinical+application.">Exploration of variations in proteome and metabolome for predictive diagnostics and personalized treatment algorithms: Innovative approach and examples for potential clinical application.</a> Journal of Proteomics. 188, 30-40 (2018).</li><li>Lu, M., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crucial+role+of+multiomic+approach+in+cancer+research+and+clinically+relevant+outcomes.">The crucial role of multiomic approach in cancer research and clinically relevant outcomes.</a> EPMA Journal. 9, 77-102 (2018).</li><li>Hu, R., Wang, X., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-parameter+systematic+strategies+for+predictive,+preventive+and+personalised+medicine+in+cancer.">Multi-parameter systematic strategies for predictive, preventive and personalised medicine in cancer.</a> EPMA Journal. 4, 2 (2013).</li><li>Cheng, T., Zhan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+recognition+for+predictive,+preventive,+and+personalized+medicine+in+cancer.">Pattern recognition for predictive, preventive, and personalized medicine in cancer.</a> EPMA Journal. 8, 51-60 (2017).</li><li>Zhan, X., Zhou, T., Li, N., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+differentially+mitochondrial+proteomic+dataset+in+human+ovarian+cancer+relative+to+control+tissues.">The differentially mitochondrial proteomic dataset in human ovarian cancer relative to control tissues.</a> Data in Brief. 20, 459-462 (2018).</li><li>McMillan, J. D., Eisenback, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+electron+microscopy+for+analysis+of+mitochondria+in+mouse+skeletal+muscle.">Transmission electron microscopy for analysis of mitochondria in mouse skeletal muscle.</a> Bio-protocol. 8, e2455 (2018).</li><li>Paul, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+ablation+of+TRAF6+inhibits+skeletal+muscle+wasting+in+mice.">Targeted ablation of TRAF6 inhibits skeletal muscle wasting in mice.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1395-1411 (2010).</li><li>Pascual-Ahuir, A., Manzanares-Estreder, S., Proft, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-+and+antioxidant+functions+of+the+peroxisome-mitochondria+connection+and+its+impact+on+aging+and+disease.">Pro- and antioxidant functions of the peroxisome-mitochondria connection and its impact on aging and disease.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2017, 9860841 (2017).</li><li>Schrader, M., Costello, J., Godinho, L. F., Islinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisome-mitochondria+interplay+and+disease.">Peroxisome-mitochondria interplay and disease.</a> Journal of Inherited Metabolic Disease. 38, 681-702 (2015).</li><li>Bartol&#225;k-Suki, E., Imsirovic, J., Nishibori, Y., Krishnan, R., Suki, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mitochondrial+structure+and+dynamics+by+the+cytoskeleton+and+mechanical+factors.">Regulation of mitochondrial structure and dynamics by the cytoskeleton and mechanical factors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 1812 (2017).</li><li>Rezaul, K., Wu, L., Mayya, V., Hwang, S., Han, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+characterization+of+mitochondrial+proteome+from+human+T+leukemia+cells.">A systematic characterization of mitochondrial proteome from human T leukemia cells.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 4, 169-181 (2005).</li><li>Zhan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+many+proteins+can+be+identified+in+a+2DE+gel+spot+within+an+analysis+of+a+complex+human+cancer+tissue+proteome?.">How many proteins can be identified in a 2DE gel spot within an analysis of a complex human cancer tissue proteome?.</a> Electrophoresis. 39, 965-980 (2018).</li><li>Zhan, X., Li, N., Zhan, X., Qian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revival+of+2DE-LC/MS+in+proteomics+and+its+potential+for+large-scale+study+of+human+proteoforms.">Revival of 2DE-LC/MS in proteomics and its potential for large-scale study of human proteoforms.</a> Med One. 3, e180008 (2018).</li></ol>

Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van ovariële kanker. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle weefsels voor grootschalige kwantitatieve proteomica profiteren van de diepgaande kennis van de mitochondriale functie in ovariële kanker pathogenese en mitochondriale moleculaire netwerkveranderingen, en helpen verduidelijken het moleculaire mechanisme voor latere ontdekking van de doelgroep therapie en effectieve biomarkers op basis van mitochondriën<su...

Ovariële kanker is een veel voorkomende gynaecologische kanker met hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme1,2. De meeste van ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de gevorderde fase, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress3,4,5,6,7. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Mitochondriale metabolisme is voorgesteld en erkend als een doelwit voor kankertherapie, en antimitochondrial therapie zou uiteindelijk zeer gunstig zijn voor het voorkomen van de herhaling en metastase van kanker8. Individuele metabole profilering wordt ook al beoefend als een nuttig instrument voor kanker stratificatie en voorspellende strategieën9,10.
Het langetermijndoel van dit onderzoek is het ontwikkelen en gebruiken van een kwantitatieve mitochondriale proteomica-methode om ovariële kanker te bestuderen voor verduidelijking van mitochondriale Proteoom veranderingen tussen eierstokkanker en controle van ovariële weefsels, en hun moleculaire netwerk wijzigingen van een systematische multi-omics hoek11,12, die zal resulteren in de ontdekking van mitochondriën gerichte moleculaire biomarkers13 voor verduidelijking van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, voorspelling en gepersonaliseerde behandeling van ovariële kankerpatiënten. Isobaric-Tags voor relatieve en absolute kwantificering (itraq)-labeling3,4 zijn een effectieve methode om de mitochondriale eiwit veranderingen te kwantificeren. Voorbereiding van hoogwaardige mitochondriale monsters van menselijke ovariële kanker en controle ovariële weefsels zijn de voorwaarde voor iTRAQ kwantitatieve analyse van mitochondriale proteomes3. Mitochondriale voorbereiding in combinatie met itraq kwantitatieve proteomica is met succes gebruikt in langetermijnonderzoek Programma's over de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom, met inbegrip van de oprichting van mitochondriale Proteoom referentiekaarten3, de analyse van differentiaal uitgedrukt mitochondriale profielen4,14 en post-translationele modificaties, met inbegrip van fosforylering, die al heeft geresulteerd in de ontdekking van belangrijke signalering traject netwerkveranderingen in menselijke ovariumkanker5, met inbegrip van veranderingen in het energiemetabolisme4, lipide metabolisme, en mitophagy pathway-systemen3.
Eerdere studies hebben geconstateerd dat het differentieel toerental centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren een effectieve methode is om mitochondriën te isoleren en te zuiveren van menselijke ovariële kanker en controle van ovariële weefsels3,4,5,14. De iTRAQ labeling in combinatie met sterke kation Exchange (SCX)-vloeistofchromatografie (LC)-tandem massaspectrometrie (MS/MS) is de belangrijkste techniek om te detecteren, identificeren en kwantificeren van de eiwitten uit de voorbereide mitochondriale monsters.
Hier worden gedetailleerde protocollen voor mitochondriale voorbereiding in combinatie met iTRAQ kwantitatieve proteomica beschreven. Deze zijn met succes gebruikt in de analyse van menselijke ovariële kanker weefsel mitochondriale proteomes. De protocollen omvatten de bereiding van monsters, differentiële-snelheid centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, iTRAQ-labeling, SCX-fractionering, LC, MS/MS, database zoeken en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Bovendien vertaalt dit Protocol zich gemakkelijk om andere menselijke weefsel mitochondriale proteomes te analyseren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>BCA protein assay kit</td>
			<td>Vazyme</td>
			<td>E112</td>
			<td>BCA protein assay kit is a special 3-component version of our popular BCA reagents, optimized to measure (A562nm) total protein concentration of dilute protein solutions (0.5 to 20 micrograms/ml).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>A8020-5G</td>
			<td>Heat shock fraction, Australia origin, protease free, low fatty acid, low IgG, pH 7, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>XiangYi</td>
			<td>TDZ4--WS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHAPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C9426-5G</td>
			<td>BioReagent, suitable for electrophoresis, &#8805;98% (HPLC) (Sigma-Aldrich)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamine tetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>798681-100G</td>
			<td>Anhydrous, free-flowing, Redi-Dri, &#8805;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10197777001</td>
			<td>1,4-Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy nLC</td>
			<td>Proxeon Biosystems (now Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylen glycol bis(2-aminoethyl ether)tetraacetic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-10G</td>
			<td>BioXtra, &#8805;97 .0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>SilentShake</td>
			<td>HYQ-3110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTRAQ reagent kit</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td></td>
			<td>Applied Biosystems iTRAQ Reagents&#8211;Chemistry Reference Guide, P/N 4351918A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-temperature super-speed centrifuger</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mannitol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>M813424-100G</td>
			<td>Mannitol is a polyol (polyhydric alcohol) produced from hydrogenation from fructose that functions as a sweetener, humectant, and bulking agent. It has low hygroscopicity and poor oil solvency.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MASCOT search engine</td>
			<td>Matrix Science, London, UK; version 2.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nagarse</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P9090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-hydroxysuccinimide (SDT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56480-25G</td>
			<td>Purum, &#8805;97.0% (T)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Alere/Axis-Shield</td>
			<td>1002424-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) protease inhibitor</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>P0100-1ML</td>
			<td>PMSF is a protease inhibitor that reacts with serine residues to inhibit trypsin, chymotrypsin, thrombin, and papain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816354-25G</td>
			<td>Potassium chloride, KCI, also known as potassium muriate and sylvite, is a colorless crystalline solid with a salty taste that melts at 776&#176;C (1420 OF). It is soluble in water, but insoluble in alcohol. Potassium chloride is used in fertilizers, pharmaceuticals, photography, and as a salt substitute.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteome Discover 1.4</td>
			<td>Matrix Science, London, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>05317</td>
			<td>It is 1 roll, 26.5 cm x 1.875 m, 0.45 &#181;m pore size, hydrophobic PVDF transfer membrane with low background fluorescence for western blotting. It is compatible with visible and infrared fluorescent probes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive mass spectrometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCX column</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>58997</td>
			<td>It is 5-&#956;m particle size, length 5cm &#215; i.d. 4.6mm (Supelco).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium orthovanadate (V)</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S817660-25G</td>
			<td>Sodium orthovanadate (Vanadate) is a general competitive inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. The inhibition by sodium orthovanadate is reversible upon the addition of EDTA or by dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>S824459-500G</td>
			<td>Vetec reagent grade, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>62-56-6</td>
			<td>ACS reagent, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10708976001</td>
			<td>TRIS base is useful in the pH range of 7.0-9.0. It has a pKa of 8.1 at 25&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin (cell culture use)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U5378-100G</td>
			<td>powder, BioReagent, for molecular biology, suitable for cell culture</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mitochondria from ovarian cancer tissues and control ovarian tissues for quantitative proteomics analysis

Ovariële kanker is een veelvoorkomende gynaecologische kanker met een hoge sterfte maar onduidelijk moleculair mechanisme. De meeste ovariële kankers worden gediagnosticeerd in de vergevorderd stadium, die ernstig belemmert therapie. Mitochondriale veranderingen zijn een kenmerk van menselijke ovariële kankers, en mitochondriën zijn de centra van energiemetabolisme, cel signalering, en oxidatieve stress. Diepgaand inzicht in de veranderingen van het mitochondriale Proteoom in ovariële kankers in vergelijking met controle ovariumweefsel zal profiteren van diepgaand begrip van de moleculaire mechanismen van eierstokkanker, en de ontdekking van effectieve en betrouwbare biomarkers en therapeutische doelen. Een effectieve mitochondriale bereidingsmethode in combinatie met een isobarische tag voor relatieve en absolute kwantificering (itraq) kwantitatieve proteomica worden hier gepresenteerd om menselijke ovariële kanker te analyseren en mitochondriale proteomes te beheersen, inclusief differentieel toerental centrifugeren, dichtheidsgradiënt centrifugeren, kwaliteitsbeoordeling van mitochondriale monsters, eiwit vertering met trypsine, itraq-labeling, sterke kationen uitwisselings fractionering (SCx), vloeistofchromatografie (LC), tandem massaspectrometrie (MS/ MS), database-analyse en kwantitatieve analyse van mitochondriale eiwitten. Veel eiwitten zijn met succes geïdentificeerd om te maximaliseren van de dekking van de menselijke ovariële kanker mitochondriale Proteoom en het bereiken van de differentiaal uitgedrukt mitochondriale eiwit profiel in menselijke ovariële kankers.

Er was een verschil in de voorbereiding van de mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels. Deze studie vond dat het veel gemakkelijker was om mitochondriën te bereiden van eierstokkanker weefsels dan van controle ovariële weefsels3,4. Enkele verbeteringen moesten worden aangebracht in het protocol voor de bereiding van mitochondriën van controle ovariële weefsels. Ten eerste moest voorafgaand a...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis at JoVE.com

Preparation of Mitochondria from Ovarian Cancer Tissues and Control Ovarian Tissues for Quantitative Proteomics Analysis

Dit artikel presenteert een protocol van differentiële-snelheid centrifugeren in combinatie met dichtheidsgradiënt centrifugeren te scheiden mitochondriën van menselijke ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve proteomica analyse, resulterend in een hoge kwaliteit mitochondriale monster en hoge doorvoer en hoge reproduceerbaarheid kwantitatieve proteomica analyse van een menselijke ovariële kanker mitochondriale proteome.

Bereiding van mitochondriën van ovariële kanker weefsels en controle ovariële weefsels voor kwantitatieve Proteomics analyse

Ovarian cancer is a common gynecologic cancer with high mortality but unclear molecular mechanism. Most ovarian cancers are diagnosed in the advanced ...

Mitochondriale veranderingen spelen een belangrijke rol bij menselijke eierstokkanker. Dit protocol stelt een effectief platform op om mitochondriën te isoleren en te zuiveren van menselijke eierstokkanker en de controleweefsels voor grootschalige proteomics-analyse. Mitochondriën, als een centra van energiemetabolisme, celsignalering, en oxidatieve stress, inzicht in mitochondriale proteoom veranderingen in eierstokkanker ten goede komen aan ons begrip moleculair mechanisme, en is een ontdekking van effectieve biomarkers en de therapeutische doelen.Deze techniek maakt gebruik van differentiële snelheid centrifugatie in combinatie met dichtheid gradiënt centrifugatie te scheiden mitochondriën van menselijke eierstokkanker in de controle weefsels, wat resulteert in hoge kwaliteit mitochondriën monsters voor kwantitatieve proteomics analyse. De mitochondriën preparaat, in combinatie met iTRAQ kwantitatieve proteomics, zijn met succes gebruikt bij de analyse van menselijke eierstokkanker weefsel, die gemakkelijk vertaalt naar andere weefsel te analyseren, mitochondriën proteomics. Degenen die nog nooit hebben uitgevoerd deze methode kan vinden dat het moeilijk kan zijn om mitochondriën te isoleren van de eierstokcontrole dan kankerweefsels.Het is noodzakelijk om een trypsine toe te voegen om de controle weefsel homogenisatie te verbeteren en voeg een extra laag van dichtheid gradiënt medium om mitochondriën scheiding te verbeteren. Om deze procedure te beginnen, bereid 250 milliliter van de mitochondriale isolatiebuffer zoals beschreven in het tekstprotocol. Plaats ongeveer 1,5 gram eierstokkanker weefsels in een schone glazen schotel.Voeg twee milliliter voorgekoelde mitochondriale isolatiebuffer toe om het bloed van het weefseloppervlak licht te wassen. Herhaal deze was drie keer. Gebruik vervolgens een schone oogheelkundige schaar om het weefsel volledig te gehakt in stukken die ongeveer een kubieke millimeter zijn, en breng de gehakte weefsels over in een 50 milliliter centrifugebuis.Voeg 13,5 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe met nagarse bij een concentratie van 0,2 milligram per milliliter. Gebruik een elektronische homogenisator om de gehakte weefsels twee minuten te homogeniseren bij vier graden Celsius. Voeg hierna nog eens drie milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe aan de weefselhomogenates en meng ze goed door pipetteren.Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat op 1, 300 xg, en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de pellet en houd de supernatant. Vervolgens centrifuge de supernatant op 10,000 xg en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verwijder de microsome-bevattende supernatant, en houd de pellet. Voeg 2 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe en hang de pellet grondig op door lichtpipetting. Centrifuge deze pellet suspensie op 7,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant, en houd de pellet, die de ruwe mitochondriën bevat. Voeg 12 milliliter van 25% dichtheidgradiënt medium toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën opnieuw op te schorten. Maak een discontinu dichtheidsgradiënt met de opnieuw opgehangen ruwe mitochondriën zoals beschreven in het tekstprotocol, en versteen het op 52,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 90 minuten.Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën te verzamelen op de interface tussen de 25% en 30% gradiënt mediums, en breng dit naar een schone buis. Voeg mitochondriale isolatiebuffer toe aan de verzamelde mitochondriën om het te verdunnen tot een drievoudig volume. Centrifuge op 15,000 xg, en op vier graden Celsius gedurende 20 minuten.Gooi de supernatant weg en houd de pellet. Verzamel de laatste pellet die de gezuiverde mitochondriën bevat, en bewaar het op 20 graden Celsius. Bereid eerst 250 milliliter van de mitochondriale isolatiebuffer voor, zoals beschreven in het tekstprotocol.Voeg ongeveer 1,5 gram van de normale controle eierstokweefsels toe aan een schone glazen schaal. Voeg twee milliliter voorgekoelde mitochondriale isolatiebuffer toe om het bloed van het weefseloppervlak licht te wassen. Herhaal deze was drie keer.Met behulp van schone oogheelkundige schaar, volledig gehakt het weefsel in stukken die ongeveer 1 kubieke millimeter, en breng de gehakte weefsels in een schone 50 milliliter buis. Voeg acht milliliter van een oplossing met 0,05% trypsine en 20 millimolar EDTA en PBS toe aan de gehakte controleweefsels en vert verteer 30 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te helpen lyse en laat de mitochondriën los. Centrifuge op 200 xg gedurende vijf minuten.Gooi de supernatant, en houd de weefsels en cellen. Voeg 13,5 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe met nagarse bij een concentratie van 0,2 milligram per milliliter en gebruik een elektrische homogenisator om de gehakte weefsels twee minuten lang te homogeniseren bij vier graden Celsius. Voeg nog eens drie milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe aan de weefselhomogenates en meng grondig door pipetting.Centrifugeer het bereide weefsel homogenaat op 1, 300 xg en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verwijder de pellet en houd de supernatant. Centrifuge de supernatant op 10,000 xg en op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verwijder de supernatant, die de microsomen bevat, en houd de pellet. Voeg vervolgens 2 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe en hang de pellet opnieuw grondig op door lichtpipetting. Centrifuge deze pellet suspensie op 7,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant en houd de pellet die de ruwe mitochondriën bevat. Voeg 12 milliliter van 25% dichtheidgradiënt medium toe om de geëxtraheerde ruwe mitochondriën opnieuw op te schorten. Maak een discontinu dichtheidsgradiënt met de ruwe mitochondriën zoals beschreven in het tekstprotocol en verstek het op 52,000 xg en bij vier graden Celsius gedurende 90 minuten.Gebruik een lange en stompe spuit om de gezuiverde mitochondriën te verzamelen in het bereik van de interface tussen de 25 en 30% gradiënt mediums tot de interface tussen de 34 en 38% gradiënt mediums. Breng de gezuiverde mitochondriën over op een schone buis. Voeg mitochondriale isolatiebuffer toe aan de verzamelde mitochondriën om het te verdunnen tot een drievoudig volume.Centrifuge op 15,000 xg en op vier graden Celsius gedurende 20 minuten, en gooi de supernatant. Voeg 2 milliliter mitochondriale isolatiebuffer toe om de pellet opnieuw op te schorten en te centrifugeren bij 15, 000 xg en gedurende 20 minuten bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en houd de pellet.Verzamel de laatste pellet en bewaar het op 20 graden Celsius. In deze studie worden hoogwaardige mitochondriale monsters bereid van menselijke eierstokkanker en controleweefsels voor grootschalige kwantitatieve proteomics. Er zijn een paar verschillen in de voorbereiding van de mitochondriën van eierstokkanker weefsels en controle eierstokweefsels, met inbegrip van het gebruik van een andere discontinu dichtheid gradiënt.Na centrifugatie, de gezuiverde mitochondriën uit eierstokkanker weefsels worden gevonden op de interface tussen 25%en 30%, terwijl die van controle eierstokweefsels worden gevonden in het bereik van de interface tussen 25%en 30%- tot de interface tussen 34%en 38%De kwaliteit van de voorbereide mitochondria wordt vervolgens geëvalueerd met differentiële snelheid centrifugatie en dichtheidsverloop via elektronenscopie. De elektronenmicroscoop beelden tonen aan dat in zowel eierstokkanker en controle eierstokweefsels, de belangrijkste organellen geïsoleerd zijn mitochondriën, met uitzondering van een kleine hoeveelheid peroxisomen. Echter, de morfologie van de mitochondriën wordt gezien om meer te veranderen in eierstokkanker dan controle eierstokweefsel.De kwaliteit van de bereide mitochondriën wordt ook geëvalueerd via western vlek. De westelijke vlek beelden tonen ook aan dat de belangrijkste component in voorbereide mitochondriale monsters van eierstokkanker en controle eierstokken is mitochondriën, met uitzondering van een kleine hoeveelheid peroxisomen, die in overeenstemming is met het elektron microscopie analyse. Het is redelijk dat peroxisomen in de voorbereide mitochondriën worden opgenomen, omdat mitochondriën op grote schaal interageren met peroxisomen, wat op zijn beurt de functionele volledigheid van de mitochondriën weerspiegelt.Deze resultaten tonen de hoge kwaliteit van de bereide mitochondriale monsters aan. Als ik deze procedure uitvoer, is het erg belangrijk dat je weefsels volledig gehakt voor homogenisatie, en voeg de trypsine aan de gehakte controle weefsels. Het is ook belangrijk dat u maakt en of voorbereid discontinu dichtheid gradiënt voor de kanker monsters en de controles.Na deze procedure kunnen iTRAQ- of TMT-kwantitatieve proteomics of fosfoproteomics worden uitgevoerd om het eierstokkanker mitochondriën proteomeprofiel te verduidelijken en kan een fosfoprotenoomprofiel worden vastgesteld om de rol van mitochondriën bij eierstokkanker in grote diepte te verduidelijken. Deze techniek effent de weg voor onderzoekers om systematisch mitochondriën proteoom en het fosfoprotenoom bij eierstokkanker te bestuderen, het netwerksysteem van de signaleringsroute te construeren en de betrouwbare biomarkers en de therapeutische doelen te ontdekken.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Oppervlakte-enhanced resonantie Raman verstrooiing nanosonde Ratiometry voor het opsporen van microscopische eierstokkanker via folaat Receptor gericht op

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Digital Analysis of Immunostaining of ZW10 Interacting Protein in Human Lung Tissues

Digitale analyse van immunokleuring van ZW10 interactie eiwit in menselijke Long weefsels

The purpose of this study is to introduce a methodology of the immunostaining of human lung tissues, followed by whole-slide digital scanning and image ...

Characterization and Functional Prediction of Bacteria in Ovarian Tissues

Karakterisering en functionele voorspelling van bacteriën in eierstokweefsels

The theory of a "sterile" female upper reproductive tract has been encountering increasing opposition due to advancements in bacterial detection. However, ...

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

Voorbereiding van menselijke weefsels ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding voor massaspectrometrie-analyse

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

Generation and Culturing of High-Grade Serous Ovarian Cancer Patient-Derived Organoids

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

Organoids are 3D dynamic tumor models that can be grown successfully from patient-derived ovarian tumor tissue, ascites, or pleural fluid and aid in the ...

Quantifying Replication Stress in Ovarian Cancer Cells Using Single-Stranded DNA Immunofluorescence

Kwantificering van replicatiestress in eierstokkankercellen met behulp van enkelstrengs DNA-immunofluorescentie

Replication stress is a hallmark of several ovarian cancers. Replication stress can emerge from multiple sources, including double-strand breaks, ...

Application of AlDeSense to Stratify Ovarian Cancer Cells Based on Aldehyde Dehydrogenase 1A1 Activity

Toepassing van AlDeSense om eierstokkankercellen te stratificeren op basis van aldehydedehydrogenase 1A1-activiteit

Relapse after cancer treatment is often attributed to the persistence of a subpopulation of tumor cells known as cancer stem cells (CSCs), which are ...

Ovarian Cancer Patient-Derived Organoid Models for Pre-Clinical Drug Testing

Ovarian cancer is a fatal gynecologic cancer and the fifth leading cause of cancer death among women in the United States. Developing new drug treatments ...

Human Omentum Specimen Processing and Co-Culture with Ovarian Cancer Cells

Verwerking van menselijke omentummonsters en co-cultuur met eierstokkankercellen

Establishing a 3D Ex Vivo Model for Ovarian Cancer-Omentum Interaction

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Author Spotlight: Advanced Ex Vivo Model for Investigating Cancer-Adipose Microenvironment Interaction 

Een ex vivo-model van peritoneale metastase van eierstokkanker met behulp van humaan omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...