メタボロミクスの革新的な方法を開発しました。生きた細胞のベルフリースペクトルイメージングと単細胞質量分析を組み合わせた。私たちの技術は、薬物に対する単一細胞の代謝変化を監視し、予測することができます。
そして、これは基礎研究と産業のためのアプリケーションの多くを開きます。我々の方法は、現在の薬物評価技術に単細胞分解能を追加し、将来の創薬の取り組みを大いに助ける。私たちの技術はまた、癌耐性における細胞異質性が果たす役割を理解するのに役立ちます。
単一セルのサンプリングとデータ分析は、この実験で最も困難な側面です。現在、この 2 つのステップ、特にサンプリング部分の自動化に取り組んでいます。実験の前にシングルセルサンプリングを練習することをお勧めします, 各マイクロマニピュレータのセットアップは、コントロールに慣れる時間を取る必要があります.
細胞を70%合流に達するようにインキュベートした後、適切な培養培地に関心のある培養細胞に、ペニシリン・ストレプトマイシンを添加して汚染を避ける。ヘモサイトータで細胞密度を測定した後、サブ培養細胞を35ミリメートルガラス底グリッド皿または石英スライドに、0.7倍の播種密度で同じ培地を使用して6番目に。その後、摂氏37度で24時間インキュベートします。
翌日、細胞は50〜60%の合流度に達し、摂氏37度で予め温めたPBSバッファーで細胞を2回洗浄する。35ミリメートル培養皿で細胞を薬物処理および未処理のサブグループに分ける。培養培地とジメチルスルホキシドに溶解したタモキシフェンを混合し、10マイクロモルの2ミリリットル及びタモキシフェン濃度の最終体積を得た。
これは薬物処理群です。DMSOの効果を調べるためのコントロールグループとして、DMSOの対応するボリュームを培地に混ぜます。2ミリリットルのスパイクされた培地の両方のグループを24時間インキュベートして、スペクトル測定の前に70〜80%の合流度に達し、ターゲットを使用してピンホールとレーザー位置が一致することを確認します。
各実験の前に分光光度計を較正するには、ガラス底皿にエタノールを入れ、与えられたレーザー強度でスペクトルを1秒間測定し、ピークを既知の波長に関連付けます。その後、マイクロチャンバーを5%の二酸化炭素と摂氏37度に設定します。顕微鏡システムの準備ができたら、インキュベーターから細胞を取り除き、37°Cの温めたPBSバッファーで細胞を2回すぐにすすいだ。
その後、温めたPBSまたはフルオロブライトDMEMの2ミリリットルを追加します。水浸し対物レンズに10マイクロリットルの水を加えます。そして顕微鏡の段階にガラス底の細胞皿を繊細に置く。
ラマン顕微鏡に細胞サンプリングシステムを固定します。3Dマイクロマニピュレータを、空のシリンジに取り付けられたガラスキャピラリーホルダーに接続して、サンプル吸い込みます。顕微鏡を40倍の高倍率フィールドにセットして、ガラスキャピラリーの先端を観察し、壊れていないことを確認します。
マイクロマニピュレータを使用してガラスキャピラリーの位置を制御します。毛細管先端が視野の中央に配置されていることを確認します。その後、後で培養皿のクリアランスを与えるためにZ軸上に毛細血管を上に移動します。
サンプル皿を顕微鏡のステージに置き、倍率と焦点を調整し、グリッド皿のターゲットセルを選択して、それを中央に移動します。レーザーラインを焦点を合わせて各セルを測定します。細胞当たり15秒の露光時間は、明確なラマン信号を有するセルの断面を得るのに十分である。
ガルバノミラーは、数十分以内に1つのセルまたは細胞のグループをスキャンすることができます。その後、先端が焦点を合わせるまで、マイクロマニピュレーターを使用して慎重にガラスキャピラリーを下げます。顕微鏡観察の下で、毛細管先端でターゲット単一細胞をタッチします。
次に、シリンジを使用して陰圧を加え、毛細管先端の内側の細胞をトラップします。正確にタイミングと細胞の吸引場所を確認するためにビデオを取ることによって、この手順を記録します。Z 軸上でキャピラリーを上に移動します。
次に、マス分析分析に備えて鉗子を使用して毛細管ホルダーから毛細管を取り外します。質量分析計器を設置し、培地を分析した後、細胞を含むキャピラリーに2マイクロリットルのイオン化溶媒を加える。適切な質量分析装置に接続されたナノエレクトロスプレーアダプターにキャピラリーを固定し、自動取得方法を開始します。
薬物治療の有無にかかわらず、各条件の平均スペクトルの比較分析をここに示す。2つの条件の平均スペクトルは、様々なピークで明らかに異なります。特に、1,000センチのピークは、フェニルアラニンおよびチロシンなどの芳香族化合物に対する徴候であり、強い違いを示す。
潜伏構造モデルの投影法に基づき、実験条件を識別する際の波長の重要性を表すVIPスコアを算出した。重要なことに、VIPプロファイルの最高峰は、2つの治療の間に強い違いが見られたラマンピークに対応していました。これにより、処理細胞と未処理細胞の間の特定の分子差が確認された。
陽性同定の後、薬物およびその代謝産物の相対的な存在量を各細胞で測定し、未治療細胞のバックグラウンドピークと比較した。タモキシフェンの豊富で強い変動が認められた。そして、この現象は、その代謝産物4-ヒドロキシタモキシフェンの場合にさらに顕著であった。
研究者は、スペクトル画像と細胞の代謝プロファイルとの間のリンクを探求することに興味を持つことができます。.また、医薬品製造用の細胞の局所スクリーニングが可能なため、工業用の研究も行っています。質量分析計測定用のイオン化溶媒を調製する際は、注意が必要です。
それはヒュームフードの下に準備する必要があります。また、感電を避けるために質量分析計器具のイオン源に触れないように注意してください。最後に、測定全体で使用されるサンプリング毛細血管は非常に鋭いので、怪我を避けるために注意して処理します。
