En integrerad Raman spektroskopi och masspektrometri plattform för att studera Single-cell drog upptag, metabolism, och effekter

Vi utvecklade en innovativ metod för metabolomik. Vi kombinerade Belfry spektrala avbildning av levande celler med encellig masspektrometri. Vår teknik kan övervaka och förutsäga de metaboliska förändringarna av enstaka celler mot droger.

Och detta öppnar en hel del ansökan om grundforskning och industri. Vår metod lägger encellig upplösning till nuvarande tekniker drog utvärdering som i hög utsträckning kommer att hjälpa framtida insatser drog upptäckt. Vår teknik kan också hjälpa oss att förstå den roll som cellulär heterogenitet i cancerresistens.

Den single-cell sampling och dataanalys är de mest utmanande aspekterna i detta experiment. Vi arbetar för närvarande med att automatisera dessa två steg, särskilt samplingsdelen. Vi rekommenderar att du övar på encellsprovtagningen långt före experimentet, eftersom varje mikromanipulator-inställning är något annorlunda och du bör ta dig tid att bekanta dig med kontrollerna.

Efter inkubering celler för att nå 70%confluency, kultur celler av intresse i en lämplig kultur media, lägga Penicillin-Streptomycin att undvika kontaminering. Efter att ha mätt celltäthet på en hemocytometer, subkultur celler i en 35 millimeters glas botten galler skålen eller kvarts diabilder, med samma medium vid en sådd densitet på 0,7 gånger 10 till den sjätte. Sedan inkubera vid 37 grader varmt i 24 timmar.

Nästa dag når cellerna en konfluency på 50 till 60%Tvätta cellerna två gånger med förvörd PBS-buffert vid 37 grader celsius. Dela upp cellerna i läkemedelsbehandlade och obehandlade undergrupper i 35 millimeters odlingsrätter. Blanda Tamoxifen upplöst i dimetylsulfoxid med odlingsmediet för att erhålla en slutlig volym på två milliliter och Tamoxifenkoncentration på 10 mikromolar.

Detta är den drogbehandlade gruppen. Blanda en motsvarande volym DMSO i mediet som en kontrollgrupp för att studera effekterna av DMSO. Inkubera båda grupperna i två milliliter av det spetsade mediet i 24 timmar för att nå en konfluency på 70 till 80%Före spektralmätningar, verifiera pinhole och laserpositionen med hjälp av ett mål.

För att kalibrera spektrofotometern före varje experiment, placera etanol i en glasbottenskål, mäta spektrumet vid en viss laserintensitet i en sekund och associera toppen till kända våglängder. Sedan setup mikro-kammaren på 5% koldioxid och 37 grader celsius. När mikroskopsystemet är klart, ta bort celler från inkubatorn och omedelbart skölja celler två gånger med uppvärmd PBS buffert vid 37 grader celsius.

Tillsätt sedan två milliliter av värmt PBS eller FluoroBrite DMEM. Tillsätt 10 mikroliter vatten på vattnet nedsänkning objektivet. Och försiktigt placera glaset botten cell skålen på mikroskopet scenen.

Fixera cellprovtagningssystemet på Raman-mikroskopet. Anslut 3D-mikromanipulatorn till den kapillärhållare av glas som sitter fast på en tom spruta för provsug. Ställ mikroskopet till ett högt förstoringsfält på 40 gånger för att observera glasmönskopets spets, och se till att det inte är trasigt.

Styr glasmönssörens position med hjälp av mikromanipulatorn. Se till att kapillärspetsen är centrerad i synfältet. Flytta sedan kapillären upp på Z-axeln för att ge klartecken för odlingsrätten senare.

Placera provskålen på scenen i mikroskopet, justera förstoringen och fokusera, välj målcellen på gallerskålen och flytta den till vyns mitt. Mät varje cell genom att fokusera laserlinjen. En 15 sekunders exponeringstid per cell är tillräcklig för att erhålla ett tvärsnitt av en cell med en tydlig Raman-signal.

En galvano-spegel tillåter skanning av en cell eller en grupp celler inom flera dussin minuter. Sänk sedan försiktigt ner glaskafillären med hjälp av micromanipulator tills spetsen kommer i fokus. Vid mikroskopisk observation vidrör du målcellen med kapillärspetsen.

Börja sedan applicera undertryck med hjälp av sprutan för att fånga cellen inuti kapillärspetsen. Spela in detta förfarande genom att ta en video för att kontrollera tidpunkten och sög plats för cellen exakt. Flytta kapillären uppåt på Z-axeln.

Därefter lossa kapillären från kapillärhållaren med hjälp av tcupp som förberedelse för masspektrometrianalys. Efter att ställa upp masspektrometri instrumentet och analysera media, tillsätt två mikroliter av jonisering lösningsmedel till kapillären som innehåller cellen. Fixera kapillären till en nano-elektrosprayadaptrar kopplad till en lämplig masspektrometer och starta den automatiska förvärvsmetoden.

En jämförande analys av det genomsnittliga spektrumet av varje tillstånd, med och utan läkemedelsbehandling, visas här. Det genomsnittliga spektrumet av de två förhållandena skiljer sig tydligt åt vid olika toppar. I synnerhet toppar på 1, 000 per centimeter, vilket är ett tecken på aromatiska föreningar som fenylalanin och tyrosin, visar starka skillnader.

Baserat på projektionen på latent strukturmodell beräknades VIP-poängen som representerar betydelsen av våglängder för att diskriminera de experimentella förhållandena. Viktigt, de högsta topparna av VIP-profiler motsvarade Raman toppar för vilka starka skillnader sågs mellan de två behandlingarna. Detta bekräftade de specifika molekylära skillnaderna mellan behandlade och obehandlade celler.

Efter positiv identifiering mättes den relativa överflödet av läkemedlet och dess metaboliter i varje cell och jämfördes med bakgrundstoppar i obehandlade celler. Stark variation observerades i Tamoxifen överflöd. Och detta fenomen var ännu mer uttalad i fallet med dess metabolit 4-hydroxi-tamoxifen.

Forskare kan vara intresserade av att utforska sambandet mellan spektrala bilder och metaboliska profiler av celler. Vår forskning har också industriella tillämpningar eftersom det möjliggör lokal screening av celler för läkemedelstillverkning. Försiktighet måste vidtas medan joniseringslösningsmedlet förbereds för masspektrometermätningarna.

Den bör förberedas under en draghuva. Var också försiktig så att du inte vidrör masspektrometerinstrumentets jonkälla för att undvika att bli elchockad. Slutligen är de provtagnings kapillärer som används under hela mätningen mycket skarpa, så hantera dem med försiktighet för att undvika skador.