Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة، DA043982 و DA046196.

تم التعامل مع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة بطريقة أخلاقية وإنسانية على النحو المنصوص عليه في لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرعاية والاستخدام الحيوانية في جامعة إنديانا (IACUC) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH).
ملاحظة: يجب غسل جميع الأدوات والأسطح مع مذيب مناسب لإزالة nucle...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

يصف هذا العمل تقنية لعزل مناطق صغيرة ومحددة من الدماغ مع الحد من تدهور الحمض النووي والبروتين. الضرر الذي يلحق بأنسجة الدماغ يحدث بسرعة بمجرد وفاة الكائن الحي. ويرجع ذلك جزئيا إلى تراكم سريع من الغلوتامات خارج الخلية وما ينتج عن ذلك من سمية التي تحدث21. رسول الجيش الملكي النيبا...

يوضح هذا العمل تشريح مناطق الدماغ المجمدة لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة أو البروتين باستخدام مرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس1، كدليل. في هذه التقنية ، يتم تجميد الأدمغة وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتشريح والتشريح في وقت لاحق أثناء الحفاظ عليها في حالة مجمدة. تسمح هذه العملية للباحث بحصاد عدد كبير من الأدمغة في جلسة واحدة ثم تشريحها في وقت لاحق لمجموعة دقيقة من مناطق الدماغ المتعددة.
غالبًا ما يكون الجمع الدقيق لمناطق الدماغ ذات الأهمية مطلوبًا عند الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتعبير الجيني والبروتيني. في حين يمكن استخدام علم الصيدلة والفيزيولوجيا الكهربائية وعلم الوراثة البصرية على البُرُّب أو القوارض المعدلة وراثياً للمساعدة في توضيح التغيرات الجزيئية التي تقوم عليها السلوكيات الملاحظة2،3،4، غالبًا ما يستخدم قياس التغيرات المستحثة في النصوص والبروتيوملدعم لدعم هذه النتائج. تقنيات مثل كمية عكس النسخ البوليميراز سلسلة التفاعل (RT-qPCR), النشاف الغربي, RNAseq5,MAPSeq6 و HPLC7 قوية ومنخفضة نسبيا في التكلفة, السماح للعديد من المختبرات لدراسة التغيرات الجزيئية المستحثة داخل مناطق الدماغ الصغيرة2,,4,,5,,6.
هناك عدة طرق لاستخراج وتنقية الحمض النووي أو البروتين من مناطق الدماغ8،9،10،11،12. العديد من مختبرات حصاد مناطق الدماغ عن طريق تقشعر لها الأبدان وقطع العقول على الجليد في وقت الحصاد9,13. في حين أن هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى حمض نوي عالي الجودة والبروتين ، إلا أنه محدود زمنيًا إلى حد ما حيث قد يحدث التدهور داخل البيئة الدقيقة للأنسجة في درجات الحرارة هذه. قد يكون هذا صحيحًا بشكل خاص عند محاولة تشريح عدد كبير من الحيوانات أو ROIs في جلسة واحدة. حفظ العينات المجمدة يساعد على الحفاظ على جزيئات الهدف labile مع توفير وقت الباحث لمقارنة بعناية المعالم على جانبي كل قسم في محاولة لجمع عينات نقية نسبيا. التقاط الليزر هو طريقة أخرى لجمع الأنسجة لالحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين من مناطق الدماغ10. هذا الإجراء هو متفوقة على تشريح الميكانيكية في أن يمكن تحديد هاوية صغيرة جدا وغير منتظمة الشكل ومعزولة. ومع ذلك، فإن التقاط الليزر محدود باستخدام المعدات والكواشف باهظة الثمن، وهو يستغرق وقتاً طويلاً وقد يكون أيضاً أكثر عرضة لتدهور العينة.
تشريح Micropunch على الأنسجة المجمدة ليست جديدة. أوراق في وقت مبكر من قبل Miklos Palkovits وغيرها وصف التقنيات الأساسية في التفاصيل14،15. ويتبع هذا العرض إلى حد كبير العمل الأصلي، مع إدخال بعض التحسينات لتيسير الكفاءة وتقليل نفقات المعدات اللازمة. على سبيل المثال، يتم إجراء أقسام الدماغ في كتلة الدماغ المجمدة بدلا من على cryostat. ينتج عن ذلك أقسام أكثر سمكًا مما يقلل من عدد الأقسام اللازمة لجمع عينات عائد الاستثمار. هذا الأسلوب أيضا تشريح عينات على لوحة زجاجية المجمدة التي يجلس على الجليد الجاف داخل مربع معزول. وهذا ينتج مرحلة التجمد الفرعي في مقاعد البدلاء التي للعمل. الأقسام التي يتم تشريحها بهذه الطريقة يمكن التلاعب بها بسهولة ، مما يسمح للباحث بمقارنة كلا الجانبين من كل قسم مع مرجع من أجل الحد من التلوث من المناطق خارج عائد الاستثمار المطلوب.
مزايا هذا البروتوكول هي أن 1) يتم الاحتفاظ الدماغ في حالة المجمدة طوال العملية، مما يساعد على الحفاظ على البروتين والحمض النووي ويعطي الباحث الوقت لحصاد بعناية ROIs، و 2) الكواشف المطلوبة غير مكلفة وتوجد في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. في هذه العملية، يتم قسمة الأدمغة الكاملة إلى 0.5-1.0 مم في مصفوفة الدماغ ووضعها على لوحة زجاجية مجمدة مبردة باستمرار بالجليد الجاف. المعالم الموجودة في أطلس الدماغ ألن1 أو الأطالس الدماغ الأخرى16,17 وتستخدم لتحديد المناطق ذات الاهتمام, التي يتم تشريحها بعد ذلك إما لكمة الباردة أو مشرط. نظرًا لعدم إذابة الأنسجة أبدًا ، توفر المناطق التي يتم حصادها بهذه الطريقة الحمض النووي الريبي والبروتين عالي الجودة لتحليل المصب.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

مع تقدم فهمنا لعلم الأحياء العصبية، غالبًا ما يتم إجراء التحليلات الجزيئية على مناطق الدماغ الصغيرة مثل قشرة الجبهية المتوسطة (mPFC) أو النواة. ويتمثل التحدي في هذا العمل في تشريح المنطقة الصحيحة مع الحفاظ على البيئة الجزئية التي يتعين فحصها. في هذه الورقة، نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة باستخدام الموارد المتاحة بسهولة في معظم المختبرات. تحافظ هذه الطريقة على الحمض النووي والبروتينات من خلال الحفاظ على الأنسجة المجمدة طوال العملية. يتم قطع الأدمغة إلى أقسام 0.5-1.0 مم باستخدام مصفوفة الدماغ ويتم ترتيبها على لوحة زجاجية مجمدة. تتم مقارنة المعالم داخل كل قسم بمرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس ، ويتم تشريح المناطق باستخدام مشرط بارد أو لكمة خزعة. ثم يتم تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. من خلال هذه العملية الفئران والفأرmPFC، نواة accumbens، قرن آمون الظهري والبطني ومناطق أخرى قد تم تحليلها بنجاح باستخدام qRT-PCR والمقالات الغربية. وتقتصر هذه الطريقة على مناطق الدماغ التي يمكن تحديدها من خلال معالم واضحة.

من أجل التحقق من صحة هذه الطريقة ، تم جمع قشرة الجبهية المتوسطة من الفئران الذكور من النوع البري CD1 البالغين وتم استخراج الحمض النووي الريبي والبروتين وتوصيفه. تم تحليل الحمض النووي الريبي بواسطة الكتروفورريس الشعيرات الدموية. يعرض الحمض النووي الريبي المتدهور خسارة في شدة النطاقات الري?...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

يصف هذا الإجراء مجموعة من مناطق الدماغ المجمدة منفصلة للحصول على بروتين عالي الجودة والجيش الملكي النيبالي باستخدام أدوات غير مكلفة ومتاحة عادة.

مجموعة من مناطق الدماغ القوارض المجمدة لتحليلات المصب

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

يصف هذا الإجراء مجموعة من مناطق الدماغ المجمدة منفصلة للحصول على البروتين عالي الجودة وRNA باستخدام أدوات غير مكلفة ومتاحة عادة. لأن مناطق الدماغ يتم الاحتفاظ المجمدة من الحصاد من خلال تشريح، يتم الحفاظ على الجزيئات المستهدفة والباحث لديه الوقت لتشريح بعناية وتخزين المناطق ذات الأهمية. تحديد المناطق ذات الأهمية يمكن أن يكون في البداية تحديا.استخدام معالم الدماغ المشتركة لأنها تظهر وتنحسر من خلال أقسام فيما يتعلق المناطق المطلوبة سيجعل تحديد واضح. بعد إزالة العقول من القتل الرحيم الكبار CD-1 الفئران البرية نوع، فلاش تجميد الأنسجة لمدة 60 ثانية في أي من النيتروجين السائل أو إيسوبينتان. قبل البرد مع الثلج الجاف وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية.قبل 24 ساعة من تشريح الأنسجة، ضع مصفوفة الدماغ النظيفة على كومة من حزم الفريزر المذابة. وساندويتش الجانبين إلى المصفوفة بين اثنين من حزم الفريزر التأكد من ترك ما يقرب من نصف سنتيمتر بين الجزء السفلي من فتحات الحلاقة والجزء العلوي من حزم. إعداد لوحة زجاجية مجمدة للتشريح عن طريق ملء مربع معزول مع الجليد تصل إلى ما يقرب من خمسة سنتيمترات من أعلى.ثم ضع طبقة 2.5 سنتيمتر من الجليد الجاف على القمة. واغطيها بأغطية بلاستيكية سوداء. ضع لوحة زجاجية فوق البلاستيك.و الثلج الجاف حول حدود الصحن إزالة مصفوفة الدماغ المجمدة من الفريزر وإدراج الدماغ، الجانب القشرة حتى، في المصفوفة. السماح للأنسجة لتكواسير إلى درجة الحرارة في منطقة الجزاء لمدة 10 دقائق.إبقاء الغطاء مفتوحاً خلال هذا الوقت. استخدام ملقط الباردة لضبط موقف الدماغ في المصفوفة بحيث جيب القوس والجيوب الأنفية العرضية خط يصل مع الأخادل عمودي من الكتلة. بمجرد أن يكون الدماغ في موضعه، ضع شفرة حلاقة مبردة بالقرب من مركزه واضغط عليه حوالي ملليمتر واحد في الأنسجة.بعد ذلك، ضع شفرة مبردة واحدة في كل نهاية من الدماغ واضغط على طول الطريق إلى أسفل إلى المصفوفة. ثم ابدأ في إضافة شفرات مبردة في النهاية الرسترالية ، ووضعها في فتحات واحدة في وقت واحد والضغط عليها بلطف ملليمتر واحد في الأنسجة. استمر في إضافة شفرات على فترات ملليمتر واحد، والعمل باتجاه نهاية الضم.عندما تكون جميع الشفرات في مكانها، اضغط لأسفل على أعلى مع الأصابع، والنخيل، أو كائن حاد وروك لهم ببطء من جانب إلى آخر لنقلها من خلال الأنسجة. بمجرد أن وصلت الشفرات إلى الجزء السفلي من الفتحات ، فهم كل جانب من مجموعة الشفرات وتحريرها من المصفوفة عن طريق هزاز ذهابا وإيابا. بعد تحرير مجموعة من ريش وضعها الجانب التاجي حتى على لوحة الزجاج، ووضع الجليد الجاف بجانب أو على رأس المكدس لتجميد مزيد من العينات لفصل أسهل.ثم ضع المكدس مع حواف حادة لأسفل وقم بفصل الشفرات عن طريق تحويل المكدس بين الإبهام والأصابع. صف القسم على اللوحات الزجاجية من الستراتل إلى السد وفصل الأنسجة عن الشفرات عن طريق ثنيها بين الأصابع ، أو عن طريق فصلها بشفرة مبردة ثانية. في بعض الأحيان، قد تلتصق الأنسجة على جانبي الشفرة ويجب توخي الحذر للحفاظ على الاتجاه التاجي إلى السد.قبل البدء في تشريح، فتح أطلس الدماغ الماوس ألن أو مرجع آخر والعثور على المعالم اللازمة لتحديد المناطق ذات الأهمية. استخدام ملقط أو شفرات مبردة لقلب القسم. وتأكد من أن المنطقة ذات الاهتمام متسقة في جميع أنحاء القسم.مقطعة إلى القسم مع مشرط نظيفة أو لكمة، ودفع المعدن بلطف ولكن بحزم في الأنسجة. هزاز عليه ذهابا وإيابا لجعل خفض. بعد حصاد المنطقة ذات الاهتمام، ضعها في أنابيب 1.5 ملليمتر مُبرَّدة مسبقًا ومُرّدة مسبقًا، ثم قم بتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية.لمعالجة الأنسجة، إضافة الباردة RIPA العازلة لاستخراج البروتين أو guanidinium تحتوي على مذيب لاستخراج الحمض النووي الريبي وعلى الفور التجانس مع انخفاض الزجاج أو التجانس الميكانيكية. للتحقق من صحة هذه الطريقة، تم جمع قشرة الفص الجبهي من الفئران الذكور من النوع البري البالغ CD-1، وتم توصيف الحمض النووي الريبي والبروتين. عندما تحليلها مع الكهرباء الشعرية، يظهر الحمض النووي الريبي المتدهورة فقدان في شدة 28S و 18S عصابات الريبوسوم، فضلا عن مسحة بين 25 و 200 نيوكليوتيدات.بينما يظهر الحمض النووي الريبي عالي الجودة نطاقات الريبوسومية المتميزة إشارة قليلة أو معدومة في منطقة الوزن الجزيئي السفلي. تم مقارنة الحصول على الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة التشريح المجمدة مع الحمض النووي الريبي المعدة من الأنسجة الطازجة. كلا طريقتين إنتاج الجيش الملكي النيبالي مع أعداد عالية من النزاهة و النطاقات الريبوسومية قوية.للتأكد من أن هذه الطريقة يمكن استخدامها للحفاظ على البيئة الدقيقة للأنسجة تشريح لتحليلها في وقت لاحق، تم استخراج الحمض النووي الريبي من قشرة الفص الجبهي المُنَحَث الذي تم تخزينه على مدى عدة أسابيع. أنتجت جميع العينات RNA عالية الجودة مع نطاقات ريبوزومية متميزة وأرقام سلامة الحمض النووي الريبي فوق ثمانية. لتأكيد سلامة البروتين من العينات تشريح المجمدة، تم جمع البروتين، ونقلها إلى نيتروسيلولوز والتحقيق مع الأجسام المضادة ضد الهدف الوزن الجزيئي العالي KCC2، وانخفاض الوزن الجزيئي البروتين actin.وفي جميع الحالات كانت النطاقات حادة ومتميزة دون منتجات انهيار ملحوظة. من المهم الحفاظ على الأنسجة المجمدة طوال العملية لأن هذا يحافظ على البيئة الدقيقة للأقسام والحفاظ على مورفولوجيا القسم للمقارنة مع صور أطلس الدماغ. ويمكن تخزين المناطق ذات الاهتمام التي يتم جمعها بهذه الطريقة لعدة أشهر في درجة مئوية سالبة 80 ويمكن استخدامها في العديد من التطبيقات المصب، بما في ذلك RT-qPCR، RNA-SEQ، وتحليل البقع الغربية، و HPLC.وقد استخدمت هذه الطريقة لاستكشاف التغيرات الجزيئية داخل النظم الحوفية من القوارض في الفترة المحيطة بالولادة المعرضة لTHC وغيرها من القنب لفهم أفضل كيف يمكن لهذه الأدوية أن تؤثر على نمو الدماغ.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

الرنين المغناطيسي الوظيفي في وقت واحد والكهربية في الدماغ القوارض

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation من الخلايا العصبية من الدماغ القوارض شرائح لدراسة نقل صورة متشابك ومحطات قبل المشبكي

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

المورفومترية التحليلات من أقسام الشبكية

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

عالية الدقة الكمية متشابك بروتيوم من التنميط ماوس مناطق الدماغ بعد السمعية التمييز التعلم

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

الإبر مخصصة لميكروينجيكشنز في الدماغ القوارض

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...