Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة، DA043982 و DA046196.

تم التعامل مع الحيوانات المستخدمة في هذه الدراسة بطريقة أخلاقية وإنسانية على النحو المنصوص عليه في لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للرعاية والاستخدام الحيوانية في جامعة إنديانا (IACUC) والمعاهد الوطنية للصحة (NIH).
ملاحظة: يجب غسل جميع الأدوات والأسطح مع مذيب مناسب لإزالة nucle...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

يصف هذا العمل تقنية لعزل مناطق صغيرة ومحددة من الدماغ مع الحد من تدهور الحمض النووي والبروتين. الضرر الذي يلحق بأنسجة الدماغ يحدث بسرعة بمجرد وفاة الكائن الحي. ويرجع ذلك جزئيا إلى تراكم سريع من الغلوتامات خارج الخلية وما ينتج عن ذلك من سمية التي تحدث21. رسول الجيش الملكي النيبا...

يوضح هذا العمل تشريح مناطق الدماغ المجمدة لاستخراج الحمض النووي عالي الجودة أو البروتين باستخدام مرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس1، كدليل. في هذه التقنية ، يتم تجميد الأدمغة وتخزينها عند -80 درجة مئوية للتشريح والتشريح في وقت لاحق أثناء الحفاظ عليها في حالة مجمدة. تسمح هذه العملية للباحث بحصاد عدد كبير من الأدمغة في جلسة واحدة ثم تشريحها في وقت لاحق لمجموعة دقيقة من مناطق الدماغ المتعددة.
غالبًا ما يكون الجمع الدقيق لمناطق الدماغ ذات الأهمية مطلوبًا عند الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتعبير الجيني والبروتيني. في حين يمكن استخدام علم الصيدلة والفيزيولوجيا الكهربائية وعلم الوراثة البصرية على البُرُّب أو القوارض المعدلة وراثياً للمساعدة في توضيح التغيرات الجزيئية التي تقوم عليها السلوكيات الملاحظة2،3،4، غالبًا ما يستخدم قياس التغيرات المستحثة في النصوص والبروتيوملدعم لدعم هذه النتائج. تقنيات مثل كمية عكس النسخ البوليميراز سلسلة التفاعل (RT-qPCR), النشاف الغربي, RNAseq5,MAPSeq6 و HPLC7 قوية ومنخفضة نسبيا في التكلفة, السماح للعديد من المختبرات لدراسة التغيرات الجزيئية المستحثة داخل مناطق الدماغ الصغيرة2,,4,,5,,6.
هناك عدة طرق لاستخراج وتنقية الحمض النووي أو البروتين من مناطق الدماغ8،9،10،11،12. العديد من مختبرات حصاد مناطق الدماغ عن طريق تقشعر لها الأبدان وقطع العقول على الجليد في وقت الحصاد9,13. في حين أن هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى حمض نوي عالي الجودة والبروتين ، إلا أنه محدود زمنيًا إلى حد ما حيث قد يحدث التدهور داخل البيئة الدقيقة للأنسجة في درجات الحرارة هذه. قد يكون هذا صحيحًا بشكل خاص عند محاولة تشريح عدد كبير من الحيوانات أو ROIs في جلسة واحدة. حفظ العينات المجمدة يساعد على الحفاظ على جزيئات الهدف labile مع توفير وقت الباحث لمقارنة بعناية المعالم على جانبي كل قسم في محاولة لجمع عينات نقية نسبيا. التقاط الليزر هو طريقة أخرى لجمع الأنسجة لالحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين من مناطق الدماغ10. هذا الإجراء هو متفوقة على تشريح الميكانيكية في أن يمكن تحديد هاوية صغيرة جدا وغير منتظمة الشكل ومعزولة. ومع ذلك، فإن التقاط الليزر محدود باستخدام المعدات والكواشف باهظة الثمن، وهو يستغرق وقتاً طويلاً وقد يكون أيضاً أكثر عرضة لتدهور العينة.
تشريح Micropunch على الأنسجة المجمدة ليست جديدة. أوراق في وقت مبكر من قبل Miklos Palkovits وغيرها وصف التقنيات الأساسية في التفاصيل14،15. ويتبع هذا العرض إلى حد كبير العمل الأصلي، مع إدخال بعض التحسينات لتيسير الكفاءة وتقليل نفقات المعدات اللازمة. على سبيل المثال، يتم إجراء أقسام الدماغ في كتلة الدماغ المجمدة بدلا من على cryostat. ينتج عن ذلك أقسام أكثر سمكًا مما يقلل من عدد الأقسام اللازمة لجمع عينات عائد الاستثمار. هذا الأسلوب أيضا تشريح عينات على لوحة زجاجية المجمدة التي يجلس على الجليد الجاف داخل مربع معزول. وهذا ينتج مرحلة التجمد الفرعي في مقاعد البدلاء التي للعمل. الأقسام التي يتم تشريحها بهذه الطريقة يمكن التلاعب بها بسهولة ، مما يسمح للباحث بمقارنة كلا الجانبين من كل قسم مع مرجع من أجل الحد من التلوث من المناطق خارج عائد الاستثمار المطلوب.
مزايا هذا البروتوكول هي أن 1) يتم الاحتفاظ الدماغ في حالة المجمدة طوال العملية، مما يساعد على الحفاظ على البروتين والحمض النووي ويعطي الباحث الوقت لحصاد بعناية ROIs، و 2) الكواشف المطلوبة غير مكلفة وتوجد في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية. في هذه العملية، يتم قسمة الأدمغة الكاملة إلى 0.5-1.0 مم في مصفوفة الدماغ ووضعها على لوحة زجاجية مجمدة مبردة باستمرار بالجليد الجاف. المعالم الموجودة في أطلس الدماغ ألن1 أو الأطالس الدماغ الأخرى16,17 وتستخدم لتحديد المناطق ذات الاهتمام, التي يتم تشريحها بعد ذلك إما لكمة الباردة أو مشرط. نظرًا لعدم إذابة الأنسجة أبدًا ، توفر المناطق التي يتم حصادها بهذه الطريقة الحمض النووي الريبي والبروتين عالي الجودة لتحليل المصب.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

مع تقدم فهمنا لعلم الأحياء العصبية، غالبًا ما يتم إجراء التحليلات الجزيئية على مناطق الدماغ الصغيرة مثل قشرة الجبهية المتوسطة (mPFC) أو النواة. ويتمثل التحدي في هذا العمل في تشريح المنطقة الصحيحة مع الحفاظ على البيئة الجزئية التي يتعين فحصها. في هذه الورقة، نصف طريقة بسيطة ومنخفضة التكلفة باستخدام الموارد المتاحة بسهولة في معظم المختبرات. تحافظ هذه الطريقة على الحمض النووي والبروتينات من خلال الحفاظ على الأنسجة المجمدة طوال العملية. يتم قطع الأدمغة إلى أقسام 0.5-1.0 مم باستخدام مصفوفة الدماغ ويتم ترتيبها على لوحة زجاجية مجمدة. تتم مقارنة المعالم داخل كل قسم بمرجع ، مثل أطلس دماغ ألن ماوس ، ويتم تشريح المناطق باستخدام مشرط بارد أو لكمة خزعة. ثم يتم تخزين الأنسجة عند -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. من خلال هذه العملية الفئران والفأرmPFC، نواة accumbens، قرن آمون الظهري والبطني ومناطق أخرى قد تم تحليلها بنجاح باستخدام qRT-PCR والمقالات الغربية. وتقتصر هذه الطريقة على مناطق الدماغ التي يمكن تحديدها من خلال معالم واضحة.

من أجل التحقق من صحة هذه الطريقة ، تم جمع قشرة الجبهية المتوسطة من الفئران الذكور من النوع البري CD1 البالغين وتم استخراج الحمض النووي الريبي والبروتين وتوصيفه. تم تحليل الحمض النووي الريبي بواسطة الكتروفورريس الشعيرات الدموية. يعرض الحمض النووي الريبي المتدهور خسارة في شدة النطاقات الري?...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

يصف هذا الإجراء مجموعة من مناطق الدماغ المجمدة منفصلة للحصول على بروتين عالي الجودة والجيش الملكي النيبالي باستخدام أدوات غير مكلفة ومتاحة عادة.

مجموعة من مناطق الدماغ القوارض المجمدة لتحليلات المصب

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

يصف هذا الإجراء مجموعة من مناطق الدماغ المجمدة منفصلة للحصول على البروتين عالي الجودة وRNA باستخدام أدوات غير مكلفة ومتاحة عادة. لأن مناطق الدماغ يتم الاحتفاظ المجمدة من الحصاد من خلال تشريح، يتم الحفاظ على الجزيئات المستهدفة والباحث لديه الوقت لتشريح بعناية وتخزين المناطق ذات الأهمية. تحديد المناطق ذات الأهمية يمكن أن يكون في البداية تحديا.استخدام معالم الدماغ المشتركة لأنها تظهر وتنحسر من خلال أقسام فيما يتعلق المناطق المطلوبة سيجعل تحديد واضح. بعد إزالة العقول من القتل الرحيم الكبار CD-1 الفئران البرية نوع، فلاش تجميد الأنسجة لمدة 60 ثانية في أي من النيتروجين السائل أو إيسوبينتان. قبل البرد مع الثلج الجاف وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية.قبل 24 ساعة من تشريح الأنسجة، ضع مصفوفة الدماغ النظيفة على كومة من حزم الفريزر المذابة. وساندويتش الجانبين إلى المصفوفة بين اثنين من حزم الفريزر التأكد من ترك ما يقرب من نصف سنتيمتر بين الجزء السفلي من فتحات الحلاقة والجزء العلوي من حزم. إعداد لوحة زجاجية مجمدة للتشريح عن طريق ملء مربع معزول مع الجليد تصل إلى ما يقرب من خمسة سنتيمترات من أعلى.ثم ضع طبقة 2.5 سنتيمتر من الجليد الجاف على القمة. واغطيها بأغطية بلاستيكية سوداء. ضع لوحة زجاجية فوق البلاستيك.و الثلج الجاف حول حدود الصحن إزالة مصفوفة الدماغ المجمدة من الفريزر وإدراج الدماغ، الجانب القشرة حتى، في المصفوفة. السماح للأنسجة لتكواسير إلى درجة الحرارة في منطقة الجزاء لمدة 10 دقائق.إبقاء الغطاء مفتوحاً خلال هذا الوقت. استخدام ملقط الباردة لضبط موقف الدماغ في المصفوفة بحيث جيب القوس والجيوب الأنفية العرضية خط يصل مع الأخادل عمودي من الكتلة. بمجرد أن يكون الدماغ في موضعه، ضع شفرة حلاقة مبردة بالقرب من مركزه واضغط عليه حوالي ملليمتر واحد في الأنسجة.بعد ذلك، ضع شفرة مبردة واحدة في كل نهاية من الدماغ واضغط على طول الطريق إلى أسفل إلى المصفوفة. ثم ابدأ في إضافة شفرات مبردة في النهاية الرسترالية ، ووضعها في فتحات واحدة في وقت واحد والضغط عليها بلطف ملليمتر واحد في الأنسجة. استمر في إضافة شفرات على فترات ملليمتر واحد، والعمل باتجاه نهاية الضم.عندما تكون جميع الشفرات في مكانها، اضغط لأسفل على أعلى مع الأصابع، والنخيل، أو كائن حاد وروك لهم ببطء من جانب إلى آخر لنقلها من خلال الأنسجة. بمجرد أن وصلت الشفرات إلى الجزء السفلي من الفتحات ، فهم كل جانب من مجموعة الشفرات وتحريرها من المصفوفة عن طريق هزاز ذهابا وإيابا. بعد تحرير مجموعة من ريش وضعها الجانب التاجي حتى على لوحة الزجاج، ووضع الجليد الجاف بجانب أو على رأس المكدس لتجميد مزيد من العينات لفصل أسهل.ثم ضع المكدس مع حواف حادة لأسفل وقم بفصل الشفرات عن طريق تحويل المكدس بين الإبهام والأصابع. صف القسم على اللوحات الزجاجية من الستراتل إلى السد وفصل الأنسجة عن الشفرات عن طريق ثنيها بين الأصابع ، أو عن طريق فصلها بشفرة مبردة ثانية. في بعض الأحيان، قد تلتصق الأنسجة على جانبي الشفرة ويجب توخي الحذر للحفاظ على الاتجاه التاجي إلى السد.قبل البدء في تشريح، فتح أطلس الدماغ الماوس ألن أو مرجع آخر والعثور على المعالم اللازمة لتحديد المناطق ذات الأهمية. استخدام ملقط أو شفرات مبردة لقلب القسم. وتأكد من أن المنطقة ذات الاهتمام متسقة في جميع أنحاء القسم.مقطعة إلى القسم مع مشرط نظيفة أو لكمة، ودفع المعدن بلطف ولكن بحزم في الأنسجة. هزاز عليه ذهابا وإيابا لجعل خفض. بعد حصاد المنطقة ذات الاهتمام، ضعها في أنابيب 1.5 ملليمتر مُبرَّدة مسبقًا ومُرّدة مسبقًا، ثم قم بتخزينها عند درجة حرارة 80 درجة مئوية.لمعالجة الأنسجة، إضافة الباردة RIPA العازلة لاستخراج البروتين أو guanidinium تحتوي على مذيب لاستخراج الحمض النووي الريبي وعلى الفور التجانس مع انخفاض الزجاج أو التجانس الميكانيكية. للتحقق من صحة هذه الطريقة، تم جمع قشرة الفص الجبهي من الفئران الذكور من النوع البري البالغ CD-1، وتم توصيف الحمض النووي الريبي والبروتين. عندما تحليلها مع الكهرباء الشعرية، يظهر الحمض النووي الريبي المتدهورة فقدان في شدة 28S و 18S عصابات الريبوسوم، فضلا عن مسحة بين 25 و 200 نيوكليوتيدات.بينما يظهر الحمض النووي الريبي عالي الجودة نطاقات الريبوسومية المتميزة إشارة قليلة أو معدومة في منطقة الوزن الجزيئي السفلي. تم مقارنة الحصول على الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة التشريح المجمدة مع الحمض النووي الريبي المعدة من الأنسجة الطازجة. كلا طريقتين إنتاج الجيش الملكي النيبالي مع أعداد عالية من النزاهة و النطاقات الريبوسومية قوية.للتأكد من أن هذه الطريقة يمكن استخدامها للحفاظ على البيئة الدقيقة للأنسجة تشريح لتحليلها في وقت لاحق، تم استخراج الحمض النووي الريبي من قشرة الفص الجبهي المُنَحَث الذي تم تخزينه على مدى عدة أسابيع. أنتجت جميع العينات RNA عالية الجودة مع نطاقات ريبوزومية متميزة وأرقام سلامة الحمض النووي الريبي فوق ثمانية. لتأكيد سلامة البروتين من العينات تشريح المجمدة، تم جمع البروتين، ونقلها إلى نيتروسيلولوز والتحقيق مع الأجسام المضادة ضد الهدف الوزن الجزيئي العالي KCC2، وانخفاض الوزن الجزيئي البروتين actin.وفي جميع الحالات كانت النطاقات حادة ومتميزة دون منتجات انهيار ملحوظة. من المهم الحفاظ على الأنسجة المجمدة طوال العملية لأن هذا يحافظ على البيئة الدقيقة للأقسام والحفاظ على مورفولوجيا القسم للمقارنة مع صور أطلس الدماغ. ويمكن تخزين المناطق ذات الاهتمام التي يتم جمعها بهذه الطريقة لعدة أشهر في درجة مئوية سالبة 80 ويمكن استخدامها في العديد من التطبيقات المصب، بما في ذلك RT-qPCR، RNA-SEQ، وتحليل البقع الغربية، و HPLC.وقد استخدمت هذه الطريقة لاستكشاف التغيرات الجزيئية داخل النظم الحوفية من القوارض في الفترة المحيطة بالولادة المعرضة لTHC وغيرها من القنب لفهم أفضل كيف يمكن لهذه الأدوية أن تؤثر على نمو الدماغ.

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

الرنين المغناطيسي الوظيفي في وقت واحد والكهربية في الدماغ القوارض

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

DiOLISTIC وصفها من الخلايا العصبية من القوارض والإنسان غير شرائح الدماغ الرئيسيات

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

غير النهج ليزر مجهرية لالتقاط Microdissection المتقطعة من مناطق الدماغ فأرة للعزل الحمض النووي الريبي توتال والتكرير والتسويق الجيل التالي من التسلسل الجيني التنميط والتعبير

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

المورفومترية التحليلات من أقسام الشبكية

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

تزايد الخلايا الجذعية العصبية من المناطق التقليدية وغير التقليدية من الدماغ الكبار القوارض

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

عالية الدقة الكمية متشابك بروتيوم من التنميط ماوس مناطق الدماغ بعد السمعية التمييز التعلم

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to deliver gene or cell therapy products. Unfortunately, current microinjection techniques use steel or glass needles that are suboptimal for multiple reasons: in particular, steel needles may cause tissue damage, and glass needles may bend when lowered deeply into the brain, missing the target region. In this article, we describe a protocol to prepare and use quartz needles that combine a number of useful features. These needles do not produce detectable tissue damage and, being very rigid, ensure reliable delivery in the desired brain region even when using deep coordinates. Moreover, it is possible to personalize the design of the needle by making multiple holes of the desired diameter. Multiple holes facilitate the injection of large amounts of solution within a larger area, whereas large holes facilitate the injection of cells. In addition, these quartz needles can be cleaned and re-used, such that the procedure becomes cost-effective.

We describe here a protocol for microinjection in the rodent brain that uses quartz needles. These needles do not produce detectable tissue damage and ensure reliable delivery even in deep regions. Moreover, they can be adapted to research needs by personalized designs and can be re-used.

الإبر مخصصة لميكروينجيكشنز في الدماغ القوارض

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

ميكروديسيكشن التقاط المناظير باستخدام الأشعة الليزر الموجهة بأطلس الدماغ المناطق المتأثرة بالإصابات الرضية

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

تقييم كثافة المشبك في الدماغ القوارض هيبوكامبال شرائح

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...