Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH, DA043982 og DA046196.

Dyr, der anvendes i denne undersøgelse blev behandlet på en etisk og human måde som fastsat af Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og National Institutes of Health (NIH) retningslinjer.
BEMÆRK: Alle værktøjer og overflader skal vaskes med et passende opløsningsmiddel til at fjerne nuklatermer18, før arbejdet påbegyndes.
1. Opbevaring af hjerner
<ol><li>Fjern hurtigt hjernen fra euthaniserede vok...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Dette arbejde beskriver en teknik til at isolere små, specifikke områder af hjernen og samtidig begrænse nedbrydningen af nukleinsyre og protein. Skader på hjernevæv sker hurtigt, når en organisme dør. Dette skyldes til dels en hurtig ophobning af ekstracellulær glutamat og den deraf følgende excitotoxicity, der opstår21. Messenger RNA er særligt sårbart over for nedbrydning22,23. Nedbrydning af protein og nukleinsyre er stærk...

Dette arbejde illustrerer dissektion af frosne hjerne regioner til udvinding af høj kvalitet nukleinsyre eller protein ved hjælp af en reference, såsom Allen Mouse Brain Atlas1, som en guide. I denne teknik, hjerner er flash-frosset og opbevares ved -80 °C til senere skæring og dissektion, mens de opretholdes i en frossen tilstand. Denne proces gør det muligt for forskeren at høste et stort antal hjerner i en session og senere dissekere dem for en nøjagtig samling af flere hjerneregioner.
Den nøjagtige indsamling af hjerneregioner af interesse (ROI'er) er ofte påkrævet, når der besvares spørgsmål relateret til gen- og proteinekspression. Mens farmakologi, elektrofysiologi og optogenetik kan bruges på vilde type eller genetisk modificerede gnavere til at hjælpe med at belyse molekylære ændringer understøtter observeret adfærd2,,3,,4, måling af inducerede ændringer i transkriptioner og proteomes bruges ofte til at støtte disse resultater. Teknikker såsom kvantitativ omvendt transskription polymerase kædereaktion (RT-qPCR), vestlige blotting, RNAseq5, MAPSeq6 og HPLC7 er robuste og relativt lave i omkostninger, så mange laboratorier til at studere inducerede molekylære ændringer inden for små hjerne regioner2,4,5,6.
Der er flere måder at udtrække og rense nukleinsyre eller protein fra hjerneregioner8,9,10,11,12. Mange laboratorier høst er hjerneregioner ved at køle hjerner på is på tidspunktet for høsten9,,13. Mens denne tilgang kan resultere i høj kvalitet nukleinsyre og protein, det er noget tidsbegrænset som nedbrydning inden for mikromiljøet af vævet kan finde sted ved disse temperaturer. Dette kan især være tilfældet, når man forsøger at dissekere et stort antal dyr eller roi'er på ét møde. Holde prøver frosne hjælper med at opretholde labile mål molekyler og samtidig give forskeren tid til omhyggeligt at sammenligne landemærker på begge sider af hver sektion i bestræbelserne på at indsamle relativt rene prøver. Laser capture er en anden måde at indsamle væv til RNA eller protein analyse fra hjernen områder10. Denne procedure er bedre end mekanisk dissektion i, at meget små og uregelmæssigt formede ROI'er kan identificeres og isoleres. Laseropsamling er dog begrænset ved brug af dyrt udstyr og reagenser, er tidskrævende og kan også være mere modtagelig for prøvenedbrydning.
Micropunch dissektion på frosset væv er ikke nyt. Tidlige papirer af Miklos Palkovits og andre beskriver de grundlæggende teknikker i detaljer14,15. Denne præsentation følger i vid udstrækning det oprindelige arbejde, med nogle forbedringer for at lette effektiviteten og mindske bekostning af det nødvendige udstyr. For eksempel er hjerne sektioner lavet i en frossen hjerneblok snarere end på en kryoat. Dette giver tykkere sektioner, hvilket reducerer antallet af sektioner, der er nødvendige for at indsamle ROI-prøver. Denne metode dissekerer også prøver på en frossen glasplade, der sidder på tøris i en isoleret kasse. Dette giver en sub-frysning fase på bænken, som at arbejde. Sektioner dissekeret på denne måde er let manipuleres, så forskeren til at sammenligne begge sider af hvert afsnit med en henvisning for at begrænse forurening fra regioner uden for den ønskede ROI.
Fordele ved denne protokol er, at 1) hjernen holdes i en frossen tilstand i hele processen, som hjælper med at bevare protein og nukleinsyre og giver forskeren tid til omhyggeligt at høste ROI'er, og 2) de nødvendige reagenser er billige og findes i de fleste molekylærbiologiske laboratorier. I denne proces er hele hjerner opdelt til 0,5-1,0 mm i en hjernematrix og placeres på en frossen glasplade, der løbende køles med tøris. Vartegn fundet i Allen Brain Atlas1 eller andre hjerne atlasser16,17 bruges til at identificere regioner af interesse, som derefter dissekeres ved hjælp af enten en kold punch eller skalpel. Fordi vævet aldrig er optøet, regioner høstet på denne måde giver høj kvalitet RNA og protein til downstream analyser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Som vores forståelse af neurobiologi har udviklet sig, molekylære analyser udføres ofte på små hjerneområder såsom den mediale præfrontale cortex (mPFC) eller kerne accumbens. Udfordringen i dette arbejde er at dissekere det korrekte område og samtidig bevare det mikromiljø, der skal undersøges. I dette papir beskriver vi en enkel, billig metode ved hjælp af ressourcer, der er let tilgængelige i de fleste laboratorier. Denne metode bevarer nukleinsyre og proteiner ved at holde vævet frosset gennem hele processen. Hjerner skæres i 0,5-1,0 mm sektioner ved hjælp af en hjernematrix og arrangeres på en frossen glasplade. Landemærker inden for hvert afsnit sammenlignes med en reference, såsom Allen Mouse Brain Atlas, og regioner dissekeres ved hjælp af en kold skalpel eller biopsi punch. Væv opbevares derefter ved -80 °C indtil brug. Gennem denne proces rotte og mus mPFC, kerne accumbens, dorsale og ventrale hippocampus og andre regioner er blevet analyseret med succes ved hjælp af qRT-PCR og vestlige analyser. Denne metode er begrænset til hjerneregioner, der kan identificeres ved klare landemærker.

For at validere denne metode, den mediale præfrontale cortex blev indsamlet fra voksne CD1 wildtype mandlige mus og RNA og protein blev udvundet og karakteriseret. RNA blev analyseret ved kapillær elektroforese. Forringet RNA viser et tab i intensiteten af 28S og 18S ribosomal bands og viser også nedbrydningsprodukter som en smear mellem 25 og 200 nukleotider (Figur 5A, prøve 1). Rna af høj kvalitet viser forskellige ribosombånd med lidt eller intet signal i det lavere molekylvægtomr?...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Denne procedure beskriver indsamling af diskrete frosne hjerneregioner for at opnå protein og RNA af høj kvalitet ved hjælp af billige og almindeligt tilgængelige værktøjer.

Indsamling af frosne gnaver brain regioner for downstream analyser

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Denne procedure beskriver indsamlingen af diskrete frosne hjerneregioner for at opnå protein og RNA af høj kvalitet ved hjælp af billige og almindeligt tilgængelige værktøjer. Fordi hjernen regioner holdes frosset fra høst gennem dissektion, målmolekyler bevares, og forskeren har tid til omhyggeligt dissekere og gemme regioner af interesse. Det kan i første omgang være en udfordring at identificere interesseregioner.Ved hjælp af fælles hjerne landemærker, som de opstår og trække sig tilbage gennem sektioner i forhold til de ønskede regioner vil gøre identifikation klar. Efter fjernelse af hjerner fra aflivede voksne CD-1 vilde type mus, flash fryse vævet i 60 sekunder i enten flydende nitrogen eller isopentane. Pre-chill med tøris og gemme det på minus 80 grader Celsius.24 timer før dissekere vævet, placere en ren hjerne matrix på en stak optøede fryser pakker. Og sandwich siderne til matrix mellem to frysepakker og sørg for at forlade cirka en halv centimeter mellem bunden af razor slots og toppen af pakkerne. Opsæt en frossen glasplade til dissektionen ved at fylde en isoleret kasse med is op til ca. fem centimeter fra toppen.Derefter placere en 2,5 centimeter lag tøris på toppen. Og dække det med sort plastfolie. Anvend en glasplade oven på plasten.Og tøris omkring pladens grænser. Fjern den frosne hjerne matrix fra fryseren og indsætte hjernen, cortex side op, i matrix. Lad vævet komme i ækvivalens med temperaturen i kassen i 10 minutter.Hold låget åbent i dette tidsrum. Brug kolde kraftvipper til at justere hjernens position i matrixen, så sagittal sinus og tværgående sinus linje op med de vinkelrette riller af blokken. Når hjernen er på plads, skal du placere et kølet barberblad i nærheden af dens centrum og trykke det cirka en millimeter ind i vævet.Dernæst placere en kølet klinge i hver ende af hjernen og tryk hele vejen ned i matrixen. Begynd derefter at tilføje kølede knive i rostralenden, placere dem i rillerne en ad gangen og forsigtigt trykke dem en millimeter ind i vævet. Fortsæt med at tilføje knive med en millimeter mellemrum, arbejder mod caudal ende.Når alle knive er på plads, skal du trykke ned på toppen med fingre, håndflade eller en stump genstand og sten dem langsomt fra side til side for at flytte dem gennem vævet. Når knivene har nået bunden af rillerne, skal du gribe fat i hver side af gruppen af vinger og befri dem fra matrixen ved at rokke frem og tilbage. Efter at have befriet gruppen af knive placere dem rostral side op på glaspladen, og sætte tøris ved siden af eller på toppen af stakken for yderligere at fryse prøverne for lettere adskillelse.Placer derefter stakken med skarpe kanter ned og adskaf knivene ved at flytte stakken mellem tommel og fingre. Line up sektionen på glaspladerne fra rostral til hale og adskille vævet fra knivene ved at bøje dem mellem fingrene, eller ved at adskille dem med en anden kølet klinge. Til tider kan væv holde sig til begge sider af en klinge og skal være forsigtige med at opretholde rostral til caudal orientering.Før du starter dissektionen, skal du åbne Allen Mouse Brain Atlas eller en anden reference og finde de landemærker, der er nødvendige for at identificere interesseområder. Brug kølet kraft og klinger til at vende afsnittet. Og sørg for, at området af interesse er konsekvent i hele afsnittet.Skær ind i afsnittet med en ren skalpel eller en punch, skubbe metal forsigtigt, men fast i vævet. Rokkende den frem og tilbage for at lave snittet. Efter høst regionen af interesse, placere den i mærket pre-kølet 1,5 millimeter rør og gemme dem på minus 80 grader Celsius.For at behandle vævet tilsættes kold RIPA-buffer til proteinekstraktion eller et guanidinium, der indeholder opløsningsmiddel til RNA-ekstraktion, og det homogeniseres straks med en glasnedsættelse eller mekanisk homogenisator. For at validere denne metode, den mediale præfrontale cortex blev indsamlet fra voksne CD-1 vilde type mandlige mus, og RNA og protein blev karakteriseret. Når det analyseres med kapillær elektroforese, har forringet RNA et tab i intensiteten af 28S og 18S ribosomale bånd samt en udtværing mellem 25 og 200 nukleotider.Mens høj kvalitet RNA viser forskellige ribosomal bånd lidt at intet signal i den lavere molekylvægt region. RNA-rnaet ved hjælp af den frosne dissektionsmetode blev sammenlignet med RNA fremstillet af friskhøstet væv. Begge metoder producerer RNA med høje integritetstal og stærk ribosomal banding.For at bekræfte, at denne metode kan bruges til at bevare mikromiljø af dissekeret væv til senere analyse, RNA blev udvundet fra dissekeret mediale præfrontale cortex, der var blevet opbevaret over flere uger. Alle prøver producerede RNA af høj kvalitet med forskellige ribosommale bånd og RNA-integritetsnumre over otte. For at bekræfte proteinintegriteten af de frosne dissekerede prøver blev proteinet indsamlet, overført til nitrocellulose og sonde med antistof mod det høje molekylvægtmål KCC2 og den lavere molekylvægtprotein actin.I alle tilfælde var båndene skarpe og forskellige uden mærkbare nedbrydningsprodukter. Det er vigtigt at holde væv frosset gennem hele processen, da dette bevarer mikromiljø af sektionerne og vedligeholde sektion morfologi til sammenligning med hjernen atlas billeder. Regioner af interesse indsamlet på denne måde kan opbevares i flere måneder på negative 80 grader Celsius og kan udnyttes i mange downstream applikationer, herunder RT-qPCR, RNA-Seq, Western blot analyse, og HPLC.Denne metode er blevet brugt til at udforske molekylære ændringer i de limbiske systemer af perinatale gnavere udsat for THC og andre cannabinoider til bedre at forstå, hvordan disse stoffer kan påvirke hjernens udvikling.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Ikke-Laser Capture Mikroskopi Tilgang til mikrodissektion af diskrete Mouse Brain Regioner for Total RNA Isolation og downstream næste generation sekventering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriske Analyser af Retina Sektioner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Voksende neurale stamceller fra konventionelle og ikke-konventionelle regioner Adult gnaverhjerne

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering af Rodent centralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

High Resolution Kvantitativ Synaptic Proteome profilering Mouse Brain Regioner Efter Auditiv diskrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Personlig nåle til Microinjections i gnavere hjernen

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluering af Synapse tæthed i hippocampus gnaver hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...