Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het NIH, DA043982 en DA046196.

Dieren gebruikt in deze studie werden behandeld in een ethische en humane manier zoals uiteengezet door Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en National Institutes of Health (NIH) richtlijnen.
LET OP: Alle gereedschappen en oppervlakken moeten worden gewassen met een geschikt oplosmiddel om nucleases18 te verwijderen voordat u met het werk begint.
1. Hersenen opslaan
<ol><li>Verwijder snel de hersenen van...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Dit werk beschrijft een techniek om kleine, specifieke gebieden van de hersenen te isoleren en tegelijkertijd de afbraak van nucleïnezuur en eiwit te beperken. Schade aan hersenweefsels gebeurt snel zodra een organisme sterft. Dit is gedeeltelijk te wijten aan een snelle opbouw van extracellulaire glutamaat en de daaruit voortvloeiende excitotoxiciteit die optreedt21. Messenger RNA is bijzonder kwetsbaar voor degradatie22,23. Afbraak van ...

Dit werk illustreert de dissectie van bevroren hersengebieden voor de extractie van hoogwaardig nucleïnezuur of eiwit met behulp van een referentie, zoals de Allen Mouse Brain Atlas1, als een gids. In deze techniek worden hersenen flash-bevroren en opgeslagen bij -80 °C voor latere sectie en ontleding terwijl ze in een bevroren toestand worden gehouden. Dit proces stelt de onderzoeker in staat om een groot aantal hersenen in één sessie te oogsten en ze later te ontleden voor een nauwkeurige verzameling van meerdere hersengebieden.
De nauwkeurige verzameling van hersengebieden van belang (ROI's) is vaak nodig bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot gen- en eiwitexpressie. Terwijl farmacologie, elektrofysiologie en optogenetica kunnen worden gebruikt op wildtype of genetisch gemodificeerde knaagdieren om te helpen verduidelijken moleculaire veranderingen die ondersteunen waargenomen gedrag2,3,4, de meting van geïnduceerde veranderingen in transcriptomen en proteomen wordt vaak gebruikt om deze bevindingen te ondersteunen. Technieken zoals kwantitatieve omgekeerde transcriptie polymerase kettingreactie (RT-qPCR), westelijke blotting, RNAseq5,MAPSeq6 en HPLC7 zijn robuust en relatief laag in kosten, waardoor veel laboratoria om geïnduceerde moleculaire veranderingen te bestuderen binnen kleine hersengebieden2,4,5,6.
Er zijn verschillende manieren om nucleïnezuur of eiwit uit hersengebieden8,9,10,11,12te extraheren en te zuiveren. Veel laboratoria oogsten hersengebieden door het koelen en snijden van hersenen op ijs op het moment van oogst9,13. Hoewel deze aanpak kan resulteren in hoge kwaliteit nucleïnezuur en eiwit, is het enigszins tijd-beperkt als afbraak binnen de micro-omgeving van het weefsel kan plaatsvinden bij deze temperaturen. Dit kan met name het geval zijn bij een poging om een groot aantal dieren of ROI's in één vergadering te ontleden. Het houden van monsters bevroren helpt handhaven van bieldoelmoleculen, terwijl de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te vergelijken oriëntatiepunten aan beide zijden van elke sectie in de poging om relatief zuivere monsters te verzamelen. Laser capture is een andere manier om weefsel te verzamelen voor RNA of eiwitanalyse uit hersengebieden10. Deze procedure is superieur aan mechanische dissectie in die zin dat zeer kleine en onregelmatig gevormde ROI's kunnen worden geïdentificeerd en geïsoleerd. Echter, laser capture wordt beperkt door het gebruik van dure apparatuur en reagentia, is tijdrovend en kan ook meer vatbaar zijn voor afbraak van monsters.
Micropunch dissectie op bevroren weefsels is niet nieuw. Vroege papers van Miklos Palkovits en anderen beschrijven de basistechnieken in detail14,15. Deze presentatie volgt grotendeels het oorspronkelijke werk, met enkele verbeteringen om de efficiëntie te vergemakkelijken en de kosten van de benodigde apparatuur te verlagen. Bijvoorbeeld, hersensecties worden gemaakt in een bevroren hersenblok in plaats van op een cryostat. Dit produceert dikkere secties die het aantal secties die nodig zijn om ROI monsters te verzamelen vermindert. Deze methode ontleedt ook monsters op een bevroren glasplaat die op droogijs in een geïsoleerde doos zit. Dit levert een subvriesfase op de bank waarop u moet werken. Secties die op deze manier worden ontleed zijn gemakkelijk te manipuleren, waardoor de onderzoeker beide zijden van elke sectie kan vergelijken met een verwijzing om besmetting van regio's buiten de gewenste ROI te beperken.
Voordelen van dit protocol zijn dat 1) de hersenen wordt gehouden in een bevroren toestand gedurende het hele proces, die helpt bij het behoud van eiwitten en nucleïnezuur en geeft de onderzoeker de tijd om zorgvuldig te oogsten ROI's, en 2) de benodigde reagentia zijn goedkoop en worden gevonden in de meeste moleculaire biologie labs. In dit proces worden hele hersenen in een hersenmatrix tot 0,5-1,0 mm doorsneden en op een bevroren glasplaat geplaatst die continu wordt gekoeld met droogijs. Oriëntatiepunten gevonden in de Allen Brain Atlas1 of andere hersenen atlassen16,17 worden gebruikt om gebieden van belang te identificeren, die vervolgens worden ontleed met behulp van een koude punch of scalpel. Omdat het weefsel nooit ontdooid is, leveren regio's die op deze manier worden geoogst hoogwaardige RNA en eiwit voor downstream analyses.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Naarmate ons begrip van de neurobiologie is gevorderd, worden moleculaire analyses vaak uitgevoerd op kleine hersengebieden zoals de mediale prefrontale cortex (mPFC) of nucleus accumbens. De uitdaging in dit werk is om het juiste gebied te ontleden met behoud van de te onderzoeken microomgeving. In dit artikel beschrijven we een eenvoudige, goedkope methode met behulp van middelen die direct beschikbaar zijn in de meeste laboratoria. Deze methode behoudt nucleïnezuur en eiwitten door het weefsel bevroren te houden gedurende het hele proces. Hersenen worden gesneden in 0,5-1,0 mm secties met behulp van een hersenmatrix en gerangschikt op een bevroren glasplaat. Oriëntatiepunten binnen elke sectie worden vergeleken met een verwijzing, zoals de Allen Mouse Brain Atlas, en regio's worden ontleed met behulp van een koude scalpel of biopsie punch. Weefsel wordt vervolgens opgeslagen bij -80 °C tot gebruik. Door dit proces zijn rat en muis mPFC, nucleus accumbens, dorsale en ventrale hippocampus en andere regio's met succes geanalyseerd met behulp van qRT-PCR en westerse testen. Deze methode is beperkt tot hersengebieden die kunnen worden geïdentificeerd door duidelijke oriëntatiepunten.

Om deze methode te valideren, werd de mediale prefrontale cortex verzameld uit volwassen CD1 wildtype mannelijke muizen en RNA en eiwit werden geëxtraheerd en gekarakteriseerd. RNA werd geanalyseerd door capillaire elektroforese. Gedegradeerd RNA geeft een verlies in de intensiteit van de 28S en 18S ribosomal bands en toont ook afbraakproducten als een uitstrijkje tussen 25 en 200 nucleotiden (Figuur 5A, monster 1). RNA van hoge kwaliteit toont verschillende ribosomale banden met weinig tot...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools.

Verzameling van bevroren knaagdierhersengebieden voor downstreamanalyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Deze procedure beschrijft de verzameling van discrete bevroren hersengebieden om hoogwaardige eiwitten en RNA te verkrijgen met behulp van goedkope en algemeen beschikbare tools. Omdat hersengebieden worden bevroren van de oogst door middel van dissectie, doelmoleculen worden bewaard en de onderzoeker heeft de tijd om zorgvuldig te ontleden en op te slaan regio's van belang. Het identificeren van regio's van belang kan in eerste instantie een uitdaging zijn.Met behulp van gemeenschappelijke hersenen oriëntatiepunten als ze ontstaan en wijken door de secties in relatie tot de gewenste regio's zal de identificatie duidelijk te maken. Na het verwijderen van hersenen van geëuthanaseerde volwassen CD-1 wild type muizen, flash bevriezen het weefsel voor 60 seconden in vloeibare stikstof of isopentane. Voorkoel met droogijs en bewaar het op min 80 graden Celsius.24 uur voor het ontleden van het weefsel, plaats een schone hersenmatrix op een stapel ontdooide vriezer verpakkingen. En sandwich de zijkanten van de matrix tussen twee vriezer verpakkingen ervoor te zorgen dat ongeveer een halve centimeter tussen de onderkant van de scheermes sleuven en de bovenkant van de verpakkingen te verlaten. Zet een bevroren glasplaat voor de dissectie door het vullen van een geïsoleerde doos met ijs tot ongeveer vijf centimeter van de top.Leg er dan een laagje droogijs van 2,5 centimeter op. En bedek het met zwarte plastic bekleding. Plaats een glasplaat op de top van het plastic.En droogijs rond de grenzen van de plaat. Verwijder de bevroren hersenmatrix uit de vriezer en steek de hersenen, cortex kant omhoog, in de matrix. Laat het weefsel gedurende 10 minuten in evenwicht zijn met de temperatuur in de doos.Houd het deksel open gedurende deze tijd. Gebruik koude tangen om de positie van de hersenen in de matrix aan te passen, zodat de sagittale sinus en dwarse sinus line-up met de loodrechte groeven van het blok. Zodra de hersenen in positie is, plaats een gekoeld scheermesje in de buurt van het centrum en druk het ongeveer een millimeter in het weefsel.Plaats vervolgens een gekoeld mes aan elk uiteinde van de hersenen en druk helemaal naar beneden in de matrix. Dan beginnen met het toevoegen van gekoelde messen aan het rostral einde, ze te plaatsen in de sleuven een voor een en zachtjes te drukken ze een millimeter in het weefsel. Blijf messen toevoegen met een millimeter intervallen, werken in de richting van de staart einde.Wanneer alle messen op hun plaats zijn, druk op de top met de vingers, palm, of een stomp voorwerp en rock ze langzaam van links naar rechts om ze te verplaatsen door het weefsel. Zodra de bladen de bodem van de sleuven hebben bereikt, grijpt u elke zijde van de groep messen en bevrijdt u ze van de matrix door heen en weer te wiegen. Na het bevrijden van de groep bladen plaats ze rostral kant op de glasplaat, en zet droogijs naast of op de top van de stapel om verder te bevriezen de monsters voor een gemakkelijkere scheiding.Plaats vervolgens de stapel met scherpe randen naar beneden en scheid de messen door het verschuiven van de stapel tussen de duim en vingers. Line-up van de sectie op de glazen platen van rostral tot caudal en scheiden het weefsel van de messen door ze te buigen tussen de vingers, of door ze te scheiden met een tweede gekoelde mes. Soms kan weefsel aan beide zijden van een mes kleven en moet ervoor worden gezorgd dat rostral naar caudale oriëntatie blijft.Voordat u met de dissectie begint, opent u de Allen Mouse Brain Atlas of een andere referentie en vindt u de oriëntatiepunten die nodig zijn om gebieden van belang te identificeren. Gebruik gekoelde tangen of messen om de sectie te spiegelen. En zorg ervoor dat de regio van belang consistent is in de hele sectie.Snijd in de sectie met een schone scalpel of een punch, duwen het metaal zachtjes maar stevig in het weefsel. Hij wiegt heen en weer om de snede te maken. Na het oogsten van de regio van belang, plaats het in gelabelde voorgekoelde 1,5 millimeter buizen en bewaar ze op min 80 graden Celsius.Om het weefsel te verwerken, voeg koude RIPA buffer voor eiwitextractie of een guanidinium met oplosmiddel voor RNA extractie en onmiddellijk homogeniseren met een glazen downs of mechanische homogenisator. Om deze methode te valideren, werd de mediale prefrontale cortex verzameld van volwassen CD-1 wilde type mannelijke muizen, en RNA en eiwit werden gekarakteriseerd. Wanneer geanalyseerd met capillaire elektroforese, gedegradeerd RNA toont een verlies in de intensiteit van de 28S en 18S ribosomale banden, evenals een uitstrijkje tussen 25 en 200 nucleotiden.Terwijl hoge kwaliteit RNA toont verschillende ribosomale banden weinig tot geen signaal in het lagere moleculaire gewicht regio. Het RNA verkrijgen met behulp van de bevroren dissectie methode werd vergeleken met RNA bereid uit vers geoogst weefsel. Beide methoden produceren RNA met hoge integriteitsaantallen en sterke ribosomale banding.Om te bevestigen dat deze methode kan worden gebruikt om de micro-omgeving van ontleed weefsel te behouden voor latere analyse, werd RNA geëxtraheerd uit ontleed mediale prefrontale cortex die gedurende enkele weken was opgeslagen. Alle monsters produceerden hoogwaardige RNA met verschillende ribosomale banding en RNA integriteitsnummers boven de acht. Om de eiwitintegriteit van de bevroren ontleedmonsters te bevestigen, werd het eiwit verzameld, overgebracht naar nitrocellulose en sonde met antilichaam tegen het doel KCC2 met een hoog moleculair gewicht en het eiwit actine met een lager moleculair gewicht.In alle gevallen waren de banden scherp en verschillend zonder waarneembare afbraakproducten. Het is belangrijk om de weefsels bevroren te houden gedurende het hele proces, omdat dit de micro-omgeving van de secties behoudt en sectiemorfologie behoudt voor vergelijking met hersenatlasbeelden. Regio's die op deze manier worden verzameld, kunnen gedurende enkele maanden worden opgeslagen bij een negatieve 80 graden Celsius en kunnen worden gebruikt in veel downstreamtoepassingen, waaronder RT-qPCR, RNA-Seq, Western blot-analyse en HPLC.Deze methode is gebruikt om moleculaire veranderingen binnen de limbische systemen van perinatale knaagdieren blootgesteld aan THC en andere cannabinoïden te verkennen om beter te begrijpen hoe deze geneesmiddelen de ontwikkeling van de hersenen kunnen beïnvloeden.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Gelijktijdig fMRI en elektrofysiologie bij knaagdieren Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Labeling van neuronen van de knaagdieren en niet-menselijke primaten Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Niet-Laser Capture Microscopie Aanpak voor de Microdissection van Discrete Mouse Brain Regio&#39;s voor Totaal RNA isolatie en Downstream next-generation sequencing en Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometrische analyses van het netvlies secties

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Groeiende neurale stamcellen uit Conventionele en Niet-conventionele Regio&#39;s van de Adult knaagdierhersenen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

High Resolution Kwantitatieve Synaptic Proteome Profilering van Mouse Brain Regio Na Auditieve discriminatie Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Gepersonaliseerde naalden voor Microinjections in de hersenen knaagdier

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluatie van SYNAPS dichtheid in Hippocampal knaagdier hersenen plakjes

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...