Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les NIH, DA043982 et DA046196.

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traités d’une manière éthique et humaine, comme l’ont indiqué le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Indiana et les lignes directrices des National Institutes of Health (NIH).
REMARQUE : Tous les outils et surfaces doivent être lavés avec un solvant approprié pour enlever les nucléases18 avant de commencer tout travail.
1. ...

<ol>
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J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Ces travaux décrivent une technique pour isoler de petites régions spécifiques du cerveau tout en limitant la dégradation de l’acide nucléique et des protéines. Les dommages aux tissus cérébraux se produisent rapidement une fois qu’un organisme meurt. Ceci est dû en partie à une accumulation rapide de glutamate extracellulaire et l’excitotoxicité résultante qui se produit21. L’ARN Messenger est particulièrement vulnérable à la dégradation22,</su...

Ce travail illustre la dissection des régions du cerveau congelées pour l’extraction de l’acide ou des protéines nucléiques de haute qualité à l’aide d’une référence, comme l’Allen Mouse Brain Atlas1, comme guide. Dans cette technique, les cerveaux sont surgelés et stockés à -80 oC pour la section et la dissection ultérieures tout en étant maintenus dans un état gelé. Ce processus permet au chercheur de récolter un grand nombre de cerveaux en une seule séance et de les disséquer plus tard pour une collecte précise de multiples régions du cerveau.
La collecte précise des régions d’intérêt du cerveau (ROIs) est souvent nécessaire lorsqu’il répond à des questions liées à l’expression des gènes et des protéines. Tandis que la pharmacologie, l’électrophysiologie et l’optogénétique peuvent être employées sur le type sauvage ou les rongeurs génétiquement modifiés pour aider à élucider les changements moléculaires qui sous-tendent les comportements observés2,,3,4,la mesure des changements induits dans les transcriptomes et les protéomes est souvent employée pour soutenir ces résultats., Des techniques telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (RT-qPCR), le ballonnement occidental, le RNAseq5, le MAPSeq6 et le HPLC7 sont robustes et relativement faibles en coût, ce qui permet à de nombreux laboratoires d’étudier les changements moléculaires induits dans les petites régions du cerveau2,,4,5,6.
Il existe plusieurs façons d’extraire et de purifier l’acide nuléique ou des protéines des régions du cerveau8,9,10,11,12. De nombreux laboratoires récoltent les régions du cerveau en refroidissant et en coupant les cerveaux sur la glace au moment de la récolte9,13. Bien que cette approche puisse entraîner de l’acide nucléique de haute qualité et des protéines, elle est quelque peu limitée dans le temps, car la dégradation dans le microenvironnement du tissu peut avoir lieu à ces températures. Cela peut être particulièrement vrai lorsque vous tentez de disséquer un grand nombre d’animaux ou d’IRM en une seule séance. Garder les échantillons congelés aide à maintenir les molécules cibles labiles tout en donnant au chercheur le temps de comparer soigneusement les repères des deux côtés de chaque section dans l’effort de recueillir des échantillons relativement purs. La capture au laser est une autre façon de recueillir des tissus pour l’analyse de l’ARN ou des protéines dans les zones cérébrales10. Cette procédure est supérieure à la dissection mécanique dans ce ROIs de forme très petite et irrégulièrement peut être identifiée et isolée. Cependant, la capture au laser est limitée par l’utilisation d’équipements et de réactifs coûteux, prend beaucoup de temps et peut également être plus sensible à la dégradation de l’échantillon.
La dissection de micropunch sur les tissus congelés n’est pas nouvelle. Les premiers papiers de Miklos Palkovits et d’autres décrivent les techniques de base en détail14,15. Cette présentation suit en grande partie le travail initial, avec quelques améliorations pour faciliter l’efficacité et réduire les dépenses de l’équipement nécessaire. Par exemple, les sections cérébrales sont faites dans un bloc cérébral gelé plutôt que sur un cryostat. Cela produit des sections plus épaisses qui réduisent le nombre de sections nécessaires pour recueillir des échantillons de retour sur investissement. Cette méthode disséque également des échantillons sur une plaque de verre congelée qui repose sur de la glace sèche dans une boîte isolée. Cela produit une étape de sous-gel au banc sur lequel travailler. Les sections disséquées de cette façon sont facilement manipulatibles, ce qui permet au chercheur de comparer les deux côtés de chaque section avec une référence afin de limiter la contamination des régions en dehors du retour sur investissement souhaité.
Les avantages de ce protocole sont que 1) le cerveau est maintenu dans un état gelé tout au long du processus, qui aide à préserver les protéines et l’acide nucléique et donne au chercheur le temps de récolter soigneusement les IA, et 2) les réactifs requis sont peu coûteux et se trouvent dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. Dans ce processus, les cerveaux entiers sont sectionnés à 0,5-1,0 mm dans une matrice de cerveau et placés sur une plaque de verre congelée qui est continuellement refroidie avec de la glace sèche. Les repères trouvés dans l’Atlas du cerveau Allen1 ou d’autres atlas cérébraux16,17 sont utilisés pour identifier les régions d’intérêt, qui sont ensuite disséquées à l’aide d’un poinçon froid ou d’un scalpel. Parce que le tissu n’est jamais décongelé, les régions récoltées de cette manière fournissent l’ARN et les protéines de haute qualité pour les analyses en aval.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Au fur et à mesure que notre compréhension de la neurobiologie a progressé, des analyses moléculaires sont souvent effectuées sur de petites zones cérébrales telles que le cortex préfrontal médial (MPFC) ou le noyau accumbens. Le défi dans ce travail est de disséquer la zone correcte tout en préservant le microenvironnement à examiner. Dans cet article, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse utilisant des ressources facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Cette méthode préserve l’acide nucléique et les protéines en gardant le tissu congelé tout au long du processus. Les cerveaux sont coupés en sections de 0,5 à 1,0 mm à l’aide d’une matrice cérébrale et disposés sur une plaque de verre congelée. Les repères de chaque section sont comparés à une référence, comme l’Atlas du cerveau Allen Mouse, et les régions sont disséquées à l’aide d’un scalpel froid ou d’un poinçon de biopsie. Le tissu est ensuite stocké à -80 oC jusqu’à l’utilisation. Grâce à ce processus rat et souris mPFC, noyau accumbens, hippocampe dorsale et ventral et d’autres régions ont été analysés avec succès à l’aide de qRT-PCR et d’essais occidentaux. Cette méthode est limitée aux régions du cerveau qui peuvent être identifiées par des repères clairs.

Afin de valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles CD1 adultes et l’ARN et la protéine ont été extraits et caractérisés. L’ARN a été analysé par électrophoresis capillaire. L’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomal 28S et 18S et montre également des produits de dégradation comme un frottis entre 25 et 200 nucléotides(figure 5A, échantillon 1). L’ARN de haute qualité montre des bande...

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Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.

Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Cette procédure décrit la collection de régions discrètes du cerveau congelé pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles. Étant donné que les régions du cerveau sont empêchées de récolter par dissection, les molécules cibles sont préservées et le chercheur a le temps de disséquer et de stocker soigneusement les régions d’intérêt. Il peut d’abord être difficile d’identifier les régions d’intérêt.L’utilisation de repères cérébraux communs au fur et à mesure qu’ils émergent et reculent à travers les sections par rapport aux régions désirées permettra d’identifier clairement. Après avoir enlevé le cerveau des souris adultes euthanasiées de type CD-1, congelez le tissu pendant 60 secondes dans de l’azote liquide ou de l’isopentane. Pré-réfrigérer avec de la glace sèche et la conserver à moins 80 degrés Celsius.24 heures avant de disséquer le tissu, placez une matrice cérébrale propre sur une pile de paquets de congélateur décongelés. Et sandwich les côtés de la matrice entre deux paquets de congélateur en s’assurant de laisser environ un demi-centimètre entre le fond des fentes de rasoir et le haut des paquets. Installez une plaque de verre congelée pour la dissection en remplissant une boîte isolée de glace jusqu’à environ cinq centimètres du haut.Placez ensuite une couche de glace sèche de 2,5 centimètres sur le dessus. Et couvrez-le de bâches en plastique noir. Placer une plaque de verre sur le dessus du plastique.Et de la glace sèche autour des bordures de la plaque. Retirez la matrice cérébrale gelée du congélateur et insérez le cerveau, côté cortex vers le haut, dans la matrice. Laisser le tissu équilibrer à la température dans la boîte pendant 10 minutes.Garder le couvercle ouvert pendant ce temps. Utilisez des forceps froids pour ajuster la position du cerveau dans la matrice de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc. Une fois que le cerveau est en position, placez une lame de rasoir réfrigérée près de son centre et pressez-la d’environ un millimètre dans le tissu.Ensuite, placez une lame réfrigérée à chaque extrémité du cerveau et appuyez jusqu’à la matrice. Commencez ensuite à ajouter des lames réfrigérées à l’extrémité rostrale, en les plaçant dans les fentes une à la fois et en les appuyant doucement un millimètre dans le tissu. Continuer à ajouter des lames à intervalles d’un millimètre, en travaillant vers l’extrémité caudale.Lorsque toutes les lames sont en place, appuyez sur le dessus avec les doigts, la paume ou un objet contondant et secouez-les lentement d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers le tissu. Une fois que les lames ont atteint le bas des fentes, saisir chaque côté du groupe de lames et les libérer de la matrice en se berçant dans les deux sens. Après avoir libéré le groupe de lames placez-les côté rostral vers le haut sur la plaque de verre, et mettez la glace sèche à côté ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons pour faciliter la séparation.Ensuite, placez la pile avec des bords tranchants vers le bas et séparez les lames en déplaçant la pile entre le pouce et les doigts. Alignez la section sur les plaques de verre de rostral à caudale et séparez le tissu des lames en les fléchissant entre les doigts, ou en les séparant d’une deuxième lame réfrigérée. Parfois, le tissu peut coller des deux côtés d’une lame et le soin doit être pris pour maintenir l’orientation rostrale à caudale.Avant de commencer la dissection, ouvrez l’Atlas du cerveau de la souris Allen ou une autre référence et trouvez les repères nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Utilisez des forceps ou des lames réfrigérés pour retourner la section. Et assurez-vous que la région d’intérêt est cohérente dans toute la section.Couper dans la section avec un scalpel propre ou un poinçon, poussant le métal doucement mais fermement dans le tissu. Le balancer d’avant en arrière pour faire la coupe. Après avoir récolté la région d’intérêt, placez-la dans des tubes pré-réfrigérés de 1,5 millimètre étiquetés et rangez-les à moins 80 degrés Celsius.Pour traiter le tissu, ajoutez un tampon RIPA froid pour l’extraction des protéines ou un guanidinium contenant du solvant pour l’extraction de l’ARN et homogénéisez-le immédiatement avec un dus au verre ou un homogénéisateur mécanique. Pour valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles adultes de type SAUVAGE CD-1, et l’ARN et les protéines ont été caractérisés. Lorsqu’il est analysé avec l’électrophoresis capillaire, l’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomales 28S et 18S, aussi bien qu’un frottis entre 25 et 200 nucléotides.Tandis que l’ARN de haute qualité montre les bandes ribosomales distinctes peu ou pas de signal dans la région inférieure de poids moléculaire. L’ARN obtenu à l’aide de la méthode de dissection congelée a été comparé à l’ARN préparé à partir de tissus fraîchement récoltés. Les deux méthodes produisent de l’ARN avec un nombre élevé d’intégrité et un baguage ribosomal fort.Pour confirmer que cette méthode peut être employée pour préserver le microenvironnement du tissu disséqué pour l’analyse plus tard, l’ARN a été extrait du cortex préfrontal médial disséqué qui avait été stocké pendant plusieurs semaines. Tous les échantillons ont produit l’ARN de haute qualité avec le baguage ribosomal distinct et les nombres d’intégrité d’ARN au-dessus de huit. Pour confirmer l’intégrité protéique des échantillons disséqués congelés, la protéine a été recueillie, transférée à la nitrocellulose et à la sonde avec anticorps contre la cible de poids moléculaire élevé KCC2, et l’actine de protéine de poids moléculaire inférieur.Dans tous les cas, les bandes étaient nettes et distinctes, sans produits de décomposition discernables. Il est important de garder les tissus congelés tout au long du processus car cela préserve le microenvironnement des sections et de maintenir la morphologie de la section pour la comparaison avec les images de l’atlas du cerveau. Les régions d’intérêt recueillies de cette manière peuvent être stockées pendant plusieurs mois à un taux négatif de 80 degrés Celsius et peuvent être utilisées dans de nombreuses applications en aval, y compris rt-qPCR, ARN-Seq, analyse des taches occidentales, et HPLC.Cette méthode a été utilisée pour explorer les changements moléculaires dans les systèmes limbiques des rongeurs périnatals exposés au THC et à d’autres cannabinoïdes afin de mieux comprendre comment ces médicaments peuvent affecter le développement du cerveau.

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

IRMf simultanées et l&#39;électrophysiologie dans le cerveau de rongeurs

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Recherche

Neurosciences

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Analyses morphométriques des sections rétiniennes

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Résolution quantitative Haute Synaptic Proteome Profiling des souris régions cérébrales Après Auditory Discrimination apprentissage

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to deliver gene or cell therapy products. Unfortunately, current microinjection techniques use steel or glass needles that are suboptimal for multiple reasons: in particular, steel needles may cause tissue damage, and glass needles may bend when lowered deeply into the brain, missing the target region. In this article, we describe a protocol to prepare and use quartz needles that combine a number of useful features. These needles do not produce detectable tissue damage and, being very rigid, ensure reliable delivery in the desired brain region even when using deep coordinates. Moreover, it is possible to personalize the design of the needle by making multiple holes of the desired diameter. Multiple holes facilitate the injection of large amounts of solution within a larger area, whereas large holes facilitate the injection of cells. In addition, these quartz needles can be cleaned and re-used, such that the procedure becomes cost-effective.

We describe here a protocol for microinjection in the rodent brain that uses quartz needles. These needles do not produce detectable tissue damage and ensure reliable delivery even in deep regions. Moreover, they can be adapted to research needs by personalized designs and can be re-used.

Aiguilles personnalisées pour Microinjections dans le cerveau des rongeur

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stéréotaxique Atlas guidée Laser Microdissection de saisie des régions cérébrales touchées par lésion traumatique

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...