Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les NIH, DA043982 et DA046196.

Les animaux utilisés dans cette étude ont été traités d’une manière éthique et humaine, comme l’ont indiqué le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université de l’Indiana et les lignes directrices des National Institutes of Health (NIH).
REMARQUE : Tous les outils et surfaces doivent être lavés avec un solvant approprié pour enlever les nucléases18 avant de commencer tout travail.
1. ...

<ol>
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Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Ces travaux décrivent une technique pour isoler de petites régions spécifiques du cerveau tout en limitant la dégradation de l’acide nucléique et des protéines. Les dommages aux tissus cérébraux se produisent rapidement une fois qu’un organisme meurt. Ceci est dû en partie à une accumulation rapide de glutamate extracellulaire et l’excitotoxicité résultante qui se produit21. L’ARN Messenger est particulièrement vulnérable à la dégradation22,</su...

Ce travail illustre la dissection des régions du cerveau congelées pour l’extraction de l’acide ou des protéines nucléiques de haute qualité à l’aide d’une référence, comme l’Allen Mouse Brain Atlas1, comme guide. Dans cette technique, les cerveaux sont surgelés et stockés à -80 oC pour la section et la dissection ultérieures tout en étant maintenus dans un état gelé. Ce processus permet au chercheur de récolter un grand nombre de cerveaux en une seule séance et de les disséquer plus tard pour une collecte précise de multiples régions du cerveau.
La collecte précise des régions d’intérêt du cerveau (ROIs) est souvent nécessaire lorsqu’il répond à des questions liées à l’expression des gènes et des protéines. Tandis que la pharmacologie, l’électrophysiologie et l’optogénétique peuvent être employées sur le type sauvage ou les rongeurs génétiquement modifiés pour aider à élucider les changements moléculaires qui sous-tendent les comportements observés2,,3,4,la mesure des changements induits dans les transcriptomes et les protéomes est souvent employée pour soutenir ces résultats., Des techniques telles que la réaction quantitative en chaîne de polymérase inverse (RT-qPCR), le ballonnement occidental, le RNAseq5, le MAPSeq6 et le HPLC7 sont robustes et relativement faibles en coût, ce qui permet à de nombreux laboratoires d’étudier les changements moléculaires induits dans les petites régions du cerveau2,,4,5,6.
Il existe plusieurs façons d’extraire et de purifier l’acide nuléique ou des protéines des régions du cerveau8,9,10,11,12. De nombreux laboratoires récoltent les régions du cerveau en refroidissant et en coupant les cerveaux sur la glace au moment de la récolte9,13. Bien que cette approche puisse entraîner de l’acide nucléique de haute qualité et des protéines, elle est quelque peu limitée dans le temps, car la dégradation dans le microenvironnement du tissu peut avoir lieu à ces températures. Cela peut être particulièrement vrai lorsque vous tentez de disséquer un grand nombre d’animaux ou d’IRM en une seule séance. Garder les échantillons congelés aide à maintenir les molécules cibles labiles tout en donnant au chercheur le temps de comparer soigneusement les repères des deux côtés de chaque section dans l’effort de recueillir des échantillons relativement purs. La capture au laser est une autre façon de recueillir des tissus pour l’analyse de l’ARN ou des protéines dans les zones cérébrales10. Cette procédure est supérieure à la dissection mécanique dans ce ROIs de forme très petite et irrégulièrement peut être identifiée et isolée. Cependant, la capture au laser est limitée par l’utilisation d’équipements et de réactifs coûteux, prend beaucoup de temps et peut également être plus sensible à la dégradation de l’échantillon.
La dissection de micropunch sur les tissus congelés n’est pas nouvelle. Les premiers papiers de Miklos Palkovits et d’autres décrivent les techniques de base en détail14,15. Cette présentation suit en grande partie le travail initial, avec quelques améliorations pour faciliter l’efficacité et réduire les dépenses de l’équipement nécessaire. Par exemple, les sections cérébrales sont faites dans un bloc cérébral gelé plutôt que sur un cryostat. Cela produit des sections plus épaisses qui réduisent le nombre de sections nécessaires pour recueillir des échantillons de retour sur investissement. Cette méthode disséque également des échantillons sur une plaque de verre congelée qui repose sur de la glace sèche dans une boîte isolée. Cela produit une étape de sous-gel au banc sur lequel travailler. Les sections disséquées de cette façon sont facilement manipulatibles, ce qui permet au chercheur de comparer les deux côtés de chaque section avec une référence afin de limiter la contamination des régions en dehors du retour sur investissement souhaité.
Les avantages de ce protocole sont que 1) le cerveau est maintenu dans un état gelé tout au long du processus, qui aide à préserver les protéines et l’acide nucléique et donne au chercheur le temps de récolter soigneusement les IA, et 2) les réactifs requis sont peu coûteux et se trouvent dans la plupart des laboratoires de biologie moléculaire. Dans ce processus, les cerveaux entiers sont sectionnés à 0,5-1,0 mm dans une matrice de cerveau et placés sur une plaque de verre congelée qui est continuellement refroidie avec de la glace sèche. Les repères trouvés dans l’Atlas du cerveau Allen1 ou d’autres atlas cérébraux16,17 sont utilisés pour identifier les régions d’intérêt, qui sont ensuite disséquées à l’aide d’un poinçon froid ou d’un scalpel. Parce que le tissu n’est jamais décongelé, les régions récoltées de cette manière fournissent l’ARN et les protéines de haute qualité pour les analyses en aval.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Au fur et à mesure que notre compréhension de la neurobiologie a progressé, des analyses moléculaires sont souvent effectuées sur de petites zones cérébrales telles que le cortex préfrontal médial (MPFC) ou le noyau accumbens. Le défi dans ce travail est de disséquer la zone correcte tout en préservant le microenvironnement à examiner. Dans cet article, nous décrivons une méthode simple et peu coûteuse utilisant des ressources facilement disponibles dans la plupart des laboratoires. Cette méthode préserve l’acide nucléique et les protéines en gardant le tissu congelé tout au long du processus. Les cerveaux sont coupés en sections de 0,5 à 1,0 mm à l’aide d’une matrice cérébrale et disposés sur une plaque de verre congelée. Les repères de chaque section sont comparés à une référence, comme l’Atlas du cerveau Allen Mouse, et les régions sont disséquées à l’aide d’un scalpel froid ou d’un poinçon de biopsie. Le tissu est ensuite stocké à -80 oC jusqu’à l’utilisation. Grâce à ce processus rat et souris mPFC, noyau accumbens, hippocampe dorsale et ventral et d’autres régions ont été analysés avec succès à l’aide de qRT-PCR et d’essais occidentaux. Cette méthode est limitée aux régions du cerveau qui peuvent être identifiées par des repères clairs.

Afin de valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles CD1 adultes et l’ARN et la protéine ont été extraits et caractérisés. L’ARN a été analysé par électrophoresis capillaire. L’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomal 28S et 18S et montre également des produits de dégradation comme un frottis entre 25 et 200 nucléotides(figure 5A, échantillon 1). L’ARN de haute qualité montre des bande...

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Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Cette procédure décrit la collecte de régions cérébrales congelées discrètes pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles.

Collection de régions de cerveau de rongeur congelés pour des analyses en aval

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Cette procédure décrit la collection de régions discrètes du cerveau congelé pour obtenir des protéines et de l’ARN de haute qualité à l’aide d’outils peu coûteux et couramment disponibles. Étant donné que les régions du cerveau sont empêchées de récolter par dissection, les molécules cibles sont préservées et le chercheur a le temps de disséquer et de stocker soigneusement les régions d’intérêt. Il peut d’abord être difficile d’identifier les régions d’intérêt.L’utilisation de repères cérébraux communs au fur et à mesure qu’ils émergent et reculent à travers les sections par rapport aux régions désirées permettra d’identifier clairement. Après avoir enlevé le cerveau des souris adultes euthanasiées de type CD-1, congelez le tissu pendant 60 secondes dans de l’azote liquide ou de l’isopentane. Pré-réfrigérer avec de la glace sèche et la conserver à moins 80 degrés Celsius.24 heures avant de disséquer le tissu, placez une matrice cérébrale propre sur une pile de paquets de congélateur décongelés. Et sandwich les côtés de la matrice entre deux paquets de congélateur en s’assurant de laisser environ un demi-centimètre entre le fond des fentes de rasoir et le haut des paquets. Installez une plaque de verre congelée pour la dissection en remplissant une boîte isolée de glace jusqu’à environ cinq centimètres du haut.Placez ensuite une couche de glace sèche de 2,5 centimètres sur le dessus. Et couvrez-le de bâches en plastique noir. Placer une plaque de verre sur le dessus du plastique.Et de la glace sèche autour des bordures de la plaque. Retirez la matrice cérébrale gelée du congélateur et insérez le cerveau, côté cortex vers le haut, dans la matrice. Laisser le tissu équilibrer à la température dans la boîte pendant 10 minutes.Garder le couvercle ouvert pendant ce temps. Utilisez des forceps froids pour ajuster la position du cerveau dans la matrice de sorte que le sinus sagittal et le sinus transversal s’alignent avec les rainures perpendiculaires du bloc. Une fois que le cerveau est en position, placez une lame de rasoir réfrigérée près de son centre et pressez-la d’environ un millimètre dans le tissu.Ensuite, placez une lame réfrigérée à chaque extrémité du cerveau et appuyez jusqu’à la matrice. Commencez ensuite à ajouter des lames réfrigérées à l’extrémité rostrale, en les plaçant dans les fentes une à la fois et en les appuyant doucement un millimètre dans le tissu. Continuer à ajouter des lames à intervalles d’un millimètre, en travaillant vers l’extrémité caudale.Lorsque toutes les lames sont en place, appuyez sur le dessus avec les doigts, la paume ou un objet contondant et secouez-les lentement d’un côté à l’autre pour les déplacer à travers le tissu. Une fois que les lames ont atteint le bas des fentes, saisir chaque côté du groupe de lames et les libérer de la matrice en se berçant dans les deux sens. Après avoir libéré le groupe de lames placez-les côté rostral vers le haut sur la plaque de verre, et mettez la glace sèche à côté ou sur le dessus de la pile pour congeler davantage les échantillons pour faciliter la séparation.Ensuite, placez la pile avec des bords tranchants vers le bas et séparez les lames en déplaçant la pile entre le pouce et les doigts. Alignez la section sur les plaques de verre de rostral à caudale et séparez le tissu des lames en les fléchissant entre les doigts, ou en les séparant d’une deuxième lame réfrigérée. Parfois, le tissu peut coller des deux côtés d’une lame et le soin doit être pris pour maintenir l’orientation rostrale à caudale.Avant de commencer la dissection, ouvrez l’Atlas du cerveau de la souris Allen ou une autre référence et trouvez les repères nécessaires pour identifier les régions d’intérêt. Utilisez des forceps ou des lames réfrigérés pour retourner la section. Et assurez-vous que la région d’intérêt est cohérente dans toute la section.Couper dans la section avec un scalpel propre ou un poinçon, poussant le métal doucement mais fermement dans le tissu. Le balancer d’avant en arrière pour faire la coupe. Après avoir récolté la région d’intérêt, placez-la dans des tubes pré-réfrigérés de 1,5 millimètre étiquetés et rangez-les à moins 80 degrés Celsius.Pour traiter le tissu, ajoutez un tampon RIPA froid pour l’extraction des protéines ou un guanidinium contenant du solvant pour l’extraction de l’ARN et homogénéisez-le immédiatement avec un dus au verre ou un homogénéisateur mécanique. Pour valider cette méthode, le cortex préfrontal médial a été recueilli à partir de souris mâles adultes de type SAUVAGE CD-1, et l’ARN et les protéines ont été caractérisés. Lorsqu’il est analysé avec l’électrophoresis capillaire, l’ARN dégradé affiche une perte dans l’intensité des bandes ribosomales 28S et 18S, aussi bien qu’un frottis entre 25 et 200 nucléotides.Tandis que l’ARN de haute qualité montre les bandes ribosomales distinctes peu ou pas de signal dans la région inférieure de poids moléculaire. L’ARN obtenu à l’aide de la méthode de dissection congelée a été comparé à l’ARN préparé à partir de tissus fraîchement récoltés. Les deux méthodes produisent de l’ARN avec un nombre élevé d’intégrité et un baguage ribosomal fort.Pour confirmer que cette méthode peut être employée pour préserver le microenvironnement du tissu disséqué pour l’analyse plus tard, l’ARN a été extrait du cortex préfrontal médial disséqué qui avait été stocké pendant plusieurs semaines. Tous les échantillons ont produit l’ARN de haute qualité avec le baguage ribosomal distinct et les nombres d’intégrité d’ARN au-dessus de huit. Pour confirmer l’intégrité protéique des échantillons disséqués congelés, la protéine a été recueillie, transférée à la nitrocellulose et à la sonde avec anticorps contre la cible de poids moléculaire élevé KCC2, et l’actine de protéine de poids moléculaire inférieur.Dans tous les cas, les bandes étaient nettes et distinctes, sans produits de décomposition discernables. Il est important de garder les tissus congelés tout au long du processus car cela préserve le microenvironnement des sections et de maintenir la morphologie de la section pour la comparaison avec les images de l’atlas du cerveau. Les régions d’intérêt recueillies de cette manière peuvent être stockées pendant plusieurs mois à un taux négatif de 80 degrés Celsius et peuvent être utilisées dans de nombreuses applications en aval, y compris rt-qPCR, ARN-Seq, analyse des taches occidentales, et HPLC.Cette méthode a été utilisée pour explorer les changements moléculaires dans les systèmes limbiques des rongeurs périnatals exposés au THC et à d’autres cannabinoïdes afin de mieux comprendre comment ces médicaments peuvent affecter le développement du cerveau.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

IRMf simultanées et l&#39;électrophysiologie dans le cerveau de rongeurs

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Recherche

Neurosciences

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

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Grandir cellules souches neurales de régions classiques et non conventionnelles du cerveau adulte rongeurs

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Résolution quantitative Haute Synaptic Proteome Profiling des souris régions cérébrales Après Auditory Discrimination apprentissage

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Aiguilles personnalisées pour Microinjections dans le cerveau des rongeur

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...