Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH, DA043982 ו-DA046196.

בעלי חיים המשמשים במחקר זה טופלו בצורה אתית והומאני כפי שנקבעו על ידי בעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אינדיאנה והשתמש הוועדה (IACUC) והמכון הלאומי לבריאות (NIH) הנחיות.
הערה: כל הכלים והמשטחים צריך להיות שטף עם הממס המתאים כדי להסיר נוקלאוסים18 לפני תחילת כל עבודה....

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

עבודה זו מתארת טכניקה לבודד אזורים קטנים וספציפיים של המוח תוך הגבלת השפלה של חומצת גרעין וחלבונים. נזק לרקמות המוח קורה. במהירות ברגע שאורגניזם מת זה באופן חלקי בשל הצטברות מהירה של גלוטמט החילוץ ואת ההתרגשות הנובעת שמתרחשת21. שליח RNA פגיע במיוחד להשפלה22,<sup...

עבודה זו ממחישה את הניתוח של אזורי המוח קפוא להפקת חומצה גרעין באיכות גבוהה או חלבון באמצעות התייחסות, כגון המוח העכבר אלן אטלס1, כמדריך. בטכניקה זו, המוחות מוקפאים ומאוחסנים ב-80 ° c לצורך הצבה מאוחרת יותר ולאחר החיתוך תוך כדי תחזוקה במצב קפוא. תהליך זה מאפשר לחוקר לקצור מספר רב של מוחות בפגישה אחת ולאחר מכן לנתח אותם לאוסף מדויק של אזורי מוח מרובים.
האוסף המדויק של אזורי המוח המעניינים (ROIs) נדרש לעתים קרובות כאשר מענות על שאלות הקשורות לביטוי הגן והחלבון. בעוד פרמקולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה ו אלקטרואופטיקה ניתן להשתמש על סוג wildtype מכרסמים מהונדסים גנטית כדי לעזור להבהיר שינויים מולקולריים הצמדת התנהגויות שנצפו2,3,4, המדידה של שינויים המושרה ב transcript ו פרוטמס משמש לעתים קרובות כדי לתמוך בממצאים אלה. טכניקות כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR), בלוק מערבי, RNAseq5, mapseq6 ו כדיקות7 הם חזקים יחסית נמוך בעלות, המאפשר מעבדות רבות ללמוד שינויים מולקולריים המושרה בתוך מחוזות המוח הקטן2,4,5,6.
ישנן מספר דרכים כדי לחלץ ולטהר חומצות גרעין או חלבון מאזורי המוח8,9,10,11,12. מעבדות רבות הקציר אזורי המוח על ידי מצמרר וחיתוך המוח על הקרח בזמן הקציר9,13. בעוד גישה זו יכולה לגרום חומצה גרעין באיכות גבוהה וחלבון, זה קצת זמן מוגבל כמו השפלה בתוך מיקרוסביבה של הרקמה עשויה להתרחש בטמפרטורות אלה. זה יכול להיות נכון במיוחד כאשר מנסים לנתח מספר גדול של בעלי חיים או ROIs בישיבה אחת. שמירה על דגימות קפוא מסייע לשמור יציב משך מולקולות היעד תוך מתן זמן החוקר להשוות בקפידה ציוני דרך משני הצדדים של כל קטע במאמץ לאסוף דגימות טהור יחסית. לכידת לייזר היא דרך נוספת לאסוף רקמות עבור RNA או ניתוח חלבון מאזורי המוח10. הליך זה הוא מעולה לניתוח מכני באותו ROIs קטן מאוד בצורה לא סדירה ניתן לזהות ולבודד. עם זאת, לכידת לייזר מוגבל על ידי שימוש של ציוד יקר ריאגנטים, הוא זמן רב ועלול גם להיות פגיע יותר לירידה במדגם.
ניתוח micropunch ' על רקמות קפואות הוא לא חדש. מאמרים מוקדמים של מיקלוס פאלקוביץ ' ואחרים מתארים את הטכניקות הבסיסיות בפירוט14,15. מצגת זו בעיקר לאחר העבודה המקורית, עם כמה שיפורים כדי להקל על היעילות ולהקטין את ההוצאות של הציוד הדרוש. למשל, מקטעים מהמוח נעשים בבלוק מוחי קפוא ולא בקריוסטט. זה מייצר סעיפים עבה יותר אשר מפחית את מספר הסעיפים הדרושים כדי לאסוף דגימות ROI. שיטה זו גם מבתר דגימות על צלחת זכוכית קפואה שיושבת על קרח יבש בתוך קופסה מבודדת. זה יוצר שלב מקפיא בספסל שעליו לעבוד. מקטעים גזור בדרך זו הם מניקל בקלות לתרגום, המאפשר לחוקר להשוות את שני הצדדים של כל מקטע עם התייחסות על מנת להגביל את הזיהום מאזורים מחוץ ROI הרצוי.
היתרונות של פרוטוקול זה הם 1) המוח נשמר במצב קפוא לאורך כל התהליך, אשר מסייע לשמר את חומצות החלבון והגרעין ונותן את הזמן החוקר ROIs הקציר בזהירות, ו 2) ריאגנטים נדרש הם זולים נמצאים במעבדות הביולוגיה המולקולרית ביותר. בתהליך זה, מוחות שלמים מנות עד 0.5-1.0 מ"מ במטריצת מוח ומניחים על צלחת זכוכית קפואה כי הוא מקורר ברציפות עם קרח יבש. ציוני דרך שנמצאו במוח אלן אטלס1 או אטלסים המוח אחרים16,17 משמשים כדי לזהות אזורים של עניין, אשר לאחר מכן לגזור באמצעות אגרוף קר או אזמל. כי הרקמה מעולם לא הופפה, אזורים שנקטפו באופן זה לספק באיכות גבוהה RNA וחלבונים עבור ניתוחי במורד הזרם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

כמו ההבנה שלנו של נוירוביולוגיה התקדמה, ניתוחים מולקולריים מבוצעים לעתים קרובות על אזורים במוח קטן כגון קליפת האמצעי המדינטלית (mPFC) או גרעין accumbens. האתגר בעבודה זו הוא לנתח את השטח הנכון תוך שמירה על המיקרו-סביבה להיבדק. במאמר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה באמצעות משאבים זמינים ברוב המעבדות. שיטה זו שומרת על חומצת גרעין וחלבונים על ידי שמירה על הרקמה הקפואה לאורך כל התהליך. המוח הם חתכו לתוך 0.5 – 1.0 מקטעים באמצעות מטריצה המוח מסודרים על צלחת זכוכית קפואה. ציוני דרך בכל מקטע מושווים להפניה, כגון אטלס המוח של אלן העכבר, והאזורים הם גזור באמצעות איזמל קר או אגרוף ביופסיה. הרקמה מאוחסנת לאחר מכן ב-80 ° צ' עד השימוש. באמצעות זה עכברוש ועכבר התהליך mPFC, גרעין accumbens, ההיפוקמפוס והיפוגולי ואזורים אחרים נותחו בהצלחה באמצעות רביעיית-PCR ומערב assays. שיטה זו מוגבלת לאזורי מוח שניתן לזהותה באמצעות ציוני דרך ברורים.

על מנת לאמת את השיטה, הקליפה הפרונטלית המדידית נאסף מן המבוגר CD1 wildtype עכברים זכרים ו-RNA וחלבונים חולצו ומאופיין. רנ א נותח על ידי אלקטרופורזה קפילר. מושפל RNA מציג אובדן באינטנסיביות של להקות הריבוזומבית 28S ו-18S ומציג גם מוצרי השפלה ככתם בין 25 ו 200 נוקלאוטידים (איור 5A, לדוגמה 1). ב...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

הליך זה מתאר את האוסף של אזורי מוח קפואים דיסקרטיים כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה RNA באמצעות כלים זולים זמינים בדרך כלל. מכיוון ואזורי מוח נשמרים קפואים מהקציר באמצעות ניתוח, מולקולות היעד נשמרות והחוקר יש זמן לנתח ולאחסן בזהירות אזורים מעניינים. זיהוי אזורי עניין יכול בתחילה להיות מאתגר.שימוש בציוני דרך נפוצים במוח כשהם מגיחים ונ נסוגים דרך החלקים ביחס לאזורים הרצויים יבהיר את הזיהוי. לאחר הסרת מוחות מעכברי CD-1 פראיים בוגרים שעברו המתת דם, פלאש מקפיא את הרקמה למשך 60 שניות בחנקן נוזלי או באירופנטאן. מצננים מראש עם קרח יבש ומאחסנים אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.24 שעות לפני ניתוח הרקמה, מניחים מטריצת מוח נקייה על ערימה של חבילות מקפיא מופשרות. וכריך את הצדדים למטריצה בין שתי חבילות מקפיא הקפדה להשאיר כחצי סנטימטר בין החלק התחתון של חריצי התער ואת החלק העליון של האריזות. הגדר צלחת זכוכית קפואה עבור הניתוח על ידי מילוי קופסה מבודדת עם קרח עד כחמישה סנטימטרים מלמעלה.לאחר מכן מניחים שכבה של 2.5 ס"מ של קרח יבש על גבי. ולכסות אותו עם יריעות פלסטיק שחורות. מניחים צלחת זכוכית על גבי הפלסטיק.וקרח יבש סביב גבולות הצלחת. מוציאים את מטריצת המוח הקפואה מהמקפיא ומכניסים את המוח, את קליפת המוח למעלה, למטריצה. אפשר לרקמה לצייד לטמפרטורה בתיבה במשך 10 דקות.שמירה על המכסה פתוח במהלך תקופה זו. השתמש במטליות קרות כדי להתאים את מיקום המוח במטריצה כך שסינוס הסגיטל וסינוס רוחבי ינקו עם החריצים הניצבים של הבלוק. ברגע שהמוח נמצא בעמדה, מניחים סכין גילוח מצונן ליד מרכזו ולחץ עליו כמילימטר לתוך הרקמה.לאחר מכן, מניחים להב מצונן אחד בכל קצה של המוח ולחץ כל הדרך למטה לתוך המטריצה. ואז להתחיל להוסיף להבים מצוננים בקצה rostral, הצבת אותם לתוך החריצים אחד בכל פעם בעדינות לחיצה עליהם מילימטר אחד לתוך הרקמה. המשך להוסיף להבים במרווחי זמן של מילימטר אחד, עובד לכיוון הקצה caudal.כאשר כל הלהבים נמצאים במקום, לחץ למטה מלמעלה עם אצבעות, כף יד, או אובייקט קהה ולנענע אותם לאט מצד לצד כדי להזיז אותם דרך הרקמה. לאחר שהלהבים הגיעו לתחתית החריצים, תפסו כל צד של קבוצת הלהבים ושחררו אותם מהמטריצה על ידי התנדנדות קדימה ואחורה. לאחר לשחרר את הקבוצה של להבים למקם אותם בצד rostral על צלחת הזכוכית, ולשים קרח יבש ליד או על גבי הערימה כדי להקפיא עוד יותר את הדגימות להפרדה קלה יותר.לאחר מכן מקם את הערימה עם קצוות חדים כלפי מטה והפרד את הלהבים על-ידי הסטת הערימה בין האגודל והאצבעות. מרפדים את החלק על לוחות הזכוכית מ rostral כדי caudal ולהפריד את הרקמה מן הלהבים על ידי כיפוף אותם בין האצבעות, או על ידי הפרדתם עם להב מצונן שני. לפעמים, רקמה עשויה להידבק לשני הצדדים של להב ויש לנקוט בזהירות כדי לשמור על כיוון rostral כדי caudal.לפני תחילת הניתוח, פתח את אטלס המוח של עכבר אלן או התייחסות אחרת ולמצוא את ציוני הדרך הדרושים כדי לזהות אזורים מעניינים. השתמש במקלפים או להבים צוננים כדי להפוך את החלק. וודא שאזור העניין עקבי לאורך כל הסעיף.חותכים לתוך החלק עם אזמל נקי או אגרוף, דוחף את המתכת בעדינות אך בחוזקה לתוך הרקמה. נדנדה אותו קדימה ואחורה כדי להפוך את החתך. לאחר קצירת אזור העניין, מניחים אותו לתוך צינורות 1.5 מילימטר מקורר מראש ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי לעבד את הרקמה, להוסיף מאגר RIPA קר עבור מיצוי חלבון או guanidinium המכיל ממס עבור מיצוי RNA ומיד הומוגניזציה אותו עם זכוכית downs או homogenizer מכני. כדי לאמת שיטה זו, קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית נאספה מעכברים זכרים מסוג CD-1 פראי למבוגרים, ו- RNA וחלבון התאפיינו. כאשר מנתחים אותו באמצעות אלקטרופורזה נימית, RNA מושפל מציג אובדן בעוצמת הרצועות הריבוזומליות 28S ו- 18S, כמו גם מריחה בין 25 ל -200 נוקלאוטידים.בעוד RNA באיכות גבוהה מראה להקות ריבוזומליות נפרדות מעט עד ללא אות באזור המשקל המולקולרי התחתון. RNA להשיג באמצעות שיטת ניתוח קפוא הושווה RNA מוכן רקמה שנקטפו טרי. שתי השיטות מייצרות רנ"א עם מספרי יושרה גבוהים ורצועות ריבוזומליות חזקות.כדי לאשר כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לשמר את microenvironment של רקמה נותחו לניתוח מאוחר יותר, RNA חולץ קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלית נותח שאוחסן במשך מספר שבועות. כל הדגימות ייצרו רנ"א באיכות גבוהה עם פסים ריבוזומליים מובהקים ומספרי שלמות RNA מעל שמונה. כדי לאשר את שלמות החלבון של הדגימות המנותרות הקפואות, החלבון נאסף, הועבר לניטרוסלולוס ובדיקה עם נוגדנים נגד יעד המשקל המולקולרי הגבוה KCC2, ואקטין חלבון במשקל מולקולרי נמוך יותר.בכל המקרים הלהקות היו חדות ומובחנות ללא מוצרי פירוט ניכרים. חשוב לשמור על הרקמות קפואות לאורך כל התהליך כמו זה משמר את microenvironment של החלקים ולשמור על מורפולוגיה סעיף להשוואה עם תמונות אטלס המוח. אזורי עניין שנאספו באופן זה ניתן לאחסן במשך מספר חודשים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי, והוא יכול להיות מנוצל ביישומים רבים במורד הזרם, כולל RT-qPCR, RNA-Seq, ניתוח כתם מערבי, ו HPLC.שיטה זו שימשה כדי לחקור שינויים מולקולריים בתוך המערכות הלימביות של מכרסמים פרינטליים שנחשפו ל- THC וקנבינואידים אחרים כדי להבין טוב יותר כיצד תרופות אלה עשויות להשפיע על התפתחות המוח.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

FMRI Electrophysiology סימולטני במוח מכרסמים

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation של נוירונים בין פרוסות המוח מכרסמים לחקר הילוכים Synaptic ותמונה מסופי Presynaptic

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...