Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי ה-NIH, DA043982 ו-DA046196.

בעלי חיים המשמשים במחקר זה טופלו בצורה אתית והומאני כפי שנקבעו על ידי בעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אינדיאנה והשתמש הוועדה (IACUC) והמכון הלאומי לבריאות (NIH) הנחיות.
הערה: כל הכלים והמשטחים צריך להיות שטף עם הממס המתאים כדי להסיר נוקלאוסים18 לפני תחילת כל עבודה....

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

עבודה זו מתארת טכניקה לבודד אזורים קטנים וספציפיים של המוח תוך הגבלת השפלה של חומצת גרעין וחלבונים. נזק לרקמות המוח קורה. במהירות ברגע שאורגניזם מת זה באופן חלקי בשל הצטברות מהירה של גלוטמט החילוץ ואת ההתרגשות הנובעת שמתרחשת21. שליח RNA פגיע במיוחד להשפלה22,<sup...

עבודה זו ממחישה את הניתוח של אזורי המוח קפוא להפקת חומצה גרעין באיכות גבוהה או חלבון באמצעות התייחסות, כגון המוח העכבר אלן אטלס1, כמדריך. בטכניקה זו, המוחות מוקפאים ומאוחסנים ב-80 ° c לצורך הצבה מאוחרת יותר ולאחר החיתוך תוך כדי תחזוקה במצב קפוא. תהליך זה מאפשר לחוקר לקצור מספר רב של מוחות בפגישה אחת ולאחר מכן לנתח אותם לאוסף מדויק של אזורי מוח מרובים.
האוסף המדויק של אזורי המוח המעניינים (ROIs) נדרש לעתים קרובות כאשר מענות על שאלות הקשורות לביטוי הגן והחלבון. בעוד פרמקולוגיה, אלקטרופיזיולוגיה ו אלקטרואופטיקה ניתן להשתמש על סוג wildtype מכרסמים מהונדסים גנטית כדי לעזור להבהיר שינויים מולקולריים הצמדת התנהגויות שנצפו2,3,4, המדידה של שינויים המושרה ב transcript ו פרוטמס משמש לעתים קרובות כדי לתמוך בממצאים אלה. טכניקות כגון שעתוק הפוכה כמותית תגובת שרשרת פולימראז (RT-qPCR), בלוק מערבי, RNAseq5, mapseq6 ו כדיקות7 הם חזקים יחסית נמוך בעלות, המאפשר מעבדות רבות ללמוד שינויים מולקולריים המושרה בתוך מחוזות המוח הקטן2,4,5,6.
ישנן מספר דרכים כדי לחלץ ולטהר חומצות גרעין או חלבון מאזורי המוח8,9,10,11,12. מעבדות רבות הקציר אזורי המוח על ידי מצמרר וחיתוך המוח על הקרח בזמן הקציר9,13. בעוד גישה זו יכולה לגרום חומצה גרעין באיכות גבוהה וחלבון, זה קצת זמן מוגבל כמו השפלה בתוך מיקרוסביבה של הרקמה עשויה להתרחש בטמפרטורות אלה. זה יכול להיות נכון במיוחד כאשר מנסים לנתח מספר גדול של בעלי חיים או ROIs בישיבה אחת. שמירה על דגימות קפוא מסייע לשמור יציב משך מולקולות היעד תוך מתן זמן החוקר להשוות בקפידה ציוני דרך משני הצדדים של כל קטע במאמץ לאסוף דגימות טהור יחסית. לכידת לייזר היא דרך נוספת לאסוף רקמות עבור RNA או ניתוח חלבון מאזורי המוח10. הליך זה הוא מעולה לניתוח מכני באותו ROIs קטן מאוד בצורה לא סדירה ניתן לזהות ולבודד. עם זאת, לכידת לייזר מוגבל על ידי שימוש של ציוד יקר ריאגנטים, הוא זמן רב ועלול גם להיות פגיע יותר לירידה במדגם.
ניתוח micropunch ' על רקמות קפואות הוא לא חדש. מאמרים מוקדמים של מיקלוס פאלקוביץ ' ואחרים מתארים את הטכניקות הבסיסיות בפירוט14,15. מצגת זו בעיקר לאחר העבודה המקורית, עם כמה שיפורים כדי להקל על היעילות ולהקטין את ההוצאות של הציוד הדרוש. למשל, מקטעים מהמוח נעשים בבלוק מוחי קפוא ולא בקריוסטט. זה מייצר סעיפים עבה יותר אשר מפחית את מספר הסעיפים הדרושים כדי לאסוף דגימות ROI. שיטה זו גם מבתר דגימות על צלחת זכוכית קפואה שיושבת על קרח יבש בתוך קופסה מבודדת. זה יוצר שלב מקפיא בספסל שעליו לעבוד. מקטעים גזור בדרך זו הם מניקל בקלות לתרגום, המאפשר לחוקר להשוות את שני הצדדים של כל מקטע עם התייחסות על מנת להגביל את הזיהום מאזורים מחוץ ROI הרצוי.
היתרונות של פרוטוקול זה הם 1) המוח נשמר במצב קפוא לאורך כל התהליך, אשר מסייע לשמר את חומצות החלבון והגרעין ונותן את הזמן החוקר ROIs הקציר בזהירות, ו 2) ריאגנטים נדרש הם זולים נמצאים במעבדות הביולוגיה המולקולרית ביותר. בתהליך זה, מוחות שלמים מנות עד 0.5-1.0 מ"מ במטריצת מוח ומניחים על צלחת זכוכית קפואה כי הוא מקורר ברציפות עם קרח יבש. ציוני דרך שנמצאו במוח אלן אטלס1 או אטלסים המוח אחרים16,17 משמשים כדי לזהות אזורים של עניין, אשר לאחר מכן לגזור באמצעות אגרוף קר או אזמל. כי הרקמה מעולם לא הופפה, אזורים שנקטפו באופן זה לספק באיכות גבוהה RNA וחלבונים עבור ניתוחי במורד הזרם.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

כמו ההבנה שלנו של נוירוביולוגיה התקדמה, ניתוחים מולקולריים מבוצעים לעתים קרובות על אזורים במוח קטן כגון קליפת האמצעי המדינטלית (mPFC) או גרעין accumbens. האתגר בעבודה זו הוא לנתח את השטח הנכון תוך שמירה על המיקרו-סביבה להיבדק. במאמר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה, בעלות נמוכה באמצעות משאבים זמינים ברוב המעבדות. שיטה זו שומרת על חומצת גרעין וחלבונים על ידי שמירה על הרקמה הקפואה לאורך כל התהליך. המוח הם חתכו לתוך 0.5 – 1.0 מקטעים באמצעות מטריצה המוח מסודרים על צלחת זכוכית קפואה. ציוני דרך בכל מקטע מושווים להפניה, כגון אטלס המוח של אלן העכבר, והאזורים הם גזור באמצעות איזמל קר או אגרוף ביופסיה. הרקמה מאוחסנת לאחר מכן ב-80 ° צ' עד השימוש. באמצעות זה עכברוש ועכבר התהליך mPFC, גרעין accumbens, ההיפוקמפוס והיפוגולי ואזורים אחרים נותחו בהצלחה באמצעות רביעיית-PCR ומערב assays. שיטה זו מוגבלת לאזורי מוח שניתן לזהותה באמצעות ציוני דרך ברורים.

על מנת לאמת את השיטה, הקליפה הפרונטלית המדידית נאסף מן המבוגר CD1 wildtype עכברים זכרים ו-RNA וחלבונים חולצו ומאופיין. רנ א נותח על ידי אלקטרופורזה קפילר. מושפל RNA מציג אובדן באינטנסיביות של להקות הריבוזומבית 28S ו-18S ומציג גם מוצרי השפלה ככתם בין 25 ו 200 נוקלאוטידים (איור 5A, לדוגמה 1). ב...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

הליך זה מתאר את אוסף אזורי המוח קפוא בנפרד כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה ו-RNA באמצעות כלים זולים וזמינים בדרך כלל.

אוסף של אזורים קפואים המוח מכרסם עבור ניתוח במורד הזרם

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

הליך זה מתאר את האוסף של אזורי מוח קפואים דיסקרטיים כדי להשיג חלבון באיכות גבוהה RNA באמצעות כלים זולים זמינים בדרך כלל. מכיוון ואזורי מוח נשמרים קפואים מהקציר באמצעות ניתוח, מולקולות היעד נשמרות והחוקר יש זמן לנתח ולאחסן בזהירות אזורים מעניינים. זיהוי אזורי עניין יכול בתחילה להיות מאתגר.שימוש בציוני דרך נפוצים במוח כשהם מגיחים ונ נסוגים דרך החלקים ביחס לאזורים הרצויים יבהיר את הזיהוי. לאחר הסרת מוחות מעכברי CD-1 פראיים בוגרים שעברו המתת דם, פלאש מקפיא את הרקמה למשך 60 שניות בחנקן נוזלי או באירופנטאן. מצננים מראש עם קרח יבש ומאחסנים אותו במינוס 80 מעלות צלזיוס.24 שעות לפני ניתוח הרקמה, מניחים מטריצת מוח נקייה על ערימה של חבילות מקפיא מופשרות. וכריך את הצדדים למטריצה בין שתי חבילות מקפיא הקפדה להשאיר כחצי סנטימטר בין החלק התחתון של חריצי התער ואת החלק העליון של האריזות. הגדר צלחת זכוכית קפואה עבור הניתוח על ידי מילוי קופסה מבודדת עם קרח עד כחמישה סנטימטרים מלמעלה.לאחר מכן מניחים שכבה של 2.5 ס"מ של קרח יבש על גבי. ולכסות אותו עם יריעות פלסטיק שחורות. מניחים צלחת זכוכית על גבי הפלסטיק.וקרח יבש סביב גבולות הצלחת. מוציאים את מטריצת המוח הקפואה מהמקפיא ומכניסים את המוח, את קליפת המוח למעלה, למטריצה. אפשר לרקמה לצייד לטמפרטורה בתיבה במשך 10 דקות.שמירה על המכסה פתוח במהלך תקופה זו. השתמש במטליות קרות כדי להתאים את מיקום המוח במטריצה כך שסינוס הסגיטל וסינוס רוחבי ינקו עם החריצים הניצבים של הבלוק. ברגע שהמוח נמצא בעמדה, מניחים סכין גילוח מצונן ליד מרכזו ולחץ עליו כמילימטר לתוך הרקמה.לאחר מכן, מניחים להב מצונן אחד בכל קצה של המוח ולחץ כל הדרך למטה לתוך המטריצה. ואז להתחיל להוסיף להבים מצוננים בקצה rostral, הצבת אותם לתוך החריצים אחד בכל פעם בעדינות לחיצה עליהם מילימטר אחד לתוך הרקמה. המשך להוסיף להבים במרווחי זמן של מילימטר אחד, עובד לכיוון הקצה caudal.כאשר כל הלהבים נמצאים במקום, לחץ למטה מלמעלה עם אצבעות, כף יד, או אובייקט קהה ולנענע אותם לאט מצד לצד כדי להזיז אותם דרך הרקמה. לאחר שהלהבים הגיעו לתחתית החריצים, תפסו כל צד של קבוצת הלהבים ושחררו אותם מהמטריצה על ידי התנדנדות קדימה ואחורה. לאחר לשחרר את הקבוצה של להבים למקם אותם בצד rostral על צלחת הזכוכית, ולשים קרח יבש ליד או על גבי הערימה כדי להקפיא עוד יותר את הדגימות להפרדה קלה יותר.לאחר מכן מקם את הערימה עם קצוות חדים כלפי מטה והפרד את הלהבים על-ידי הסטת הערימה בין האגודל והאצבעות. מרפדים את החלק על לוחות הזכוכית מ rostral כדי caudal ולהפריד את הרקמה מן הלהבים על ידי כיפוף אותם בין האצבעות, או על ידי הפרדתם עם להב מצונן שני. לפעמים, רקמה עשויה להידבק לשני הצדדים של להב ויש לנקוט בזהירות כדי לשמור על כיוון rostral כדי caudal.לפני תחילת הניתוח, פתח את אטלס המוח של עכבר אלן או התייחסות אחרת ולמצוא את ציוני הדרך הדרושים כדי לזהות אזורים מעניינים. השתמש במקלפים או להבים צוננים כדי להפוך את החלק. וודא שאזור העניין עקבי לאורך כל הסעיף.חותכים לתוך החלק עם אזמל נקי או אגרוף, דוחף את המתכת בעדינות אך בחוזקה לתוך הרקמה. נדנדה אותו קדימה ואחורה כדי להפוך את החתך. לאחר קצירת אזור העניין, מניחים אותו לתוך צינורות 1.5 מילימטר מקורר מראש ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.כדי לעבד את הרקמה, להוסיף מאגר RIPA קר עבור מיצוי חלבון או guanidinium המכיל ממס עבור מיצוי RNA ומיד הומוגניזציה אותו עם זכוכית downs או homogenizer מכני. כדי לאמת שיטה זו, קליפת המוח הקדם-מצחית המדיאלית נאספה מעכברים זכרים מסוג CD-1 פראי למבוגרים, ו- RNA וחלבון התאפיינו. כאשר מנתחים אותו באמצעות אלקטרופורזה נימית, RNA מושפל מציג אובדן בעוצמת הרצועות הריבוזומליות 28S ו- 18S, כמו גם מריחה בין 25 ל -200 נוקלאוטידים.בעוד RNA באיכות גבוהה מראה להקות ריבוזומליות נפרדות מעט עד ללא אות באזור המשקל המולקולרי התחתון. RNA להשיג באמצעות שיטת ניתוח קפוא הושווה RNA מוכן רקמה שנקטפו טרי. שתי השיטות מייצרות רנ"א עם מספרי יושרה גבוהים ורצועות ריבוזומליות חזקות.כדי לאשר כי שיטה זו יכולה לשמש כדי לשמר את microenvironment של רקמה נותחו לניתוח מאוחר יותר, RNA חולץ קליפת המוח הקדם חזיתית המדיאלית נותח שאוחסן במשך מספר שבועות. כל הדגימות ייצרו רנ"א באיכות גבוהה עם פסים ריבוזומליים מובהקים ומספרי שלמות RNA מעל שמונה. כדי לאשר את שלמות החלבון של הדגימות המנותרות הקפואות, החלבון נאסף, הועבר לניטרוסלולוס ובדיקה עם נוגדנים נגד יעד המשקל המולקולרי הגבוה KCC2, ואקטין חלבון במשקל מולקולרי נמוך יותר.בכל המקרים הלהקות היו חדות ומובחנות ללא מוצרי פירוט ניכרים. חשוב לשמור על הרקמות קפואות לאורך כל התהליך כמו זה משמר את microenvironment של החלקים ולשמור על מורפולוגיה סעיף להשוואה עם תמונות אטלס המוח. אזורי עניין שנאספו באופן זה ניתן לאחסן במשך מספר חודשים ב 80 מעלות צלזיוס שלילי, והוא יכול להיות מנוצל ביישומים רבים במורד הזרם, כולל RT-qPCR, RNA-Seq, ניתוח כתם מערבי, ו HPLC.שיטה זו שימשה כדי לחקור שינויים מולקולריים בתוך המערכות הלימביות של מכרסמים פרינטליים שנחשפו ל- THC וקנבינואידים אחרים כדי להבין טוב יותר כיצד תרופות אלה עשויות להשפיע על התפתחות המוח.

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

FMRI Electrophysiology סימולטני במוח מכרסמים

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

תיוג DiOLISTIC של הנוירונים מפני מכרסמים שאינן פרוסות המוח האנושי הפרימאטים

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Non-לייזר מיקרוסקופית לכידת גישה עבור Microdissection של אזורים במוח דיסקרטית עכבר עבור בידוד RNA סך סידור Downstream הדור הבא והביטוי פרופיל גנטי

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

גידול בתאי גזע עצבי מאזורים קונבנציונליים ולא קונבנציונליים של המוח מכרסם מבוגרים

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

גבוהה פרופיל Proteome Synaptic החלטה כמותי של אזורים במוח העכבר לאחר למידה אפליה שמיעתית

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to deliver gene or cell therapy products. Unfortunately, current microinjection techniques use steel or glass needles that are suboptimal for multiple reasons: in particular, steel needles may cause tissue damage, and glass needles may bend when lowered deeply into the brain, missing the target region. In this article, we describe a protocol to prepare and use quartz needles that combine a number of useful features. These needles do not produce detectable tissue damage and, being very rigid, ensure reliable delivery in the desired brain region even when using deep coordinates. Moreover, it is possible to personalize the design of the needle by making multiple holes of the desired diameter. Multiple holes facilitate the injection of large amounts of solution within a larger area, whereas large holes facilitate the injection of cells. In addition, these quartz needles can be cleaned and re-used, such that the procedure becomes cost-effective.

We describe here a protocol for microinjection in the rodent brain that uses quartz needles. These needles do not produce detectable tissue damage and ensure reliable delivery even in deep regions. Moreover, they can be adapted to research needs by personalized designs and can be re-used.

מחטים מותאמים אישית עבור Microinjections במוח מכרסמים

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

לייזר מונחה אטלס סטיאוטטי ללכוד את Microdissection של אזורים במוח מושפע פציעה טראומטית

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

הערכה של צפיפות סינפסה פרוסות המוח מכרסמים בהיפוקמפוס

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...