Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NIH, DA043982 og DA046196.

Dyr som brukes i denne studien ble behandlet på en etisk og human måte som fastsatt av Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) og National Institutes of Health (NIH) retningslinjer.
MERK: Alle verktøy og overflater skal vaskes med et passende løsningsmiddel for å fjerne nukleone18 før du starter noe arbeid.
1. Lagring av hjerner
<ol><li>Fjern raskt hjernen fra eutaniserte voksne CD1 wildtype mus som ve...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Dette arbeidet beskriver en teknikk for å isolere små, spesifikke områder av hjernen samtidig som de begrenser nedbrytning av nukleinsyre og protein. Skade på hjernevev skjer raskt når en organisme dør. Dette skyldes delvis en rask oppbygging av ekstracellulær glutamat og den resulterende eksitotoksisiteten som oppstår21. Messenger RNA er spesielt utsatt for nedbrytning22,23. Nedbrytning av protein og nukleinsyre reduseres sterkt v...

Dette arbeidet illustrerer disseksjon av frosne hjerneregioner for utvinning av nukleinsyre eller protein av høy kvalitet ved hjelp av en referanse, for eksempel Allen Mouse Brain Atlas1, som en guide. I denne teknikken blir hjernen flash-frosset og lagret ved -80 °C for senere snitting og disseksjon mens de opprettholdes i frossen tilstand. Denne prosessen gjør det mulig for forskeren å høste et stort antall hjerner i en økt og senere dissekere dem for en nøyaktig samling av flere hjerneregioner.
Den nøyaktige samlingen av hjerneregioner av interesse (ROIer) er ofte nødvendig når du svarer på spørsmål knyttet til gen- og proteinuttrykk. Mens farmakologi, elektrofysiologi og optogenetikk kan brukes på villtype eller genmodifiserte gnagere for å bidra til å belyse molekylære endringer underbygge observert atferd2,3,4, målingen av induserte endringer i transkripsjoner og proteomer brukes ofte til å støtte disse funnene. Teknikker som kvantitativ omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (RT-qPCR), western blotting, RNAseq5, MAPSeq6 og HPLC7 er robuste og relativt lave i pris, slik at mange laboratorier kan studere indusertmolekylære endringer i små hjerneregioner2,4,5,6.
Det er flere måter å trekke ut og rense nukleinsyre eller protein fra hjerneregioner8,9,10,11,12. Mange laboratorier høster hjerneregioner ved å kjøle og kutte hjerner på is på tidspunktet for innhøsting9,13. Selv om denne tilnærmingen kan resultere i kjernesyre og protein av høy kvalitet, er det noe tidsbegrenset som nedbrytning i mikromiljøet i vevet kan finne sted ved disse temperaturene. Dette kan være spesielt sant når du prøver å dissekere et stort antall dyr eller ROIer i en sittende. Holde prøver frosset bidrar til å opprettholde labile målmolekyler samtidig som forskeren tid til å nøye sammenligne landemerker på begge sider av hver seksjon i arbeidet med å samle relativt rene prøver. Laserfangst er en annen måte å samle vev for RNA eller proteinanalyse fra hjerneområder10. Denne prosedyren er bedre enn mekanisk disseksjon ved at svært små og uregelmessig formede ROIer kan identifiseres og isoleres. Laserfangst er imidlertid begrenset av bruk av dyrt utstyr og reagenser, er tidkrevende og kan også være mer utsatt for prøvenedbrytning.
Mikropunch disseksjon på frosne vev er ikke nytt. Tidlige papirer av Miklos Palkovits og andre beskriver de grunnleggende teknikkene i detalj14,15. Denne presentasjonen følger i stor grad det opprinnelige arbeidet, med noen forbedringer for å lette effektiviteten og redusere kostnadene for utstyret som trengs. For eksempel er hjerneseksjoner laget i en frossen hjerneblokk i stedet for på en kryostat. Dette gir tykkere seksjoner som reduserer antall seksjoner som trengs for å samle inn avkastningsprøver. Denne metoden dissekerer også prøver på en frossen glassplate som sitter på tørris i en isolert boks. Dette gir en sub-frysing scenen på benken som å jobbe. Seksjoner dissekert på denne måten er lett manipuleres, slik at forskeren kan sammenligne begge sider av hver seksjon med en referanse for å begrense forurensning fra regioner utenfor ønsket avkastning.
Fordelene med denne protokollen er at 1) hjernen holdes i en frossen tilstand gjennom hele prosessen, noe som bidrar til å bevare protein og nukleinsyre og gir forskeren tid til å nøye høste ROIer, og 2) reagensene som kreves er billig og finnes i de fleste molekylærbiologilaboratorier. I denne prosessen er hele hjernen delt til 0,5–1,0 mm i en hjernematrise og plassert på en frossen glassplate som kontinuerlig avkjøles med tørris. Landemerker funnet i Allen Brain Atlas1 eller andre hjerneatlas16,brukes 17 til å identifisere områder av interesse, som deretter dissekeres ved hjelp av enten et kaldt slag eller skalpell. Fordi vevet aldri tines, gir regioner høstet på denne måten høy kvalitet RNA og protein for nedstrøms analyser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Etter hvert som vår forståelse av nevrobiologi har utviklet seg, utføres molekylære analyser ofte på små hjerneområder som medial prefrontal cortex (mPFC) eller nucleus accumbens. Utfordringen i dette arbeidet er å dissekere riktig område samtidig som mikromiljøet undersøkes. I denne artikkelen beskriver vi en enkel, rimelig metode ved hjelp av ressurser som er lett tilgjengelige i de fleste laboratorier. Denne metoden bevarer nukleinsyre og proteiner ved å holde vevet frosset gjennom hele prosessen. Hjernen er skåret i 0,5–1,0 mm seksjoner ved hjelp av en hjernematrise og ordnes på en frossen glassplate. Landemerker i hver del sammenlignes med en referanse, for eksempel Allen Mouse Brain Atlas, og regioner dissekeres ved hjelp av en kald skalpell eller biopsipunch. Vev lagres deretter ved -80 °C til bruk. Gjennom denne prosessen rotte og mus mPFC, nucleus accumbens, dorsal og ventral hippocampus og andre regioner har blitt vellykket analysert ved hjelp av qRT-PCR og vestlige analyser. Denne metoden er begrenset til hjerneregioner som kan identifiseres av klare landemerker.

For å validere denne metoden ble den mediale prefrontale cortex samlet inn fra voksne CD1 wildtype hannmus og RNA og protein ble ekstrahert og karakterisert. RNA ble analysert av kapillær elektroforese. Degradert RNA viser et tap i intensiteten av 28S og 18S ribosomal band og viser også nedbrytningsprodukter som et smør mellom 25 og 200 nukleotider (Figur 5A, eksempel 1). Rna av høy kvalitet viser distinkte ribosomale bånd med lite eller ingen signal i den lavere molekylvektregionen (<...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Denne prosedyren beskriver samlingen av diskrete frosne hjerneregioner for å oppnå protein av høy kvalitet og RNA ved hjelp av billige og allment tilgjengelige verktøy.

Samling av frosne gnagerhjerneregioner for nedstrøms analyser

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Denne prosedyren beskriver samlingen av diskrete frosne hjerneregioner for å oppnå protein og RNA av høy kvalitet ved hjelp av billige og allment tilgjengelige verktøy. Fordi hjerneregioner holdes frosset fra høst gjennom disseksjon, bevares målmolekyler og forskeren har tid til å nøye dissekere og lagre områder av interesse. Å identifisere interesseområder kan i utgangspunktet være utfordrende.Ved hjelp av vanlige hjernelandemerker som de dukker opp og går tilbake gjennom seksjonene i forhold til de ønskede regionene vil gjøre identifikasjon klart. Etter å ha fjernet hjernen fra eutaniserte voksne CD-1 villtypemus, fryse vevet i 60 sekunder i enten flytende nitrogen eller isopentane. Pre-chill med tørris og lagre den på minus 80 grader Celsius.24 timer før dissekere vevet, plasser en ren hjernematrise på en stabel med tinte frysepakker. Og smør sidene til matrisen mellom to frysepakker som sørger for å forlate omtrent en halv centimeter mellom bunnen av barberhøvelsporene og toppen av pakkene. Sett opp en frossen glassplate for disseksjonen ved å fylle en isolert boks med is opp til omtrent fem centimeter fra toppen.Legg deretter et 2,5 centimeter lag tørris på toppen. Og dekk den med svart plastfolie. Plasser en glassplate på toppen av plasten.Og tørris rundt grensen til platen. Fjern den frosne hjernematrisen fra fryseren og sett hjernen, cortex side opp, inn i matrisen. La vevet likevekte til temperaturen i boksen i 10 minutter.Holde lokket åpent i løpet av denne tiden. Bruk kalde tang til å justere hjernens posisjon i matrisen slik at sagittal sinus og tverrgående sinus linje opp med vinkelrett spor av blokken. Når hjernen er i posisjon, plasser et kjølt barberblad nær midten og trykk det omtrent en millimeter inn i vevet.Deretter plasserer du ett kjølt blad i hver ende av hjernen og trykker helt ned i matrisen. Begynn deretter å legge til kjølte blader i rostralenden, plassere dem i sporene en om gangen og forsiktig trykke dem en millimeter inn i vevet. Fortsett å legge til blader med ett millimeter intervaller, arbeider mot den kaudale enden.Når alle bladene er på plass, trykk ned på toppen med fingre, håndflate, eller en stump gjenstand og rock dem sakte fra side til side for å flytte dem gjennom vevet. Når bladene har nådd bunnen av sporene, ta tak i hver side av gruppen av blader og frigjøre dem fra matrisen ved å gynge frem og tilbake. Etter å ha frit gruppen av blader plassere dem rostral side opp på glassplaten, og sette tørris ved siden av eller på toppen av stabelen for å ytterligere fryse prøvene for enklere separasjon.Plasser deretter stabelen med skarpe kanter ned og skill bladene ved å flytte stabelen mellom tommelen og fingrene. Linje opp avsnittet på glassplatene fra rostral til caudal og skille vevet fra bladene ved å bøye dem mellom fingrene, eller ved å skille dem med et annet kjølt blad. Til tider kan vev holde seg til begge sider av et blad og det må tas hensyn til å opprettholde rostral til caudal orientering.Før du starter disseksjonen, åpner du Allen Mouse Brain Atlas eller en annen referanse og finner landemerkene som er nødvendige for å identifisere områder av interesse. Bruk kjølte tang eller blader til å vende seksjonen. Og sørg for at interesseregionen er konsistent i hele seksjonen.Skjær inn i seksjonen med en ren skalpell eller et slag, og skyv metallet forsiktig, men fast inn i vevet. Rocking det frem og tilbake for å gjøre kuttet. Etter høsting av interesseområdet, legg den i merkede forhåndskjølte 1,5 millimeter rør og lagre dem på minus 80 grader Celsius.For å behandle vevet, tilsett kald RIPA-buffer for proteinekstraksjon eller et guanidinium som inneholder løsningsmiddel for RNA-ekstraksjon og homogeniser det umiddelbart med en glassned eller mekanisk homogenisator. For å validere denne metoden ble den mediale prefrontale cortex samlet inn fra voksne CD-1 villtype hannmus, og RNA og protein ble karakterisert. Når analysert med kapillær elektroforese, degradert RNA viser et tap i intensiteten av 28S og 18S ribosomale bånd, samt et smør mellom 25 og 200 nukleotider.Mens RNA av høy kvalitet viser distinkte ribosomale bånd lite eller ingen signal i det nedre molekylvektsområdet. RNA oppnå ved hjelp av den frosne disseksjonsmetoden ble sammenlignet med RNA tilberedt av nyhøstet vev. Begge metodene produserer RNA med høye integritetstall og sterk ribosomal banding.For å bekrefte at denne metoden kan brukes til å bevare mikromiljøet av dissekert vev for senere analyse, ble RNA hentet fra dissekert mediale prefrontal cortex som hadde blitt lagret over flere uker. Alle prøvene produserte RNA av høy kvalitet med distinkt ribosomal banding og RNA-integritetstall over åtte. For å bekrefte proteinintegriteten til de frosne dissekerte prøvene ble proteinet samlet inn, overført til nitrocellulose og sonde med antistoff mot det høye molekylvektsmålet KCC2, og det lavere molekylvektsproteinet actin.I alle tilfeller var band skarpe og distinkte uten merkbare nedbrytningsprodukter. Det er viktig å holde vevet frosset gjennom hele prosessen, da dette bevarer mikromiljøet av seksjonene og opprettholder seksjonsmorfologi for sammenligning med hjerneatlasbilder. Regioner av interesse samlet på denne måten kan lagres i flere måneder ved negativ 80 grader Celsius og kan benyttes i mange nedstrøms applikasjoner, inkludert RT-qPCR, RNA-Seq, Western blot analyse, og HPLC.Denne metoden har blitt brukt til å utforske molekylære endringer i de limbiske systemene til perinatale gnagere utsatt for THC og andre cannabinoider for å bedre forstå hvordan disse stoffene kan påvirke hjernens utvikling.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Non-Laser Capture Mikroskopi Approach for mikrodisseksjon av Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation og nedstrøms Next-Generation Sekvensering og Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriske Analyser av netthinnens Seksjoner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Økende nevrale stamceller fra konvensjonelle og ikke-konvensjonelle Regions of Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagere sentralnervesystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

High Resolution Kvantitativ Synaptic Proteome Profilering av mus hjernen regioner Etter auditiv diskriminering Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Personlig pinner for Microinjections i gnager hjernen

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluering av Synapse tetthet i hippocampus gnager hjernen skiver

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...