Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelo NIH, DA043982 e DA046196.

Os animais utilizados neste estudo foram tratados de forma ética e humana, conforme estabelecido pelas diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) e institutos nacionais de saúde (NIH).
NOTA: Todas as ferramentas e superfícies devem ser lavadas com um solvente apropriado para remover as nucleases18 antes de iniciar qualquer trabalho.
1. Armazenar cérebros
<ol><li>Remova rapidamente os cérebros de camundongo...

<ol>
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Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Este trabalho descreve uma técnica para isolar pequenas regiões específicas do cérebro, limitando a degradação do ácido nucleico e da proteína. Danos aos tecidos cerebrais acontecem rapidamente quando um organismo morre. Isto deve-se, em parte, ao rápido acúmulo de glutamato extracelular e à excitotoxicidade resultante que ocorre21. O RNA mensageiro é particularmente vulnerável à degradação22,23. A discriminação de prote?...

Este trabalho ilustra a dissecção de regiões cerebrais congeladas para extração de ácido nucleico ou proteína de alta qualidade usando uma referência, como o Allen Mouse Brain Atlas1, como guia. Nesta técnica, os cérebros são congelados e armazenados a -80 °C para secção posterior e dissecção enquanto são mantidos em uma condição congelada. Esse processo permite ao pesquisador colher um grande número de cérebros em uma sessão e depois dissecá-los para uma coleta precisa de múltiplas regiões cerebrais.
A coleta precisa de regiões cerebrais de interesse (ROIs) é frequentemente necessária ao responder perguntas relacionadas à expressão genética e proteica. Enquanto a farmacologia, a eletrofisiologia e a optogenética podem ser usadas em roedores selvagens ou geneticamente modificados para ajudar a elucidar mudanças moleculares que sustentam comportamentos observados2,3,4, a medição de alterações induzidas em transcriptomas e proteomas é frequentemente usada para apoiar esses achados. Técnicas como a reação em cadeia de polimerase de transcrição reversa quantitativa (RT-qPCR), a mancha ocidental, RNAseq5,MAPSeq6 e HPLC7 são robustas e relativamente baixas de custo, permitindo que muitos laboratórios estudem alterações moleculares induzidas em pequenas regiões cerebrais22,4,5,6.
Existem várias maneiras de extrair e purificar o ácido nucleico ou proteína das regiões cerebrais8,,9,,10,,11,12. Muitos laboratórios colhem regiões cerebrais resfriando e cortando cérebros no gelo no momento da colheita9,13. Embora essa abordagem possa resultar em ácido nucleico e proteína de alta qualidade, é um pouco limitada, pois a degradação dentro do microambiente do tecido pode ocorrer a essas temperaturas. Isso pode ser particularmente verdadeiro ao tentar dissecar um grande número de animais ou ROIs em uma sessão. Manter amostras congeladas ajuda a manter moléculas alvo labile, ao mesmo tempo em que fornece ao pesquisador tempo para comparar cuidadosamente marcos em ambos os lados de cada seção no esforço de coletar amostras relativamente puras. A captura a laser é outra forma de coletar tecido para RNA ou análise de proteínas de áreas cerebrais10. Este procedimento é superior à dissecção mecânica em que os ROIs muito pequenos e de forma irregular podem ser identificados e isolados. No entanto, a captura a laser é limitada pelo uso de equipamentos caros e reagentes, é demorada e também pode ser mais suscetível à degradação da amostra.
A dissecção de microperfuração em tecidos congelados não é nova. Os primeiros trabalhos de Miklos Palkovits e outros descrevem as técnicas básicas em detalhes14,15. Esta apresentação segue em grande parte o trabalho original, com algumas melhorias para facilitar a eficiência e diminuir o gasto com os equipamentos necessários. Por exemplo, seções cerebrais são feitas em um bloco cerebral congelado em vez de em um criostato. Isso produz seções mais grossas, o que reduz o número de seções necessárias para coletar amostras de ROI. Este método também disseca amostras em uma placa de vidro congelada que se senta em gelo seco dentro de uma caixa isolada. Isso produz uma fase de subcongelamento no banco em que trabalhar. As seções dissecadas dessa forma são facilmente manipuladas, permitindo ao pesquisador comparar ambos os lados de cada seção com uma referência, a fim de limitar a contaminação de regiões fora do ROI desejado.
As vantagens deste protocolo são que 1) o cérebro é mantido em uma condição congelada durante todo o processo, o que ajuda a preservar proteína e ácido nucleico e dá ao pesquisador tempo para colher cuidadosamente os ROIs, e 2) os reagentes necessários são baratos e são encontrados na maioria dos laboratórios de biologia molecular. Nesse processo, cérebros inteiros são seccionados em 0,5-1,0 mm em uma matriz cerebral e colocados em uma placa de vidro congelada que é continuamente resfriada com gelo seco. Marcos encontrados no Atlas do Cérebro Allen1 ou em outros atlas cerebrais16,17 são usados para identificar regiões de interesse, que são então dissecadas usando um soco frio ou bisturi. Como o tecido nunca é descongelado, as regiões colhidas dessa forma fornecem RNA de alta qualidade e proteína para análises a jusante.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

À medida que nossa compreensão da neurobiologia progrediu, análises moleculares são frequentemente realizadas em pequenas áreas cerebrais, como o córtex pré-frontal medial (mPFC) ou núcleo accumbens. O desafio neste trabalho é dissecar a área correta, preservando o microambiente a ser examinado. Neste artigo, descrevemos um método simples e de baixo custo usando recursos prontamente disponíveis na maioria dos laboratórios. Este método preserva o ácido nucleico e as proteínas mantendo o tecido congelado durante todo o processo. Os cérebros são cortados em seções de 0,5 a 1,0 mm usando uma matriz cerebral e dispostos em uma placa de vidro congelada. Marcos dentro de cada seção são comparados a uma referência, como o Atlas do Cérebro do Rato Allen, e as regiões são dissecadas usando um bisturi frio ou um soco de biópsia. O tecido é então armazenado a -80 °C até o uso. Através desse processo, o mPFC de ratos e ratos, núcleo accumbens, hipocampo dorsal e ventral e outras regiões foram analisados com sucesso utilizando ensaios qRT-PCR e ocidentais. Este método está limitado a regiões cerebrais que podem ser identificadas por marcos claros.

Para validar esse método, o córtex pré-frontal medial foi coletado de camundongos machos adultos do tipo CD1 e RNA e proteína foram extraídos e caracterizados. O RNA foi analisado por eletroforese capilar. O RNA degradado apresenta uma perda na intensidade das bandas ribossômicas 28S e 18S e também mostra produtos de degradação como uma mancha entre 25 e 200 nucleotídeos(Figura 5A, amostra 1). O RNA de alta qualidade mostra bandas ribossômicas distintas com pouco ou nenhum sinal n...

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Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis.

Coleção de regiões cerebrais de roedores congelados para análises a jusante

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Este procedimento descreve a coleção de regiões cerebrais congeladas discretas para obter proteínas de alta qualidade e RNA usando ferramentas baratas e comumente disponíveis. Como as regiões cerebrais são mantidas congeladas da colheita através da dissecção, as moléculas-alvo são preservadas e o pesquisador tem tempo para dissecar cuidadosamente e armazenar regiões de interesse. Identificar regiões de interesse pode inicialmente ser um desafio.O uso de marcos cerebrais comuns à medida que emergem e recuam através das seções em relação às regiões desejadas, deixará a identificação clara. Depois de remover cérebros de camundongos adultos de CD-1, o flash congela o tecido por 60 segundos em nitrogênio líquido ou isopentane. Pré-frio com gelo seco e armazene-o a menos 80 graus Celsius.24 horas antes de dissecar o tecido, coloque uma matriz cerebral limpa em uma pilha de embalagens de congelador descongeladas. E sanduiche as laterais para a matriz entre dois pacotes de congelador certificando-se de deixar aproximadamente meio centímetro entre a parte inferior das ranhuras de barbear e a parte superior das embalagens. Configure uma placa de vidro congelada para a dissecção preenchendo uma caixa isolada com gelo até aproximadamente cinco centímetros do topo.Em seguida, coloque uma camada de 2,5 centímetros de gelo seco em cima. E cubra com lençóis plásticos pretos. Coloque uma placa de vidro em cima do plástico.E gelo seco ao redor das fronteiras da placa. Remova a matriz cerebral congelada do congelador e insira o cérebro, lado do córtex para cima, na matriz. Deixe o tecido equilibrar à temperatura da caixa por 10 minutos.Mantendo a tampa aberta durante este tempo. Use fórceps frios para ajustar a posição do cérebro na matriz para que o seio sagital e o seio transversal se alinhem com as ranhuras perpendiculares do bloco. Uma vez que o cérebro esteja em posição, coloque uma lâmina de barbear gelada perto de seu centro e pressione-a aproximadamente um milímetro no tecido.Em seguida, coloque uma lâmina gelada em cada extremidade do cérebro e pressione todo o caminho até a matriz. Em seguida, comece a adicionar lâminas geladas na extremidade rostral, colocando-as nas ranhuras uma de cada vez e pressionando-as suavemente um milímetro no tecido. Continue adicionando lâminas em intervalos de um milímetro, trabalhando em direção ao final caudal.Quando todas as lâminas estiverem no lugar, pressione para baixo em cima com os dedos, palma ou um objeto contundente e balance-as lentamente de um lado para o outro para movê-las através do tecido. Uma vez que as lâminas tenham atingido a parte inferior das ranhuras, segure cada lado do grupo de lâminas e liberte-as da matriz balançando para frente e para trás. Depois de liberar o grupo de lâminas coloque-os rostral lado para cima na placa de vidro, e coloque gelo seco ao lado ou em cima da pilha para congelar ainda mais as amostras para facilitar a separação.Em seguida, coloque a pilha com bordas afiadas para baixo e separe as lâminas deslocando a pilha entre o polegar e os dedos. Forque a seção das placas de vidro do rostral ao caudal e separe o tecido das lâminas flexionando-os entre os dedos, ou separando-os com uma segunda lâmina gelada. Às vezes, o tecido pode grudar em ambos os lados de uma lâmina e deve-se tomar cuidado para manter rostral à orientação caudal.Antes de iniciar a dissecção, abra o Allen Mouse Brain Atlas ou outra referência e encontre os marcos necessários para identificar regiões de interesse. Use fórceps ou lâminas geladas para virar a seção. E certifique-se de que a região de interesse seja consistente em toda a seção.Corte na seção com um bisturi limpo ou um soco, empurrando o metal suavemente, mas firmemente no tecido. Balançando para frente e para trás para fazer o corte. Depois de colher a região de interesse, coloque-a em tubos de 1,5 milímetros pré-refrigerados e armazene-os a menos 80 graus Celsius.Para processar o tecido, adicione tampão RIPA frio para extração de proteínas ou um guanidinium contendo solvente para extração de RNA e homogeneize-o imediatamente com uma queda de vidro ou homogeneizador mecânico. Para validar esse método, o córtex pré-frontal medial foi coletado de camundongos machos adultos do tipo CD-1, e o RNA e a proteína foram caracterizados. Quando analisado com eletroforese capilar, o RNA degradado apresenta uma perda na intensidade das bandas ribossômicas 28S e 18S, bem como uma mancha entre 25 e 200 nucleotídeos.Enquanto o RNA de alta qualidade mostra bandas ribossômicas distintas pouco ou nenhum sinal na região de menor peso molecular. O RNA obtido utilizando o método de dissecção congelado foi comparado com o RNA preparado a partir de tecido recém-colhido. Ambos os métodos produzem RNA com altos números de integridade e forte banda ribossômica.Para confirmar que este método pode ser usado para preservar o microambiente do tecido dissecado para análise posterior, o RNA foi extraído do córtex pré-frontal medial dissecado que havia sido armazenado ao longo de várias semanas. Todas as amostras produziram RNA de alta qualidade com distintas faixas ribossômicas e números de integridade de RNA acima de oito. Para confirmar a integridade proteica das amostras dissecadas congeladas, a proteína foi coletada, transferida para nitrocelulose e sonda com anticorpo contra o alvo de alto peso molecular KCC2, e a actina de proteína de menor peso molecular.Em todos os casos, as bandas eram nítidas e distintas, sem produtos de decomposição perceptíveis. É importante manter os tecidos congelados durante todo o processo, pois isso preserva o microambiente das seções e manter a morfologia da seção para comparação com as imagens do atlas cerebral. As regiões de interesse coletadas dessa forma podem ser armazenadas por vários meses a 80 graus Celsius negativos e podem ser utilizadas em muitas aplicações a jusante, incluindo RT-qPCR, RNA-Seq, western blot analysis e HPLC.Este método tem sido usado para explorar alterações moleculares dentro dos sistemas límbicos de roedores perinatais expostos ao THC e outros canabinóides para entender melhor como essas drogas podem afetar o desenvolvimento cerebral.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

FMRI simultânea e Eletrofisiologia no cérebro de roedores

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Neurociência

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Labeling DiOLISTIC de Neurônios de roedores e não-humanos fatias do cérebro do primata

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation de neurônios de fatias do cérebro de roedores para estudar a transmissão sináptica e Imagem Terminais pré-sináptica

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Laser não-Abordagem Microscopia de captura para o Microdissecção de regiões cerebrais discretas Mouse para isolamento de RNA total e Seqüenciamento Next-Generation Downstream e perfil de expressão gênica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Análises morfométricas de secções da retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Crescer a partir de células-tronco neurais convencionais e não convencionais Regiões do cérebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Alta resolução quantitativa Synaptic Proteome Profiling de rato regiões cerebrais Depois Auditivo Discriminação Aprendizagem

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Agulhas personalizadas para alevinos do cérebro de roedor

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Avaliação da densidade de sinapse em fatias Hippocampal cérebro de roedor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...