Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por los NIH, DA043982 y DA046196.

Los animales utilizados en este estudio fueron tratados de una manera ética y humana según lo establecido por las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Indiana y los Institutos Nacionales de Salud (NIH).
NOTA: Todas las herramientas y superficies deben lavarse con un disolvente adecuado para eliminar las nucleasas18 antes de comenzar cualquier trabajo.
1. Almacenar cerebros
<ol><li...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. 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J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Este trabajo describe una técnica para aislar pequeñas regiones específicas del cerebro mientras limita la degradación del ácido nucleico y la proteína. El daño a los tejidos cerebrales ocurre rápidamente una vez que un organismo muere. Esto se debe en parte a una rápida acumulación de glutamato extracelular y la excitotoxicidad resultante que se produce21. El ARN mensajero es particularmente vulnerable a la degradación22,23. La...

Este trabajo ilustra la disección de regiones cerebrales congeladas para la extracción de ácido nucleico o proteína de alta calidad utilizando una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas1, como guía. En esta técnica, los cerebros se congelan con flash y se almacenan a -80 oC para su posterior seccionamiento y disección mientras se mantienen en una condición congelada. Este proceso permite al investigador cosechar un gran número de cerebros en una sesión y luego diseccionarlos para una colección precisa de múltiples regiones cerebrales.
La recopilación precisa de regiones cerebrales de interés (ROI) a menudo es necesaria al responder preguntas relacionadas con la expresión de genes y proteínas. Mientras que la farmacología, electrofisiología y optogenética se pueden utilizar en roedores de tipo salvaje o modificados genéticamente para ayudar a dilucidar los cambios moleculares que sustentan los comportamientos observados2,3,4, la medición de los cambios inducidos en transcriptomes y proteomes se utiliza a menudo para apoyar estos hallazgos. Técnicas como la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa de transcripción inversa (RT-qPCR), la hincha occidental, el RNAseq5,el MAPSeq6 y el HPLC7 son robustos y relativamente bajos en costo, lo que permite a muchos laboratorios estudiar los cambios moleculares inducidos dentro de las regiones cerebrales pequeñas2,,4,5,6.
Hay varias maneras de extraer y purificar el ácido nucleico o proteína de las regiones cerebrales8,9,10,11,12. Muchos laboratorios cosechan regiones cerebrales enfriando y cortando cerebros en hielo en el momento de la cosecha9,13. Si bien este enfoque puede dar lugar a ácido nucleico y proteína de alta calidad, es algo limitado en el tiempo, ya que la degradación dentro del microambiente del tejido puede tener lugar a estas temperaturas. Esto puede ser particularmente cierto cuando se intenta diseccionar un gran número de animales o IRO en una sola sesión. Mantener las muestras congeladas ayuda a mantener las moléculas diana lábiles mientras que proporciona al investigador tiempo para comparar cuidadosamente puntos de referencia en ambos lados de cada sección en el esfuerzo por recoger muestras relativamente puras. La captura láser es otra forma de recolectar tejido para el análisis de ARN o proteínas de las áreas cerebrales10. Este procedimiento es superior a la disección mecánica en el que se pueden identificar y aislar ROI muy pequeños y de forma irregular. Sin embargo, la captura láser está limitada por el uso de costosos equipos y reactivos, consume mucho tiempo y también puede ser más susceptible a la degradación de la muestra.
La disección de micropundado en tejidos congelados no es nueva. Los primeros trabajos de Miklos Palkovits y otros describen las técnicas básicas en detalle14,15. Esta presentación sigue en gran medida el trabajo original, con algunas mejoras para facilitar la eficiencia y disminuir el gasto del equipo necesario. Por ejemplo, las secciones cerebrales se hacen en un bloqueo cerebral congelado en lugar de en un criostato. Esto produce secciones más gruesas que reduce el número de secciones necesarias para recoger muestras de ROI. Este método también disecciona muestras en una placa de vidrio congelado que se sienta en hielo seco dentro de una caja aislada. Esto produce una etapa de subcongelación en el banco en el que trabajar. Las secciones diseccionadas de esta manera son fácilmente manipulables, lo que permite al investigador comparar ambos lados de cada sección con una referencia con el fin de limitar la contaminación de regiones fuera del ROI deseado.
Las ventajas de este protocolo son que 1) el cerebro se mantiene en una condición congelada durante todo el proceso, lo que ayuda a preservar la proteína y el ácido nucleico y da al investigador tiempo para cosechar cuidadosamente los IRO, y 2) los reactivos requeridos son baratos y se encuentran en la mayoría de los laboratorios de biología molecular. En este proceso, los cerebros enteros se seccionan a 0.5–1.0 mm en una matriz cerebral y se colocan en una placa de vidrio congelado que se enfría continuamente con hielo seco. Los lugares de interés que se encuentran en el Allen Brain Atlas1 u otros atlas cerebrales16,17 se utilizan para identificar las regiones de interés, que luego se diseccionan usando un puñetazo frío o un bisturí. Debido a que el tejido nunca se descongela, las regiones cosechadas de esta manera proporcionan ARN y proteínades de alta calidad para análisis posteriores.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

A medida que nuestra comprensión de la neurobiología ha progresado, los análisis moleculares a menudo se realizan en pequeñas áreas cerebrales como la corteza prefrontal medial (mPFC) o núcleo accumbens. El reto de este trabajo es diseccionar el área correcta preservando al mismo tiempo el microambiente a examinar. En este artículo, describimos un método simple y de bajo costo utilizando recursos disponibles en la mayoría de los laboratorios. Este método preserva el ácido nucleico y las proteínas manteniendo el tejido congelado durante todo el proceso. Los cerebros se cortan en secciones de 0,5-1,0 mm usando una matriz cerebral y dispuestos en una placa de vidrio congelado. Las marcas de interés dentro de cada sección se comparan con una referencia, como el Allen Mouse Brain Atlas, y las regiones se diseccionan usando un bisturí frío o un punzón de biopsia. A continuación, el tejido se almacena a -80 oC hasta su uso. A través de este proceso mPFC de rata y ratón, núcleo accumbens, hipocampo dorsal y ventral y otras regiones se han analizado con éxito utilizando qRT-PCR y ensayos occidentales. Este método se limita a las regiones cerebrales que se pueden identificar por puntos de referencia claros.

Para validar este método, la corteza prefrontal medial se recogió de ratones machos de tipo salvaje CD1 adultos y ARN y proteínas fueron extraídos y caracterizados. El ARN fue analizado por electroforesis capilar. El ARN degradado muestra una pérdida en la intensidad de las bandas ribosomales 28S y 18S y también muestra los productos de degradación como un frotis entre 25 y 200 nucleótidos(Figura 5A,muestra 1). ARN de alta calidad muestra bandas ribosomales distintas con poca o ningu...

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Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles.

Colección de regiones cerebrales de roedores congelados para análisis posteriores

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Este procedimiento describe la recolección de regiones cerebrales congeladas discretas para obtener proteínas y ARN de alta calidad utilizando herramientas baratas y comúnmente disponibles. Debido a que las regiones cerebrales se mantienen congeladas de la cosecha a través de la disección, las moléculas diana se conservan y el investigador tiene tiempo para diseccionar y almacenar cuidadosamente las regiones de interés. Identificar regiones de interés puede ser inicialmente difícil.El uso de puntos de referencia cerebral comunes a medida que surgen y retroceden a través de las secciones en relación con las regiones deseadas hará que la identificación sea clara. Después de eliminar los cerebros de ratones adultos eutanizados de tipo salvaje CD-1, congelar el tejido durante 60 segundos en nitrógeno líquido o isopentano. Pre-enfriar con hielo seco y almacenarlo en menos 80 grados Celsius.24 horas antes de diseccionar el tejido, coloque una matriz cerebral limpia en una pila de paquetes de congelador descongelados. Y empareje los lados a la matriz entre dos paquetes de congelador asegurándose de dejar aproximadamente medio centímetro entre la parte inferior de las ranuras de afeitar y la parte superior de los paquetes. Configure una placa de vidrio congelada para la disección llenando una caja aislada con hielo hasta aproximadamente cinco centímetros desde la parte superior.A continuación, coloque una capa de 2,5 centímetros de hielo seco en la parte superior. Y cúbrelo con láminas de plástico negro. Coloque una placa de vidrio encima del plástico.Y hielo seco alrededor de los bordes de la placa. Retire la matriz cerebral congelada del congelador e inserte el cerebro, del lado de la corteza hacia arriba, en la matriz. Deje que el tejido se equilibre a la temperatura de la caja durante 10 minutos.Mantener la tapa abierta durante este tiempo. Utilice fórceps fríos para ajustar la posición del cerebro en la matriz de modo que el seno sagital y el seno transversal se alineen con las ranuras perpendiculares del bloque. Una vez que el cerebro esté en posición, coloque una cuchilla de afeitar fría cerca de su centro y presione aproximadamente un milímetro en el tejido.A continuación, coloca una hoja fría en cada extremo del cerebro y presiona hasta abajo en la matriz. Luego comience a agregar cuchillas refrigeradas en el extremo rostral, colocándolas en las ranuras de una en una y presionando suavemente un milímetro en el tejido. Continúe agregando cuchillas a intervalos de un milímetro, trabajando hacia el extremo caudal.Cuando todas las cuchillas estén en su lugar, presione hacia abajo en la parte superior con los dedos, la palma de la mano o un objeto contundente y mece lentamente de lado a lado para moverlas a través del tejido. Una vez que las cuchillas hayan llegado a la parte inferior de las ranuras, agarre cada lado del grupo de cuchillas y libéntelas de la matriz balanceándose hacia adelante y hacia atrás. Después de liberar el grupo de cuchillas colocarlos lado rostral hacia arriba en la placa de vidrio, y poner hielo seco al lado o en la parte superior de la pila para congelar aún más las muestras para una separación más fácil.A continuación, coloque la pila con bordes afilados hacia abajo y separe las cuchillas desplazando la pila entre el pulgar y los dedos. Alinee la sección en las placas de vidrio de rostral a caudal y separe el tejido de las cuchillas flexionándolas entre los dedos, o separándolas con una segunda hoja refrigerada. A veces, el tejido puede adherirse a ambos lados de una cuchilla y se debe tener cuidado para mantener la orientación rostral a caudal.Antes de iniciar la disección, abra Allen Mouse Brain Atlas u otra referencia y encuentre los puntos de referencia necesarios para identificar las regiones de interés. Utilice fórceps o cuchillas refrigeradas para voltear la sección. Y asegúrese de que la región de interés sea coherente en toda la sección.Cortar en la sección con un bisturí limpio o un puñetazo, empujando el metal suavemente pero firmemente en el tejido. Mecándolo de un lado a otro para hacer el corte. Después de cosechar la región de interés, colóquela en tubos pre-refrigerados de 1,5 milímetros etiquetados y guárdelos a menos 80 grados Centígrados.Para procesar el tejido, agregue el tampón RIPA frío para la extracción de proteínas o un disolvente que contenga guanidinio para la extracción de ARN y homogeneice inmediatamente con un desgarro de vidrio o un homogeneizador mecánico. Para validar este método, la corteza prefrontal medial se recogió de ratones macho adultos de tipo salvaje CD-1, y se caracterizaron arneses y proteínas. Cuando se analiza con electroforesis capilar, el ARN degradado muestra una pérdida en la intensidad de las bandas ribosomales 28S y 18S, así como un frotis entre 25 y 200 nucleótidos.Mientras que el ARN de alta calidad muestra bandas ribosomales distintas poca o ninguna señal en la región de menor peso molecular. El ARN obtenido utilizando el método de disección congelada se comparó con ARN preparado a partir de tejido recién cosechado. Ambos métodos producen ARN con altos números de integridad y bandas ribosomales fuertes.Para confirmar que este método se puede utilizar para preservar el microambiente del tejido diseccionado para su posterior análisis, el ARN se extrajo de la corteza prefrontal medial diseccionada que se había almacenado durante varias semanas. Todas las muestras produjeron ARN de alta calidad con bandas ribosomales distintas y números de integridad del ARN por encima de ocho. Para confirmar la integridad proteica de las muestras diseccionadas congeladas, se recogió la proteína, se transfirió a la nitrocelulosa y la sonda con anticuerpos contra el objetivo de alto peso molecular KCC2, y la actina de proteína de menor peso molecular.En todos los casos las bandas eran afiladas y distintas, sin productos de descomposición discernibles. Es importante mantener los tejidos congelados durante todo el proceso, ya que esto preserva el microambiente de las secciones y mantiene la morfología de la sección para la comparación con las imágenes del atlas cerebral. Las regiones de interés recogidas de esta manera se pueden almacenar durante varios meses a 80 grados Celsius negativos y se pueden utilizar en muchas aplicaciones posteriores, incluyendo RT-qPCR, RNA-Seq, análisis de manchas occidentales y HPLC.Este método se ha utilizado para explorar los cambios moleculares dentro de los sistemas límbicos de roedores perinatales expuestos a THC y otros cannabinoides para entender mejor cómo estos fármacos pueden afectar el desarrollo cerebral.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

FMRI simultánea y electrofisiología en el cerebro de roedores

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Investigación

Neurociencias

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation de las neuronas del cerebro de roedores Rodajas para el Estudio de la transmisión sináptica y la imagen terminales presinápticos

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Los análisis morfométricos de las Secciones de retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Alta Resolución cuantitativa Synaptic proteoma perfiles de cerebro de ratón Regiones Después de discriminación auditiva de aprendizaje

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedor

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Evaluación de la densidad de sinapsis en rebanadas de hipocampo cerebral de roedor

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