Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH, DA043982 och DA046196.

Djur som används i denna studie behandlades på ett etiskt och humant sätt som anges av Indiana University's Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) och National Institutes of Health (NIH) riktlinjer.
OBS: Alla verktyg och ytor ska tvättas med ett lämpligt lösningsmedel för att avlägsna nukleaser18 innan något arbete påbörjas.
1. Förvaring av hjärnor
<ol><li>Ta snabbt bort hjärnorna från avlivade vuxna CD1-vildtyps...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Detta arbete beskriver en teknik för att isolera små, specifika regioner i hjärnan samtidigt begränsa nedbrytning av nukleinsyra och protein. Skador på hjärnvävnader sker snabbt när en organism dör. Detta beror delvis på en snabb uppbyggnad av extracellulär glutamat och den resulterande excitotoxikrititet som uppstår21. Messenger RNA är särskilt sårbara för nedbrytning22,23. Nedbrytning av protein och nukleinsyra reduceras ...

Detta arbete illustrerar dissekering av frysta hjärnregioner för utvinning av högkvalitativ nukleinsyra eller protein med hjälp av en referens, såsom Allen Mouse Brain Atlas1, som en guide. I denna teknik är hjärnor flashfrysta och lagras vid -80 °C för senare snittning och dissekering samtidigt som de hålls i fruset tillstånd. Denna process gör det möjligt för forskaren att skörda ett stort antal hjärnor i en session och senare dissekera dem för en korrekt samling av flera hjärnregioner.
Korrekt insamling av hjärnregioner av intresse (ROIs) krävs ofta när man svarar på frågor relaterade till gen- och proteinuttryck. Medan farmakologi, elektrofysiologisk och optogenetik kan användas på vildtyp eller genetiskt modifierade gnagare för att belysa molekylära förändringar som ligger till grund för observerade beteenden2,3,4, är mätning av inducerade förändringar i transkriptom och proteomer ofta används för att stödja dessa resultat. Tekniker som kvantitativ omvänd transkription polymeras kedjereaktion (RT-qPCR), västra blotting, RNAseq5, MAPSeq6 och HPLC7 är robusta och relativt låg i kostnad, vilket gör att många laboratorier att studera inducerad molekylära förändringar inom små hjärnregioner2,4,5,6.
Det finns flera sätt att extrahera och rena nukleinsyra eller protein frånhjärnregionerna 8,,9,,10,,11,12. Många laboratorier skörda hjärnan regioner genom kylning och skära hjärnor på is vid tidpunkten för skörden9,13. Även om detta tillvägagångssätt kan resultera i hög kvalitet nukleinsyra och protein, det är något tidsbegränsad som nedbrytning inom mikromiljön av vävnaden kan äga rum vid dessa temperaturer. Detta kan vara särskilt sant när man försöker dissekera ett stort antal djur eller rois i ett sammanträde. Att hålla prover frysta hjälper till att upprätthålla labila målmolekyler samtidigt som forskaren tid att noggrant jämföra landmärken på båda sidor av varje avsnitt i arbetet med att samla relativt rena prover. Laseravskiljning är ett annat sätt att samla vävnad för RNA eller proteinanalys från hjärnan områden10. Detta förfarande är överlägsen mekanisk dissekering i att mycket små och oregelbundet formade ROIs kan identifieras och isoleras. Laseravskiljning begränsas dock av användning av dyr utrustning och reagenser, är tidskrävande och kan också vara mer mottagliga för provförsämring.
Mikrospänndissektion på frusna vävnader är inte ny. Tidiga papper av Miklos Palkovits och andra beskriver de grundläggande teknikerna i detalj14,15. Denna presentation följer till stor del det ursprungliga arbetet, med vissa förbättringar för att underlätta effektivitet och minska kostnaderna för den utrustning som behövs. Till exempel, hjärnan delar görs i en frusen hjärna block snarare än på en cryostat. Detta ger tjockare sektioner som minskar antalet avsnitt som behövs för att samla in ROI-prover. Denna metod dissekerar också prover på en frusen glasplatta som sitter på torris i en isolerad låda. Detta ger en underfrysning skede på bänken för att arbeta. Avsnitt som dissekeras på detta sätt är lätta att manipulera, vilket gör det möjligt för forskaren att jämföra båda sidor av varje avsnitt med en referens för att begränsa kontaminering från regioner utanför den önskade avkastningen på sysselsatt kapital.
Fördelar med detta protokoll är att 1) hjärnan hålls i ett fruset tillstånd under hela processen, vilket hjälper till att bevara protein och nukleinsyra och ger forskaren tid att noggrant skörda ROIs, och 2) reagenser som krävs är billiga och finns i de flesta molekylärbiologiska laboratorier. I denna process, hela hjärnor är sektionerade till 0,5-1,0 mm i en hjärna matris och placeras på en frusen glasplatta som kontinuerligt kyls med torris. Landmärken som finns i Allen Brain Atlas1 eller andra hjärnatlass16,17 används för att identifiera regioner av intresse, som sedan dissekeras med antingen en kall punch eller skalpell. Eftersom vävnaden aldrig tinas, regioner som skördas på detta sätt ger hög kvalitet RNA och protein för nedströms analyser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Som vår förståelse av neurobiologi har utvecklats, molekylära analyser utförs ofta på små hjärnan områden såsom den mediala prefrontala cortex (mPFC) eller kärnan accumbens. Utmaningen i detta arbete är att dissekera rätt område samtidigt som den mikromiljö som ska undersökas bevaras. I det här dokumentet beskriver vi en enkel, billig metod med resurser som är lätt tillgängliga i de flesta laboratorier. Denna metod bevarar nukleinsyra och proteiner genom att hålla vävnaden fryst under hela processen. Hjärnor skärs i 0,5–1,0 mm sektioner med hjälp av en hjärnmatris och är ordnade på en frusen glasplatta. Landmärken inom varje avsnitt jämförs med en referens, till exempel Allen Mouse Brain Atlas, och regioner dissekeras med en kall skalpell eller biopsi punch. Vävnad lagras sedan vid -80 °C tills den används. Genom denna process råtta och mus mPFC, nucleus accumbens, dorsala och ventrala hippocampus och andra regioner har framgångsrikt analyserats med qRT-PCR och västerländska analyser. Denna metod är begränsad till hjärnan regioner som kan identifieras av tydliga landmärken.

För att validera denna metod, den mediala prefrontala cortex samlades in från vuxna CD1 wildtype manliga möss och RNA och protein extraherades och karakteriserades. RNA analyserades av kapillär elektrofores. Degraderad RNA visar en förlust i intensiteten hos ribosomala banden 28S och 18S och visar även nedbrytningsprodukter som ett utstryk mellan 25 och 200 nukleotider (figur 5A, prov 1). RNA av hög kvalitet visar distinkta ribosomala band med liten eller ingen signal i området med l...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Detta förfarande beskriver insamling av diskreta frysta hjärnan regioner för att få högkvalitativt protein och RNA med hjälp av billiga och allmänt tillgängliga verktyg.

Insamling av frysta gnagare hjärnregioner för nedströms analyser

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Detta förfarande beskriver insamling av diskreta frysta hjärnan regioner för att få högkvalitativt protein och RNA med hjälp av billiga och allmänt tillgängliga verktyg. Eftersom hjärnan regioner hålls frysta från skörd genom dissekering, målmolekyler bevaras och forskaren har tid att noggrant dissekera och lagra regioner av intresse. Att identifiera intresseområden kan till en början vara en utmaning.Med hjälp av vanliga hjärnan landmärken när de dyker upp och avta genom avsnitten i förhållande till de önskade regionerna kommer att göra identifiering klart. Efter att ha tagit bort hjärnor från avlivade vuxna CD-1 vilda typ möss, flash frysa vävnaden i 60 sekunder i antingen flytande kväve eller isopentan. Pre-chill med torris och förvara den på minus 80 grader Celsius.24 timmar innan du dissekerar vävnaden, placera en ren hjärnmatris på en bunt tinade frysförpackningar. Och smörgås sidorna till matrisen mellan två frys förpackningar se till att lämna ungefär en halv centimeter mellan botten av rakhyveln slots och toppen av förpackningarna. Sätt upp en frusen glasplatta för dissektionen genom att fylla en isolerad låda med is upp till cirka fem centimeter från toppen.Placera sedan ett 2,5 centimeters lager av torris ovanpå. Och täck den med svart plastfolie. Placera en glasskiva ovanpå plasten.Och torris runt plattans gränser. Ta bort den frusna hjärnmatrisen från frysen och sätt in hjärnan, cortexsidan upp, i matrisen. Låt vävnaden ekvilo till temperaturen i lådan i 10 minuter.Att hålla locket öppet under denna tid. Använd kalla tympor för att justera hjärnans position i matrisen så att sagittal sinus och tvärgående sinus linje upp med de vinkelräta spåren i blocket. När hjärnan är i position, placera ett kylt rakblad nära dess centrum och tryck den ungefär en millimeter i vävnaden.Därefter placerar du ett kylt blad i varje ände av hjärnan och trycker hela vägen ner i matrisen. Börja sedan lägga till kylda blad i den rostrala änden, placera dem i slitsarna en i taget och försiktigt trycka dem en millimeter i vävnaden. Fortsätt att lägga till blad med en millimeter intervall, arbetar mot caudal slutet.När alla blad är på plats, tryck ner på toppen med fingrar, handflata, eller ett trubbigt föremål och klippa dem långsamt från sida till sida för att flytta dem genom vävnaden. När bladen har nått botten av slitsarna, ta tag i varje sida av gruppen av blad och befria dem från matrisen genom att gunga fram och tillbaka. Efter att frigöra gruppen av blad placera dem rostrala sidan upp på glasplattan, och sätta torris bredvid eller ovanpå stapeln för att ytterligare frysa proverna för enklare separation.Placera sedan stapeln med skarpa kanter nedåt och separera bladen genom att flytta stacken mellan tummen och fingrarna. Rada upp avsnittet på glasplattorna från rostral till caudal och separera vävnaden från bladen genom att böja dem mellan fingrarna, eller genom att separera dem med en andra kyld klinga. Ibland kan vävnad fastna på båda sidor av ett blad och försiktighet måste vidtas för att upprätthålla rostral till caudal orientering.Innan dissekeringen påbörjas öppnar du Allen Mouse Brain Atlas eller en annan referens och hittar de landmärken som krävs för att identifiera intresseområden. Använd kylda tyfningar eller blad för att vända avsnittet. Och se till att den region av intresse är konsekvent i hela avsnittet.Skär i avsnittet med en ren skalpell eller en punch, trycka metallen försiktigt men stadigt i vävnaden. Gunga den fram och tillbaka för att göra snittet. Efter skörd regionen av intresse, placera den i märkta pre-kylda 1,5 millimeter rör och lagra dem på minus 80 grader Celsius.För att bearbeta vävnaden, tillsätt kall RIPA-buffert för proteinutvinning eller ett guanidinium som innehåller lösningsmedel för RNA-extraktion och omedelbart homogenisera den med en glasdyr eller mekanisk homogenisator. För att validera denna metod, den mediala prefrontal cortex samlades in från vuxna CD-1 vilda typ handjur möss och RNA och protein kännetecknades. När analyseras med kapillärelektrofores, visar degraderad RNA en förlust i intensiteten av 28S och 18S ribosomala band, samt ett utstryk mellan 25 och 200 nukleotider.Medan högkvalitativa RNA visar distinkta ribosomala band liten eller ingen signal i den lägre molekylvikt regionen. RNA erhåller med hjälp av den frysta dissekeringsmetoden jämfördes med RNA som beretts från nyskördad vävnad. Båda metoderna producerar RNA med hög integritet nummer och starka ribosomal banding.För att bekräfta att denna metod kan användas för att bevara mikromiljö av dissekerad vävnad för senare analys, extraherades RNA från dissekeras medial prefrontala cortex som hade lagrats under flera veckor. Alla prover producerade högklassiga RNA med distinkta ribosomala banding och RNA integritet nummer över åtta. För att bekräfta protein integritet av de frysta dissekerade proverna, proteinet samlades in, överförs till nitrocellulosa och sond med antikroppar mot den höga molekylvikt mål KCC2, och den lägre molekylvikt protein aktin.I samtliga fall band var skarpa och distinkta med några urskiljbara uppdelning produkter. Det är viktigt att hålla vävnaderna frysta under hela processen eftersom detta bevarar mikromiljö av avsnitten och upprätthålla avsnitt morfologi för jämförelse med hjärnan atlas bilder. Regioner av intresse som samlas in på detta sätt kan lagras i flera månader vid negativ 80 grader Celsius och kan utnyttjas i många nedströms applikationer, inklusive RT-qPCR, RNA-Seq, Western blot analys, och HPLC.Denna metod har använts för att utforska molekylära förändringar inom de limbiska systemen hos perinatala gnagare som exponeras för THC och andra cannabinoider för att bättre förstå hur dessa läkemedel kan påverka hjärnans utveckling.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Samtidig fMRI och elektrofysiologi hos gnagare Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Vibrodissociation av nervceller från Slices Gnagare Brain att studera synaptisk transmission och bild Presynaptiska Terminaler

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Icke-Laser Capture Mikroskopi metoden för Microdissection diskreta Regioner Mouse Brain för Total RNA Isolering och nedströms nästa generations sekvensering och Gene expression profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morfometriska Analyser av näthinnans avsnitt

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Växande neurala stamceller från konventionella och icke-konventionella Regioner av vuxen Gnagare Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo optogenetic Stimulering av gnagare centrala nervsystemet

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

Hög upplösning Kvantitativ Synaptic Proteome Profilering av Regioner Mouse Brain Efter Auditory Diskriminering Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Personlig nålar för Microinjections i gnagare hjärnan

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Utvärdering av synaps densitet i hippocampus gnagare hjärnan skivor

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...