Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Bu çalışma NIH, DA043982 ve DA046196 tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergeleri tarafından belirlenen etik ve insancıl bir şekilde ele alındı.
NOT: Tüm aletler ve yüzeyler, herhangi bir işe başlamadan önce18 nükleazları çıkarmak için uygun bir çözücü ile yıkanmalıdır.
1. Beyinlerin depolanması
<ol><li>Geleneksel bir yaklaşım<sup cla...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Bu çalışma, nükleik asit ve protein ingradasyonunu sınırlandırırken beynin küçük, belirli bölgelerini izole etme tekniğini tanımlar. Bir organizma öldüğünde beyin dokularına zarar hemen gerçekleşir. Bu kısmen ekstrasellüler glutamat hızlı birikme ve21oluşur sonucu eksitotoksisite kaynaklanmaktadır. Messenger RNA özellikle bozulmaya karşı savunmasızdır 22,23. Protein ve nükleik asit dökümü büyük ölçü...

Bu çalışma, bir rehber olarak Allen Mouse Beyin Atlası1gibi bir referans kullanarak yüksek kaliteli nükleik asit veya protein çıkarılması için dondurulmuş beyin bölgelerinin diseksiyon göstermektedir. Bu teknikte beyinler flaş dondurulmuş ve dondurulmuş bir durumda muhafaza edilirken daha sonra kesit ve diseksiyon için -80 °C'de saklanır. Bu süreç araştırmacı bir oturumda beyin çok sayıda hasat ve daha sonra birden fazla beyin bölgeleri doğru bir koleksiyon için onları incelemek için izin verir.
Gen ve protein ekspresyonu ile ilgili soruları yanıtlarken genellikle beyin bölgelerinin (ROI) doğru toplanması gereklidir. Farmakoloji, elektrofizyoloji ve optogenetik yabani tip veya genetiği değiştirilmiş kemirgenler üzerinde gözlenen davranışları destekleyen moleküler değişikliklerin aydınlatılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir iken2,3,4, transkripsiyon ve proteomlarda indüklenen değişikliklerin ölçümü genellikle bu bulguları desteklemek için kullanılır. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), batı lekeleme, RNAseq5,MAPSeq6 ve HPLC7 gibi teknikler sağlam ve nispeten düşük maliyet, birçok laboratuvarküçük beyin bölgeleri içinde indüklenen moleküler değişiklikleri incelemek için izin2,4,5,6.
Beyin bölgelerinden nükleik asit veya protein ayıklamak ve arındırmak için çeşitli yollar vardır8,9,10,11,12. Birçok laboratuvarlar hasat sırasında buz üzerinde beyinleri dondurup keserek beyin bölgelerini hasat eder9,13. Bu yaklaşım yüksek kaliteli nükleik asit ve proteine yol açsa da, bu sıcaklıklarda dokunun mikro ortamında bozulma olabileceğinden biraz zaman sınırlıdır. Bu özellikle bir oturuşta çok sayıda hayvanı veya ROI'yi incelemeye çalışırken doğru olabilir. Numuneleri dondurulmuş tutmak, araştırmacıya nispeten saf numuneler toplama çabasında her bölümün her iki tarafındaki simgeleri dikkatle karşılaştırması için zaman sağlarken, labile hedef moleküllerinin korunmasına yardımcı olur. Lazer yakalama beyin bölgelerinden RNA veya protein analizi için doku toplamak için başka bir yoldur10. Bu işlem, çok küçük ve düzensiz şekilli ROI'ların tespit edilip izole edilebildiği mekanik diseksiyondan daha üstündür. Ancak, lazer yakalama pahalı ekipman ve reaktiflerin kullanımı ile sınırlıdır, zaman alıcı ve aynı zamanda örnek bozulmasına daha duyarlı olabilir.
Dondurulmuş dokularda mikropunch diseksiyonu yeni değildir. Miklos Palkovits ve diğerleri tarafından erken kağıtları ayrıntılı olarak temel teknikleri açıklamak14,15. Bu sunum büyük ölçüde verimliliği kolaylaştırmak ve gerekli ekipman giderini azaltmak için bazı iyileştirmeler ile, orijinal çalışma izler. Örneğin, beyin bölümleri dondurulmuş beyin bloğu yerine bir kriyostat yapılır. Bu, yatırım getirisi örnekleri toplamak için gereken kesit sayısını azaltan daha kalın bölümler üretir. Bu yöntem aynı zamanda yalıtılmış bir kutu içinde kuru buz üzerinde oturur dondurulmuş cam plaka üzerinde örnekleri inceler. Bu, üzerinde çalışmak için tezgah bir alt donma aşaması üretir. Bu şekilde incelenen bölümler kolayca manipüle edilebilir, böylece araştırmacı her bölümün her iki tarafını da istenilen Yatırım Getirisi dışındaki bölgelerden gelen kontaminasyonu sınırlamak için bir referansla karşılaştırmak için.
Bu protokolün avantajları 1) beyin protein ve nükleik asit korunmasına yardımcı olur ve dikkatle ROI hasat için araştırmacı zaman verir ve 2) gerekli reaktifler ucuz ve en moleküler biyoloji laboratuarlarında bulunan süreç boyunca dondurulmuş bir durumda tutulur. Bu süreçte, tüm beyinler bir beyin matris0.5-1.0 mm kesitli ve sürekli kuru buz ile soğutulmuş bir dondurulmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Allen BeyinAtlası bulunan Yerler 1 veya diğer beyin atlasları16,17 ilgi bölgelerini tanımlamak için kullanılır, hangi sonra soğuk bir yumruk veya neşter kullanılarak kesilir. Doku asla çözülmemedığından, bu şekilde hasat edilen bölgeler, downstream analizleri için yüksek kaliteli RNA ve protein sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Nörobiyoloji anlayışımız ilerledikçe, moleküler analizler genellikle medial prefrontal korteks (mPFC) veya nükleus accumbens gibi küçük beyin bölgelerinde yapılır. Bu çalışmada sorun incelenecek mikroortamı korurken doğru alanı incelemektir. Bu yazıda, çoğu laboratuvarda kolayca bulunan kaynakları kullanarak basit, düşük maliyetli bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, işlem boyunca doku dondurulmuş tutarak nükleik asit ve proteinleri korur. Beyinler bir beyin matrisi kullanılarak 0.5-1.0 mm kesitler halinde kesilir ve donmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Her bölümdeki yerler Allen Mouse Beyin Atlası gibi bir referansla karşılaştırılır ve bölgeler soğuk neşter veya biyopsi yumruğu kullanılarak kesilir. Doku daha sonra kullanıma kadar -80 °C'de saklanır. Bu işlem sayesinde sıçan ve fare mPFC, nucleus accumbens, dorsal ve ventral hipokampus ve diğer bölgelerde başarıyla qRT-PCR ve Batı tahlilleri kullanılarak analiz edilmiştir. Bu yöntem açık yerler tarafından tespit edilebilir beyin bölgeleri ile sınırlıdır.

Bu yöntemi doğrulamak için medial prefrontal korteks erişkin CD1 wildtype erkek farelerden toplanmış ve RNA ve protein elde edilmiştir. RNA kapiller elektroforez ile analiz edildi. Bozulmuş RNA, 28S ve 18S ribozomal bantların yoğunluğunda bir kayıp gösterir ve ayrıca 25 ile 200 nükleotit arasında yayma olarak bozunma ürünlerini gösterir(Şekil 5A, örnek 1). Yüksek kaliteli RNA, düşük molekül ağırlıklı bölgede çok az veya hiç sinyal olmayan belirgin ribozomal b...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar. Beyin bölgeleri diseksiyon yoluyla hasattan dondurulmuş tutulduğundan, hedef moleküller korunur ve araştırmacının ilgi çekici bölgeleri dikkatlice incelemek ve depolamak için zamanı vardır. İlgi çekici bölgelerin belirlenmesi başlangıçta zor olabilir.Onlar ortaya çıktıve istenilen bölgelere göre bölümleri ile geri çekerken ortak beyin işaretleri kullanarak kimlik açık hale getirecektir. Ötenazi yetişkin CD-1 vahşi tip farelerden beyinleri çıkardıktan sonra, flaş sıvı nitrojen veya isopentane içinde 60 saniye boyunca doku dondurun. Kuru buz ile önceden soğutun ve eksi 80 santigrat derece saklayın.Dokuyu incelemeden 24 saat önce, çözülmüş dondurucu paketleri yığınına temiz bir beyin matrisi yerleştirin. Ve iki dondurucu paketleri arasında matris kenarları sandviç jilet yuvalarının alt ve paketlerinin üst arasında yaklaşık yarım santimetre bırakmak emin olun. Üstten yaklaşık beş santimetreye kadar buz ile yalıtılmış bir kutu doldurarak diseksiyon için dondurulmuş bir cam plaka ayarlayın.Sonra üstüne kuru buz 2,5 santimetrelik bir tabaka yerleştirin. Ve üzerini siyah plastik kaplamaile kapatın. Plastik üstüne bir cam plaka yerleştirin.Ve tabağın sınırları etrafında kuru buz. Donmuş beyin matrisini dondurucudan çıkarın ve beyni, korteks tarafını matrisin içine yerleştirin. Doku 10 dakika boyunca kutusunda sıcaklık için dengelemek için izin verin.Bu süre zarfında kapağı açık tutmak. Sagittal sinüs ve enine sinüs bloğun dik oluklar ile hizaya böylece matris beynin konumunu ayarlamak için soğuk forceps kullanın. Beyin yerle bir olduktan sonra, ortasına soğuk bir jilet yerleştirin ve dokuiçine yaklaşık bir milimetre bastırın.Sonra, beynin her iki ucuna bir soğutulmuş bıçak yerleştirin ve matris içine tüm yol basın. Daha sonra rostral ucunda soğutulmuş bıçaklar ekleyerek başlar, yuvaları içine birer birer yerleştirerek ve yavaşça doku içine bir milimetre basarak. Bir milimetre aralıklarla bıçak eklemeye devam edin, kaudal sonuna doğru çalışarak.Tüm bıçaklar yerinde olduğunda, parmakları, avuç içi veya kör bir nesne ile üst aşağı basın ve doku ile hareket etmek için yan yana yavaşça onları kaya. Bıçaklar yuvaların dibine ulaştıktan sonra, bıçak grubunun her iki tarafını da kavrayın ve ileri geri sallayarak matristen kurtarın. Bıçakgrubu serbest bıraktıktan sonra cam plaka üzerine rostral tarafı yerleştirin ve daha kolay ayırma için örnekleri daha fazla dondurmak için yığının yanına veya üstüne kuru buz koyun.Daha sonra desteyi keskin kenarlı yerleştirin ve desteyi başparmak ile parmaklar arasında kaydırarak bıçakları ayırın. Cam plakalar üzerindeki bölümü rostral'den kaudal'a kadar hizalayın ve parmakların arasına esnederek veya ikinci bir soğutulmuş bıçakla ayırarak dokuyu bıçaklardan ayırın. Bazen, doku bir bıçağın her iki tarafına yapışabilir ve kaudal oryantasyona rostral korumak için dikkatli olunmalıdır.Diseksiyonu başlatmadan önce, Allen Mouse Beyin Atlası'nı veya başka bir referansı açın ve ilgi çekici bölgeleri belirlemek için gerekli olan simgeleri bulun. Bölümü çevirmek için soğutulmuş çterler veya bıçaklar kullanın. Ve ilgi bölgesi bölüm boyunca tutarlı olduğundan emin olun.Temiz bir neşter veya yumruk ile bölüme kesin, yavaşça ama sıkıca doku içine metal iterek. Kesmek için ileri geri sallıyor. İlgi alanı hasat edildikten sonra, önceden soğutulmuş 1,5 milimetrelik tüplerin içine yerleştirin ve eksi 80 santigrat derece de saklayın.Dokuyu işlemek için, protein ekstraksiyonu için soğuk RIPA tamponu veya RNA ekstraksiyonu için çözücü içeren guanidinium ekleyin ve hemen bir cam inme veya mekanik homogenizer ile homojenize edin. Bu yöntemi doğrulamak için medial prefrontal korteks erişkin CD-1 yabani tip erkek farelerden toplanmış ve RNA ve protein karakterize edilmiştir. Kapiller elektroforez ile analiz edildiğinde, bozulmuş RNA 28S ve 18S ribozomal bantların yoğunluğunda bir kayıp ve 25 ila 200 nükleotit arasında bir yayma görüntüler.Yüksek kaliteli RNA, düşük molekül ağırlıklı bölgede sinyal vermek için çok az farklı ribozomal bantlar gösterirken. Dondurulmuş diseksiyon yöntemi kullanılarak elde edilen RNA, taze hasat edilen dokudan hazırlanan RNA ile karşılaştırıldı. Her iki yöntem de yüksek bütünlük numaraları ve güçlü ribozomal bantlama ile RNA üretmek.Bu yöntemin daha sonra analiz için diseksiyonlu dokunun mikro ortamını korumak için kullanılabileceğini doğrulamak için, RNA birkaç hafta boyunca depolanan diseksiyonlu medial prefrontal korteksten çıkarıldı. Tüm numuneler, farklı ribozomal bantlama ve RNA bütünlüğü sayıları sekizin üzerinde olan yüksek kaliteli RNA üretti. Dondurulmuş parçalanmış örneklerin protein bütünlüğünü doğrulamak için, protein toplandı, nitroselüloz transfer ve yüksek molekül ağırlıklı hedef KCC2 karşı antikor ile prob, ve düşük molekül ağırlıklı protein aktin.Her durumda bantları keskin ve belirgin hiçbir fark arıza ürünleri ile edildi. Bu bölümlerin mikroortamını korur ve beyin atlası görüntüleri ile karşılaştırıldığında kesit morfolojisi korumak gibi süreç boyunca dokuları dondurulmuş tutmak önemlidir. Bu şekilde toplanan ilgi bölgeleri negatif 80 derece santigrat birkaç ay saklanabilir ve RT-qPCR, RNA-Seq, Batı leke analizi ve HPLC dahil olmak üzere birçok downstream uygulamalarda kullanılabilir.Bu yöntem, bu ilaçların beyin gelişimini nasıl etkileyebileceğini daha iyi anlamak için THC ve diğer kannabinoidlere maruz kalan perinatal kemirgenlerin limbik sistemlerindeki moleküler değişiklikleri araştırmak için kullanılmıştır.

collection-of-frozen-rodent-brain-regions-for-downstream-analyses

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

Kemirgen Beyin aynı anda fMRI ve Elektrofizyoloji

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Nörobilim

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of the breadth of molecular regulation. Newer approaches such as high-resolution RNA sequencing (RNA-Seq)1 provides new and expansive information about tissue- or state-specific expression such as relative transcript levels, alternative splicing, and micro RNAs2-4. Prospects for employing the RNA-Seq method in comparative whole transcriptome profiling5 within discrete tissues or between phenotypically distinct groups of individuals affords new avenues for elucidating molecular mechanisms involved in both normal and abnormal physiological states. Recently, whole transcriptome profiling has been performed on human brain tissue, identifying gene expression differences associated with disease progression6. However, the use of next-generation sequencing has yet to be more widely integrated into mammalian studies.
Gene expression studies in mouse models have reported distinct profiles within various brain nuclei using laser capture microscopy (LCM) for sample excision7,8. While LCM affords sample collection with single-cell and discrete brain region precision, the relatively low total RNA yields from the LCM approach can be prohibitive to RNA-Seq and other profiling approaches in mouse brain tissues and may require sub-optimal sample amplification steps. Here, a protocol is presented for microdissection and total RNA extraction from discrete mouse brain regions. Set-diameter tissue corers are used to isolate 13 tissues from 750-&mu;m serial coronal sections of an individual mouse brain. Tissue micropunch samples are immediately frozen and archived. Total RNA is obtained from the samples using magnetic bead-enabled total RNA isolation technology. Resulting RNA samples have adequate yield and quality for use in downstream expression profiling. This microdissection strategy provides a viable option to existing sample collection strategies for obtaining total RNA from discrete brain regions, opening possibilities for new gene expression discoveries.

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

RNA expression profiling of discrete mouse brain regions requires a precise and repeatable tissue collection strategy. A protocol that uses both coronal brain sectioning and tissue corer-assisted microdissection is described here. The yield and quality of total RNA obtained from the resulting samples confirms the utility of the outlined method.

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the adult brain. However, the mechanisms these normally quiescent cells employ to ensure proper functioning of neural networks, as well as their role in recovery from injury and mitigation of neurodegenerative processes are little understood. These cells reside in regions referred to as &#34;niches&#34; that provide a sustaining environment involving modulatory signals from both the vascular and immune systems. The isolation, maintenance, and differentiation of CNS SCs under defined culture conditions which exclude unknown factors, makes them accessible to treatment by pharmacological or genetic means, thus providing insight into their in vivo behavior. Here we offer detailed information on the methods for generating cultures of CNS SCs from distinct regions of the adult brain and approaches to assess their differentiation potential into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes in vitro. This technique yields a homogeneous cell population as a monolayer culture that can be visualized to study individual SCs and their progeny. Furthermore, it can be applied across different animal model systems and clinical samples, being used previously to predict regenerative responses in the damaged adult nervous system.

Neural stem cells harvested from the adult brain are increasing utilized in applications ranging from the basic research of nervous system development to exploring potential clinical applications in regenerative medicine. This makes rigorous control in the isolation and culturing conditions used to grow these cells critical to sound experimental outcomes.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to na&#239;ve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment. 
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/na&#239;ve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to deliver gene or cell therapy products. Unfortunately, current microinjection techniques use steel or glass needles that are suboptimal for multiple reasons: in particular, steel needles may cause tissue damage, and glass needles may bend when lowered deeply into the brain, missing the target region. In this article, we describe a protocol to prepare and use quartz needles that combine a number of useful features. These needles do not produce detectable tissue damage and, being very rigid, ensure reliable delivery in the desired brain region even when using deep coordinates. Moreover, it is possible to personalize the design of the needle by making multiple holes of the desired diameter. Multiple holes facilitate the injection of large amounts of solution within a larger area, whereas large holes facilitate the injection of cells. In addition, these quartz needles can be cleaned and re-used, such that the procedure becomes cost-effective.

We describe here a protocol for microinjection in the rodent brain that uses quartz needles. These needles do not produce detectable tissue damage and ensure reliable delivery even in deep regions. Moreover, they can be adapted to research needs by personalized designs and can be re-used.

Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Stereotactic Atlas-Guided Laser Capture Microdissection of Brain Regions Affected by Traumatic Injury

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial distribution. Such techniques also potentially skew gene expression analysis because the process itself can alter expression patterns in individual cells. Here we describe a laser capture microdissection (LCM) method to selectively collect specific brain regions affected by traumatic brain injury (TBI) by using a modified Nissl (cresyl violet) staining protocol and the guidance of a rat brain atlas. LCM provides access to brain regions in their native positions and the ability to use anatomical landmarks for identification of each specific region. To this end, LCM has been used previously to examine brain region specific gene expression in TBI. This protocol allows examination of TBI-induced alterations in gene and microRNA expression in distinct brain areas within the same animal. The principles of this protocol can be amended and applied to a wide range of studies examining genomic expression in other disease and/or animal models.

We describe the use of laser capture microdissection to obtain samples of distinct cell populations from different brain regions for gene and microRNA analysis. This technique allows the study of differential effects of traumatic brain injury in specific regions of the rat brain.

Stereotaksik Atlas güdümlü lazer yakalama mikrodiseksiyon travma yaralanma tarafından etkilenen beyin bölgeleri

The ability to isolate specific brain regions of interest can be impeded in tissue disassociation techniques that do not preserve their spatial ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is tightly regulated during development and neuronal maturation. Importantly, deficits in synapse number can lead to cognitive dysfunction. Therefore, the evaluation of synapse number is an integral part of neurobiology. However, as synapses are small and highly compact in the intact brain, the assessment of absolute number is challenging. This protocol describes a method to easily identify and evaluate synapses in hippocampal rodent slices using immunofluorescence microscopy. It includes a three-step procedure to evaluate synapses in high-quality confocal microscopy images by analyzing the co-localization of pre- and postsynaptic proteins in hippocampal slices. It also explains how the analysis is performed and gives representative examples from both excitatory and inhibitory synapses. This protocol provides a solid foundation for the analysis of synapses and can be applied to any research investigating the structure and function of the brain.

A protocol for accurately identifying and analyzing synapses in hippocampal slices using immunofluorescence is outlined in this article.

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...