Name: collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses
Uploaded: 2020-04-23T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Bu çalışma NIH, DA043982 ve DA046196 tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada kullanılan hayvanlar, Indiana Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergeleri tarafından belirlenen etik ve insancıl bir şekilde ele alındı.
NOT: Tüm aletler ve yüzeyler, herhangi bir işe başlamadan önce18 nükleazları çıkarmak için uygun bir çözücü ile yıkanmalıdır.
1. Beyinlerin depolanması
<ol><li>Geleneksel bir yaklaşım<sup cla...

<ol>
	<li>. Allen Mouse Brain Atlas Available from: <a target="_blank" href="https://mouse.brain">https://mouse.brain</a> (2008)</li><li>Kuleshova, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetics+-+New+Potentials+for+Electrophysiology.">Optogenetics - New Potentials for Electrophysiology.</a> Neuroscience and Behavioral Physiology. 49 (2), 169-177 (2019).</li><li>Scanziani, M., H&#228;usser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiology+in+the+age+of+light.">Electrophysiology in the age of light.</a> Nature. 461, 930 (2009).</li><li>Shimono, M., Beggs, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Clusters,+Hubs,+and+Communities+in+the+Cortical+Microconnectome.">Functional Clusters, Hubs, and Communities in the Cortical Microconnectome.</a> Cerebral cortex. 25 (10), 3743-3757 (2015).</li><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li><li>Kebschull, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+mapping+of+single+neuron+projections+by+sequencing+of+barcoded+RNA.">High-throughput mapping of single neuron projections by sequencing of barcoded RNA.</a> bioRxiv. , 054312 (2016).</li><li>Mitulovi&#263;, G., Mechtler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HPLC+techniques+for+proteomics+analysis&#8212;a+short+overview+of+latest+developments.">HPLC techniques for proteomics analysis&#8212;a short overview of latest developments.</a> Briefings in Functional Genomics. 5 (4), 249-260 (2006).</li><li>Bettscheider, M., Murgatroyd, C., Spengler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+DNA+and+RNA+isolation+from+brain+punches+for+epigenetics.">Simultaneous DNA and RNA isolation from brain punches for epigenetics.</a> BMC Research Notes. 4, 314 (2011).</li><li>Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. F., Chang, R. C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-dissection+of+Rat+Brain+for+RNA+or+Protein+Extraction+from+Specific+Brain+Region.">Micro-dissection of Rat Brain for RNA or Protein Extraction from Specific Brain Region.</a> JoVE. (7), e269 (2007).</li><li>Aring, L., S, S., Marcus, K., May, C., Murran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Laser Capture Microdissection. Methods in Molecular Biology. 1723, 2457 (2018).</li><li>Bj&#246;rk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione-S-transferase+expression+in+the+brain:+possible+role+in+ethanol+preference+and+longevity.">Glutathione-S-transferase expression in the brain: possible role in ethanol preference and longevity.</a> The FASEB Journal. 20 (11), 1826-1835 (2006).</li><li>Jeong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Network+Dysregulation+in+the+Trigeminal+Ganglia+and+Nucleus+Accumbens+of+a+Model+of+Chronic+Migraine-Associated+Hyperalgesia.">Gene Network Dysregulation in the Trigeminal Ganglia and Nucleus Accumbens of a Model of Chronic Migraine-Associated Hyperalgesia.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. 12 (63), (2018).</li><li>Spijker, S., Li, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+Rodent+Brain+Regions.">Dissection of Rodent Brain Regions.</a> Neuroproteomics, Neuromethods. 57, 13-26 (2011).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+removal+of+hypothalamic+or+other+brain+nuclei+of+the+rat.">Isolated removal of hypothalamic or other brain nuclei of the rat.</a> Brain Research. 59, 449-450 (1973).</li><li>Palkovits, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Enzymology. 103, 368-376 (1983).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. 2 edn. , (2001).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 4 edn. , (1998).</li><li>RNaseZap. Ambion Available from: <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/">https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/</a> (2008)</li><li>. RNA Integrity Number (RIN)- Standardization of RNA Quality Control Available from: <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/">https://www.agilent.com/cs/library/</a> (2016)</li><li>Scheyer, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+Exposure+via+Lactation+in+Rats+Disrupts+Perinatal+Programming+of+the+Gamma-Aminobutyric+Acid+Trajectory+and+Select+Early-Life+Behaviors.">Cannabinoid Exposure via Lactation in Rats Disrupts Perinatal Programming of the Gamma-Aminobutyric Acid Trajectory and Select Early-Life Behaviors.</a> Biological Psychiatry. , (2019).</li><li>Choi, D. W., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+glutamate+neurotoxicity+in+hypoxic-ischemic+neuronal+death.">The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death.</a> Annual Review of Neuroscience. 13 (1), 171-182 (1990).</li><li>Guhaniyogi, J., Brewer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+mRNA+stability+in+mammalian+cells.">Regulation of mRNA stability in mammalian cells.</a> Gene. 265 (1-2), 11-23 (2001).</li><li>Sampaio-Silva, F., Magalh&#227;es, T., Carvalho, F., Dinis-Oliveira, R. J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+RNA+degradation+for+estimation+of+post+mortem+[corrected]+interval.">Profiling of RNA degradation for estimation of post mortem [corrected] interval.</a> PloS One. 8 (2), 56507 (2013).</li><li>Yamagata, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signs+of+biological+activities+of+28,000-year-old+mammoth+nuclei+in+mouse+oocytes+visualized+by+live-cell+imaging.">Signs of biological activities of 28,000-year-old mammoth nuclei in mouse oocytes visualized by live-cell imaging.</a> Scientific Reports. 9 (1), 4050 (2019).</li><li>Allen Brain Atlas: Developing Mouse Brain. Allen Institute Available from: <a target="_blank" href="https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas">https://developingmouse.brain-map.org/static/atlas</a> (2008)</li></ol>

Bu çalışma, nükleik asit ve protein ingradasyonunu sınırlandırırken beynin küçük, belirli bölgelerini izole etme tekniğini tanımlar. Bir organizma öldüğünde beyin dokularına zarar hemen gerçekleşir. Bu kısmen ekstrasellüler glutamat hızlı birikme ve21oluşur sonucu eksitotoksisite kaynaklanmaktadır. Messenger RNA özellikle bozulmaya karşı savunmasızdır 22,23. Protein ve nükleik asit dökümü büyük ölçü...

Bu çalışma, bir rehber olarak Allen Mouse Beyin Atlası1gibi bir referans kullanarak yüksek kaliteli nükleik asit veya protein çıkarılması için dondurulmuş beyin bölgelerinin diseksiyon göstermektedir. Bu teknikte beyinler flaş dondurulmuş ve dondurulmuş bir durumda muhafaza edilirken daha sonra kesit ve diseksiyon için -80 °C'de saklanır. Bu süreç araştırmacı bir oturumda beyin çok sayıda hasat ve daha sonra birden fazla beyin bölgeleri doğru bir koleksiyon için onları incelemek için izin verir.
Gen ve protein ekspresyonu ile ilgili soruları yanıtlarken genellikle beyin bölgelerinin (ROI) doğru toplanması gereklidir. Farmakoloji, elektrofizyoloji ve optogenetik yabani tip veya genetiği değiştirilmiş kemirgenler üzerinde gözlenen davranışları destekleyen moleküler değişikliklerin aydınlatılmasına yardımcı olmak için kullanılabilir iken2,3,4, transkripsiyon ve proteomlarda indüklenen değişikliklerin ölçümü genellikle bu bulguları desteklemek için kullanılır. Nicel ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR), batı lekeleme, RNAseq5,MAPSeq6 ve HPLC7 gibi teknikler sağlam ve nispeten düşük maliyet, birçok laboratuvarküçük beyin bölgeleri içinde indüklenen moleküler değişiklikleri incelemek için izin2,4,5,6.
Beyin bölgelerinden nükleik asit veya protein ayıklamak ve arındırmak için çeşitli yollar vardır8,9,10,11,12. Birçok laboratuvarlar hasat sırasında buz üzerinde beyinleri dondurup keserek beyin bölgelerini hasat eder9,13. Bu yaklaşım yüksek kaliteli nükleik asit ve proteine yol açsa da, bu sıcaklıklarda dokunun mikro ortamında bozulma olabileceğinden biraz zaman sınırlıdır. Bu özellikle bir oturuşta çok sayıda hayvanı veya ROI'yi incelemeye çalışırken doğru olabilir. Numuneleri dondurulmuş tutmak, araştırmacıya nispeten saf numuneler toplama çabasında her bölümün her iki tarafındaki simgeleri dikkatle karşılaştırması için zaman sağlarken, labile hedef moleküllerinin korunmasına yardımcı olur. Lazer yakalama beyin bölgelerinden RNA veya protein analizi için doku toplamak için başka bir yoldur10. Bu işlem, çok küçük ve düzensiz şekilli ROI'ların tespit edilip izole edilebildiği mekanik diseksiyondan daha üstündür. Ancak, lazer yakalama pahalı ekipman ve reaktiflerin kullanımı ile sınırlıdır, zaman alıcı ve aynı zamanda örnek bozulmasına daha duyarlı olabilir.
Dondurulmuş dokularda mikropunch diseksiyonu yeni değildir. Miklos Palkovits ve diğerleri tarafından erken kağıtları ayrıntılı olarak temel teknikleri açıklamak14,15. Bu sunum büyük ölçüde verimliliği kolaylaştırmak ve gerekli ekipman giderini azaltmak için bazı iyileştirmeler ile, orijinal çalışma izler. Örneğin, beyin bölümleri dondurulmuş beyin bloğu yerine bir kriyostat yapılır. Bu, yatırım getirisi örnekleri toplamak için gereken kesit sayısını azaltan daha kalın bölümler üretir. Bu yöntem aynı zamanda yalıtılmış bir kutu içinde kuru buz üzerinde oturur dondurulmuş cam plaka üzerinde örnekleri inceler. Bu, üzerinde çalışmak için tezgah bir alt donma aşaması üretir. Bu şekilde incelenen bölümler kolayca manipüle edilebilir, böylece araştırmacı her bölümün her iki tarafını da istenilen Yatırım Getirisi dışındaki bölgelerden gelen kontaminasyonu sınırlamak için bir referansla karşılaştırmak için.
Bu protokolün avantajları 1) beyin protein ve nükleik asit korunmasına yardımcı olur ve dikkatle ROI hasat için araştırmacı zaman verir ve 2) gerekli reaktifler ucuz ve en moleküler biyoloji laboratuarlarında bulunan süreç boyunca dondurulmuş bir durumda tutulur. Bu süreçte, tüm beyinler bir beyin matris0.5-1.0 mm kesitli ve sürekli kuru buz ile soğutulmuş bir dondurulmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Allen BeyinAtlası bulunan Yerler 1 veya diğer beyin atlasları16,17 ilgi bölgelerini tanımlamak için kullanılır, hangi sonra soğuk bir yumruk veya neşter kullanılarak kesilir. Doku asla çözülmemedığından, bu şekilde hasat edilen bölgeler, downstream analizleri için yüksek kaliteli RNA ve protein sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mm Mouse coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 505C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm Rat coronal brain matrice</td>
			<td>Braintree Scientific</td>
			<td>BS-SS 705C</td>
			<td>Cutting block</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>229443</td>
			<td>For storing frozen ROIs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mm Biopsy Punch with plunger</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>69031-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-12% NuPage gel</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>NPO323BOX</td>
			<td>protein gradient gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer System</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>2100</td>
			<td>RNA analysis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce tissue grinder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td> 
			D8938</td>
			<td>Glass tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber-Lite</td>
			<td>Dolan-Jenner Industries Inc.</td>
			<td>Model 180</td>
			<td>Cool lamp</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass plates</td>
			<td>LabRepCo</td>
			<td>11074010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>78440</td>
			<td>protease inhibitor cocktail</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile blades</td>
			<td>Sakura Finetek USA Inc.</td>
			<td>4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti-actin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td>JLA20</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2000C</td>
			<td>Used in initial RNA purity analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>No. 15 surgical blade</td>
			<td>Surgical Design Inc</td>
			<td>17467673</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey Blocking buffer</td>
			<td>LiCor Biosciences</td>
			<td>927-40000</td>
			<td>Western blocking reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Omni Tissue Master 125</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10046-866</td>
			<td>Tissue homogenizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti-KCC2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>94725S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Plus Micro Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>73034</td>
			<td>Used to extract RNA from small tissue samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel handle</td>
			<td>Excelta Corp.</td>
			<td>16050103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard razor blades</td>
			<td>American Line</td>
			<td>66-0362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>Used to extract RNA from tissue</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

collection of frozen rodent brain regions for downstream analyses

Nörobiyoloji anlayışımız ilerledikçe, moleküler analizler genellikle medial prefrontal korteks (mPFC) veya nükleus accumbens gibi küçük beyin bölgelerinde yapılır. Bu çalışmada sorun incelenecek mikroortamı korurken doğru alanı incelemektir. Bu yazıda, çoğu laboratuvarda kolayca bulunan kaynakları kullanarak basit, düşük maliyetli bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem, işlem boyunca doku dondurulmuş tutarak nükleik asit ve proteinleri korur. Beyinler bir beyin matrisi kullanılarak 0.5-1.0 mm kesitler halinde kesilir ve donmuş cam plaka üzerine yerleştirilir. Her bölümdeki yerler Allen Mouse Beyin Atlası gibi bir referansla karşılaştırılır ve bölgeler soğuk neşter veya biyopsi yumruğu kullanılarak kesilir. Doku daha sonra kullanıma kadar -80 °C'de saklanır. Bu işlem sayesinde sıçan ve fare mPFC, nucleus accumbens, dorsal ve ventral hipokampus ve diğer bölgelerde başarıyla qRT-PCR ve Batı tahlilleri kullanılarak analiz edilmiştir. Bu yöntem açık yerler tarafından tespit edilebilir beyin bölgeleri ile sınırlıdır.

Bu yöntemi doğrulamak için medial prefrontal korteks erişkin CD1 wildtype erkek farelerden toplanmış ve RNA ve protein elde edilmiştir. RNA kapiller elektroforez ile analiz edildi. Bozulmuş RNA, 28S ve 18S ribozomal bantların yoğunluğunda bir kayıp gösterir ve ayrıca 25 ile 200 nükleotit arasında yayma olarak bozunma ürünlerini gösterir(Şekil 5A, örnek 1). Yüksek kaliteli RNA, düşük molekül ağırlıklı bölgede çok az veya hiç sinyal olmayan belirgin ribozomal b...

Watch this Scientific Journal Video about Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses at JoVE.com

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Bu prosedür, ucuz ve yaygın olarak kullanılabilir araçları kullanarak yüksek kaliteli protein ve RNA elde etmek için ayrık dondurulmuş beyin bölgelerinin toplanmasını açıklar. Beyin bölgeleri diseksiyon yoluyla hasattan dondurulmuş tutulduğundan, hedef moleküller korunur ve araştırmacının ilgi çekici bölgeleri dikkatlice incelemek ve depolamak için zamanı vardır. İlgi çekici bölgelerin belirlenmesi başlangıçta zor olabilir.Onlar ortaya çıktıve istenilen bölgelere göre bölümleri ile geri çekerken ortak beyin işaretleri kullanarak kimlik açık hale getirecektir. Ötenazi yetişkin CD-1 vahşi tip farelerden beyinleri çıkardıktan sonra, flaş sıvı nitrojen veya isopentane içinde 60 saniye boyunca doku dondurun. Kuru buz ile önceden soğutun ve eksi 80 santigrat derece saklayın.Dokuyu incelemeden 24 saat önce, çözülmüş dondurucu paketleri yığınına temiz bir beyin matrisi yerleştirin. Ve iki dondurucu paketleri arasında matris kenarları sandviç jilet yuvalarının alt ve paketlerinin üst arasında yaklaşık yarım santimetre bırakmak emin olun. Üstten yaklaşık beş santimetreye kadar buz ile yalıtılmış bir kutu doldurarak diseksiyon için dondurulmuş bir cam plaka ayarlayın.Sonra üstüne kuru buz 2,5 santimetrelik bir tabaka yerleştirin. Ve üzerini siyah plastik kaplamaile kapatın. Plastik üstüne bir cam plaka yerleştirin.Ve tabağın sınırları etrafında kuru buz. Donmuş beyin matrisini dondurucudan çıkarın ve beyni, korteks tarafını matrisin içine yerleştirin. Doku 10 dakika boyunca kutusunda sıcaklık için dengelemek için izin verin.Bu süre zarfında kapağı açık tutmak. Sagittal sinüs ve enine sinüs bloğun dik oluklar ile hizaya böylece matris beynin konumunu ayarlamak için soğuk forceps kullanın. Beyin yerle bir olduktan sonra, ortasına soğuk bir jilet yerleştirin ve dokuiçine yaklaşık bir milimetre bastırın.Sonra, beynin her iki ucuna bir soğutulmuş bıçak yerleştirin ve matris içine tüm yol basın. Daha sonra rostral ucunda soğutulmuş bıçaklar ekleyerek başlar, yuvaları içine birer birer yerleştirerek ve yavaşça doku içine bir milimetre basarak. Bir milimetre aralıklarla bıçak eklemeye devam edin, kaudal sonuna doğru çalışarak.Tüm bıçaklar yerinde olduğunda, parmakları, avuç içi veya kör bir nesne ile üst aşağı basın ve doku ile hareket etmek için yan yana yavaşça onları kaya. Bıçaklar yuvaların dibine ulaştıktan sonra, bıçak grubunun her iki tarafını da kavrayın ve ileri geri sallayarak matristen kurtarın. Bıçakgrubu serbest bıraktıktan sonra cam plaka üzerine rostral tarafı yerleştirin ve daha kolay ayırma için örnekleri daha fazla dondurmak için yığının yanına veya üstüne kuru buz koyun.Daha sonra desteyi keskin kenarlı yerleştirin ve desteyi başparmak ile parmaklar arasında kaydırarak bıçakları ayırın. Cam plakalar üzerindeki bölümü rostral'den kaudal'a kadar hizalayın ve parmakların arasına esnederek veya ikinci bir soğutulmuş bıçakla ayırarak dokuyu bıçaklardan ayırın. Bazen, doku bir bıçağın her iki tarafına yapışabilir ve kaudal oryantasyona rostral korumak için dikkatli olunmalıdır.Diseksiyonu başlatmadan önce, Allen Mouse Beyin Atlası'nı veya başka bir referansı açın ve ilgi çekici bölgeleri belirlemek için gerekli olan simgeleri bulun. Bölümü çevirmek için soğutulmuş çterler veya bıçaklar kullanın. Ve ilgi bölgesi bölüm boyunca tutarlı olduğundan emin olun.Temiz bir neşter veya yumruk ile bölüme kesin, yavaşça ama sıkıca doku içine metal iterek. Kesmek için ileri geri sallıyor. İlgi alanı hasat edildikten sonra, önceden soğutulmuş 1,5 milimetrelik tüplerin içine yerleştirin ve eksi 80 santigrat derece de saklayın.Dokuyu işlemek için, protein ekstraksiyonu için soğuk RIPA tamponu veya RNA ekstraksiyonu için çözücü içeren guanidinium ekleyin ve hemen bir cam inme veya mekanik homogenizer ile homojenize edin. Bu yöntemi doğrulamak için medial prefrontal korteks erişkin CD-1 yabani tip erkek farelerden toplanmış ve RNA ve protein karakterize edilmiştir. Kapiller elektroforez ile analiz edildiğinde, bozulmuş RNA 28S ve 18S ribozomal bantların yoğunluğunda bir kayıp ve 25 ila 200 nükleotit arasında bir yayma görüntüler.Yüksek kaliteli RNA, düşük molekül ağırlıklı bölgede sinyal vermek için çok az farklı ribozomal bantlar gösterirken. Dondurulmuş diseksiyon yöntemi kullanılarak elde edilen RNA, taze hasat edilen dokudan hazırlanan RNA ile karşılaştırıldı. Her iki yöntem de yüksek bütünlük numaraları ve güçlü ribozomal bantlama ile RNA üretmek.Bu yöntemin daha sonra analiz için diseksiyonlu dokunun mikro ortamını korumak için kullanılabileceğini doğrulamak için, RNA birkaç hafta boyunca depolanan diseksiyonlu medial prefrontal korteksten çıkarıldı. Tüm numuneler, farklı ribozomal bantlama ve RNA bütünlüğü sayıları sekizin üzerinde olan yüksek kaliteli RNA üretti. Dondurulmuş parçalanmış örneklerin protein bütünlüğünü doğrulamak için, protein toplandı, nitroselüloz transfer ve yüksek molekül ağırlıklı hedef KCC2 karşı antikor ile prob, ve düşük molekül ağırlıklı protein aktin.Her durumda bantları keskin ve belirgin hiçbir fark arıza ürünleri ile edildi. Bu bölümlerin mikroortamını korur ve beyin atlası görüntüleri ile karşılaştırıldığında kesit morfolojisi korumak gibi süreç boyunca dokuları dondurulmuş tutmak önemlidir. Bu şekilde toplanan ilgi bölgeleri negatif 80 derece santigrat birkaç ay saklanabilir ve RT-qPCR, RNA-Seq, Batı leke analizi ve HPLC dahil olmak üzere birçok downstream uygulamalarda kullanılabilir.Bu yöntem, bu ilaçların beyin gelişimini nasıl etkileyebileceğini daha iyi anlamak için THC ve diğer kannabinoidlere maruz kalan perinatal kemirgenlerin limbik sistemlerindeki moleküler değişiklikleri araştırmak için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

Kemirgen Beyin aynı anda fMRI ve Elektrofizyoloji

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Kemirgen Beyin Dilimleri Nöronlar Vibrodissociation Sinaptik İletim ve Görüntü Presinaptik Terminalleri Eğitim

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Toplam RNA İzolasyonu ve Alt Nesil Sıralama ve Kaynak gösterilmeden kullanılamaz Ayrık Fare Beyin Bölgeler Mikrodisseksiyon Sigara Lazer Yakalama Mikroskopi Yaklaşım

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

High Resolution Quantitative Synaptic Proteome Profiling of Mouse Brain Regions After Auditory Discrimination Learning

İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory ...

Personalized Needles for Microinjections in the Rodent Brain

Microinjections kemirgen beyin için kişiselleştirilmiş iğneler

Microinjections have been used for a long time for the delivery of drugs or toxins within specific brain areas and, more recently, they have been used to ...

Evaluation of Synapse Density in Hippocampal Rodent Brain Slices

Hipokampal kemirgen beyin dilimleri dansitesi Synapse değerlendirilmesi

In the brain, synapses are specialized junctions between neurons, determining the strength and spread of neuronal signaling. The number of synapses is ...