Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi takker UNIL flow cytometry Core-faciliteten for deres støtte, især Dr. Romain Bedel. Dette arbejde blev støttet af Kristian Gerhard Jebsen Foundation Grant til N. V og O.N.

Alle eksperimenter, der er beskrevet i manuskriptet, følger vores institutions retningslinjer og er udført i overensstemmelse med schweizisk lov om dyreforsøg (tilladelse: VD3194) og til forskning, der involverer humane prøver (protokol: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. hematopoietisk stamcelle ekstraktion
<ol><li>Køb vildtype C57BL6/J mus og holde dem i dyre huset i mindst en uge til at reducere transport-relaterede stress.</li>
	<li>På dagen for forsøget, aflive musen ved hjælp af co<...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

En stram regulering af HSC-funktionen er vigtig for at opretholde stabil hæmatopoiese under en organismes levetid. Ligesom forskellige andre celletyper i kroppen, en nøglekomponent, der bidrager til reguleringen af HSC funktion er cellulære metabolisme. Tidligere undersøgelser fra vores Lab9 og andre2,3 har impliceret betydningen af mitokondrier i at opretholde en distinkt metabolisk tilstand i hscs. på grund af det ekstremt lave anta...

Hæmatopoietiske stamceller (HSCs) er en lille population af celler bosat i knoglemarven sikre blod produktion og homøostase i hele organismens levetid. Hscs mægle denne proces ved at give anledning til stamceller, der igen producerer terminalt differentieret modne blodlegemer nedstamningens via flere runder af celledeling og godt orkestreret differentiering trin1. Det er vigtigt, at HSCs producerer deres energi via anaerob glycolyse. I modsætning hertil, mere engagerede og aktive hæmatopoietiske progenitorer skifte deres stofskifte mod mitokondrie metabolisme2,3,4. Denne særskilte metaboliske tilstand menes at beskytte hscs fra cellulære skader påført af reaktive oxygenarter (ros) produceret af aktive mitokondrier, og derved opretholde deres langsigtede in vivo funktion5,6,7,8. Direkte måling af HSC metaboliske tilstand er udfordrende og ofte lav gennemløb på grund af deres begrænsede antal. Her beskriver vi en flow cytometry-baseret analyse for robust måling af mitokondriel membran potentiale (ΔΨm) ved hjælp af tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) Fluorescens, og mitokondrie masse ved hjælp af en grøn fluorescerende mitokondrie bejdset (Mitotracker grøn) i HSCs. Vi har tidligere påvist, at Low ΔΨm er en bona fide funktionel markør af højt rensede hscs9 og metaboliske modulatorer, der kan sænke ΔΨm forbedre hscs funktion9,10. Her foreslår vi brug af vores metode på hscs mitokondrie profilering som strategi til at identificere nye molekyler, som kan forbedre hscs ' langsigtede potentiale for rekonstitution af blodet.
Som et eksempel viser vi, at denne analyse pålideligt måler sænkningen af HSC ΔΨm ved udsættelse for vitamin B3 analog nicotinamid riboside (NR). Derfor viser vi i vores nyligt offentliggjorte undersøgelse, at NR kraftigt forbedrer blod genvinding efter transplantation i både mus og humaniseret muse systemer ved direkte at forbedre hæmatopoietisk stilk og progenitorfunktioner10. Kapaciteten af sådanne metaboliske modulatorer er af stor klinisk værdi i betragtning af, at en 25% dødelighed er forbundet med forsinkelse i blod og immun opsving i posttransplanterede patienter11,12.
Desuden, vi fremlægger bevis for, at denne metode kan anvendes til karakterisering af den metaboliske profil og funktion af humane T-celler. I de seneste år, udvikling af adoptivcelle terapi (ACT) ved hjælp af autologt tumor infiltrerende lymfocytter (TILs) er blevet den mest effektive tilgang til visse typer af fremskreden kræft med ekstremt ugunstig prognose (f. eks metastatisk melanom, hvor > 50% af patienterne reagerer på behandling og op til 24% af patienterne har fuldstændig regression)13. Men, tils husly tilstrækkelig antitumoraktivitet er vanskelige at generere14. Den omfattende spredning og stimulering, som TILs undergår under ex vivo-ekspansion, forårsager T-celle udmattelse og-senescens, der dramatisk hæmmer T-cellens antitumor respons15. Det er vigtigt, at tils ' antitumoralske kapacitet er tæt knyttet til deres metabolisme16,17 og tilgange, der har til formål at moduere metabolismen gennem hæmning af PI3K/akt-vejen, har resulteret i opmuntrende resultater18,19. Af denne grund sammenligner vi ΔΨm af T-celler afledt af mononukleære celler i perifert blod (PBMCs) og patient afledte TILs, og viser, at mindre differentierede PBMC-afledte T-celler har lavere ΔΨm og mitokondrie masse i forhold til terminalt differentierede TILs.
Vi forestiller, at denne analyse kan bruges til at identificere nye metaboliske modulatorer, der forbedrer HSC og T celle funktion via modulering af ΔΨm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

En fin balance mellem quiescence, selvfornyelse, og differentiering er nøglen til at bevare den hæmatopoietiske stamcelle (HSC) pulje og opretholde livslang produktion af alle modne blodlegemer. I de seneste år cellulære metabolisme er dukket op som en afgørende regulator af HSC funktion og skæbne. Vi har tidligere påvist, at graduering af mitokondrie metabolisme påvirker HSC skæbne. Specifikt ved kemisk frakobling af elektrontransportkæden var vi i stand til at opretholde HSC-funktion under kulturforhold, der normalt inducerer hurtig differentiering. Begrænsning af HSC-numre udelukker imidlertid ofte brugen af standard analyser til måling af HSC-metabolisme og forudser derfor deres funktion. Her rapporterer vi en simpel flow flowcytometri assay, der giver pålidelig måling af mitokondriel membran potentiale og mitokondrie masse i knappe celler som hscs. Vi diskuterer isolering af HSCs fra mus knoglemarv og måling af mitokondrie masse og membran potentiel post ex vivo kultur. Som et eksempel viser vi moduleringen af disse parametre i HSCs via behandling med en metabolisk modulator. Desuden udvider vi anvendelsen af denne metode på humane perifere blod afledte T-celler og humane tumor infiltrerende lymfocytter (TILs), der viser dramatiske forskelle i deres mitokondrielle profiler, der muligvis afspejler forskellige T-celle Funktionalitet. Vi mener, at denne analyse kan anvendes i screeninger til at identificere modulatorer af mitokondrie metabolisme i forskellige celletyper i forskellige sammenhænge.

I figur 1 viser vi gating-strategien for isolering af hæmatopoietiske stamceller fra musens knoglemarv og pladens layout for deres ex vivo-kultur. Figur 1a viser identifikationen af lymfocyt fraktionen i VSK-A/FSC-a-plottet. Doublets blev fjernet i singlet Gate efterfulgt af identifikation af levende celler ved fravær af DAPI signal. LKS-populationen, defineret af Lineage-Sca1+ckit+, blev identificeret. Denne population e...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Her beskriver vi en pålidelig metode til måling af mitokondriel masse og membran potentiale i ex vivo kulturperler hæmatopoietiske stamceller og T-celler.

Måling af mitokondriel masse og membran potentiale i hæmatopoietiske stamceller og T-celler ved flow cytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Denne protokol er en simpel flow cytometri-baseret analyse giver mulighed for måling af mitokondrielle membran potentiale og mitokondriel masse i levende celler. Standard metaboliske assays mislykkes, når du arbejder med sjældne populationer såsom hæmatopoietiske stamceller. Denne metode gør det muligt for brugerne mitokondrielle membran profilering, når de arbejder med lavt antal celler og til at bestemme nye metaboliske modulatorer af celler såsom HSCs.Desuden kan du kombinere det med downstream funktionelle analyser såsom knoglemarvstransplantation eller kolonidannende analyser for at bestemme funktionaliteten af dine celler post-kultur. Vores teknik kan udnyttes til identifikation af nye molekyler i stand til at forbedre HSC funktion i forbindelse med knoglemarvstransplantation og hæmatopoietisk immun opsving efter ablaative behandlinger. Som beskrevet i vores protokol, vores metode kan bruges til at evaluere metaboliske egnethed immun T-celler.Det er meget vigtigt, at cellerne har minimal udsættelse for lys efter farvning. Desuden skal brugen af pumpehæmmer verapamil indgå for at vurdere bidraget fra pumpe efflux. Men, brugere skal være opmærksomme på, at verapamil dybt perturbs ionisk ligevægt og ikke kan anvendes til at vurdere effekten af en metabolisk modulator på mitokondrielle membran potentiale.Visuel demonstration af denne metode er yderst vigtigt, fordi der er nogle kritiske trin, som man skal huske på, når man arbejder med lavt antal celler, og disse trin mangler meget ofte i de almindelige papirer, som brugerne læser på PubMed. For FAC-sortering identificeres LKS-populationen, defineret ved afstamningssneg, Sca1 positiv, cKit-positiv. Hæmatopoietiske stamceller fra omkring fem til 10% af cellerne i LKS-populationen identificeres ved gating for CD150 positiv, CD48 negativ population, mærket som HSCs.Efter hæmatopoietisk stamcellesortering centrifuger rørene ved 300 gange g i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern forsigtigt det meste af supernatanten uden at løsne pellet, og lad 50 til 80 mikroliter på toppen af cellen pellet. Resuspend cell pellet i stamceller ekspansion medium til et endeligt volumen på 200 mikroliter.Forbered en steril vævskultur behandlet 96 U-bund godt plade, og identificere de brønde, hvor cellerne vil blive dyrket. Overfør 100 mikroliter af 2x basalt medium, der tidligere er tilberedt i disse brønde. I NR markeret godt, tilsæt to mikroliter af en 100x nicotinamid riboside opløsning.Overfør 100 mikroliter af 2x basalt medium i brønde til farvning kontrol. Seed 100 mikroliter af tilberedte hæmatopoietiske stamceller oven på brøndene indeholdende 2x basalt medium. Seed 100 mikroliter af hele knoglemarvsceller på brønde markeret som farvning kontrol.Tilsæt 200 mikroliter autoklaveret vand i alle omkringliggende brønde for at reducere fordampning fra brønde, der indeholder celler. Placer pladen uforstyrret i en inkubator ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i 72 timer. Tag pladen ud for at fylde nicotinamid riboside hver 24 timer, og læg den tilbage i rugemaskinen.Ved slutningen af kulturperioden tilsættes to mikroliter 100x TMRM-opløsning og to mikroliter 100x grøn fluorescerende pletopløsning i hver af testboblerne. Tilføj to mikroliter af 100x TMRM i TMRM farvning kontrol godt. Tilføj to mikroliter af 100x grøn fluorescerende plet i MitoTracker farvning kontrol godt.Dæk toppen af pladen med aluminiumsfolie. og læg pladen tilbage i en inkubator ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid i 45 minutter. Fjern pladen fra inkubatoren, og centrifuge det ved 300 gange g i fem minutter.Inverter pladen for at fjerne supernatanten, og tilsæt 200 mikroliter af standard FACS buffer til resuspend. Dæk pladen med folie. Centrifuge pladen ved 300 gange g i fem minutter.Gentag dette vasketrin tre gange. Resuspend cellerne i 200 mikroliter af FACS buffer, og overførsel til FACS rør. Hvis du vil køre prøverne på flowcytometeret, skal du først indlæse de enkelte farvekontroller i maskinen og registrere mindst 5.000 hændelser i hver én efter én.I softwaren skal du trykke på Hent og derefter Optag på dashboardet for at hente og registrere enkelte farvekontrolelementer. Tryk på Kompensationsopsætning, og klik på Beregn kompensation for at beregne kompensationen. Når kompensationen er anvendt, skal du anskaffe den hæmatopoietiske stamcelleprøve og registrere så mange hændelser som muligt.Eksporter FACS-filerne fra cytometeret, og åbn filen på analysesoftwaren. På FlowJo skal du bruge fremadrettet scatter og side scatter gating til at identificere cellepopulationen. Identificer singlets i de næste porte, og plot derefter den DAPI negative fraktion, der repræsenterer levende celler.I den levende celleport skal du lave et konturplot i TMRM og den grønne fluorescerende pletkanal for at måle henholdsvis mitokondriel membranpotentiale og masse. Eksporter den gennemsnitlige fluorescensintensitet for disse to kanaler i den levende celleport. Eksporter derefter andelen af celler i TMRM lav gate i alle prøver.Den nicotinamid riboside behandling viste en klar stigning i TMRM lav befolkning. Det øgede også andelen af celler i TMRM lav gate betydeligt og viste en betydelig sænkning af TMRM fluorescensintensiteten. Mitokondriel masse ikke ændre sig på nicotinamid riboside tilskud.Derudover blev stamcellemarkør farvning kombineret med mitokondriel farvning postkultur. Med gatingstrategien til identifikation af hæmatopoietiske stamceller viste eksponeringen for nicotinamid riboside en betydelig stigning i TMRM lav population og et betydeligt fald i TMRM fluorescensintensiteten i gated HSCs. Den grønne fluorescerende mitokondriel plet grønne signal forblev uændret i de to betingelser.Det er vigtigt at dække farvning plade med aluminiumsfolie for at minimere eksponeringen af lys til farvede prøver. Denne metode kan kombineres med downstream-analyser såsom knoglemarvstransplantation og kolonidannende analyser for at bestemme funktionaliteten af dine stamceller. Så denne teknik giver mulighed for en simpel screening metode til identifikation af nye metaboliske modulatorer af HSCs.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimeret farvning og spredning modelleringsmetoder for celledeling Overvågning ved hjælp cellesporing Farvestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og stamcelle i Voksen Mouse calvarie knoglemarv

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosoliske Calcium Målinger i Nyrer epitelceller ved flowcytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differentiering af humane pluripotente stamceller til hjertemuskelceller og karakterisering ved hjælp af flowcytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig måling af Mitokondriel Calcium og mitokondriemembranen Potentiale i levende celler ved Fluorescent Microscopy

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse af Cellesuspensioner isoleret fra Solid Væv af Spectral flowcytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...