Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

We danken de UNIL flow Cytometry core faciliteit voor hun ondersteuning, vooral Dr. Romain bedel. Dit werk werd gesteund door de Kristian Gerhard Jebsen Stichting Grant aan N. V en AG

Alle in het manuscript beschreven experimenten volgen de richtlijnen van onze instelling en zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Zwitserse wetgeving inzake dierproeven (vergunning: VD3194) en voor onderzoek waarbij menselijke monsters worden betrokken (Protocol: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. hematopoietische stamcel extractie
<ol><li>Koop wild type C57BL6/J muizen en bewaar ze gedurende ten minste een week in het dieren huis om transport-gerelateerde stress te verminderen.</li>
	<li>Op ...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

Een strakke regulering van de HSC-functie is belangrijk om stabiele hematopoiese te handhaven tijdens de levensduur van een organisme. Net als verschillende andere celtypen in het lichaam, een belangrijke component die bijdraagt aan de regulering van de functie HSC is cellulaire metabolisme. Eerdere studies van ons lab9 en anderen2,3 hebben het belang van mitochondriën betrokken bij het handhaven van een duidelijke metabole toestand in hs...

Hematopoietische stamcellen (HSCs) zijn een kleine populatie van cellen die zich in het beenmerg bevinden en zorgen voor bloed productie en homeostase gedurende de levensduur van een organisme. HSCs bemiddel dit proces door de aanleiding te geven tot voor ouders die op hun beurt terminaal gedifferentieerde rijwaarden van volwassen bloedcellen produceren via verschillende ronden celdeling en goed georkestreerde differentiatie stappen1. Belangrijker, HSCs produceren hun energie via anaerobe glycolyse. In tegenstelling, meer geëngageerde en actieve hematopoietische voor ouders schakelen hun metabolisme naar mitochondriale metabolisme2,3,4. Deze verschillende metabole toestand wordt verondersteld om de hscs beschermen tegen cellulaire schade toegebracht door reactieve zuurstof soorten (Ros) geproduceerd door actieve mitochondriën, waardoor hun lange termijn in vivo functie5,6,7,8. Directe meting van de metabole toestand van HSC is uitdagend en vaak een lage doorvoer vanwege hun beperkte aantallen. Hier beschrijven we een flow cytometrie-gebaseerde assay voor robuuste meting van het Mitochondriale membraanpotentiaal (ΔΨm) met behulp van tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM) fluorescentie en mitochondriale massa met behulp van een groene fluorescerende mitochondriale vlek (Mitotracker Green) in HSCs. We hebben eerder aangetoond dat low ΔΨm een bona fide functionele marker is van zeer gezuiverde hscs9 en metabole modulatoren die in staat zijn om ΔΨm Verbeter hscs functie9,10te verlagen. Hier stellen we voor om gebruik te maken van onze methode op HSCs mitochondriale profilering als strategie om nieuwe moleculen te identificeren die in staat zijn om het Long-term bloed reconstitutie potentieel van de HSCs te verbeteren.
Als voorbeeld tonen we aan dat deze assay de verlaging van HSC ΔΨm op betrouwbare wijze meet bij blootstelling aan vitamine B3 analoge Nicotinamide riboside (NR). Dienovereenkomstig, in onze onlangs gepubliceerde studie laten we zien dat NR sterk verbetert bloed herstel posttransplantatie in zowel muis en gehumaniseerd muis systemen door direct te verbeteren hematopoietische stam en voorlopercellen functies10. De capaciteit van dergelijke metabole modulatoren is van grote klinische waarde gezien het feit dat een 25% sterftecijfer is gekoppeld aan vertraging in bloed en immuun herstel bij postgetransplanteerde patiënten11,12.
Bovendien leveren wij bewijs dat deze methodologie kan worden toegepast voor de karakterisering van het metabolische profiel en de functie van menselijke T-cellen. In de afgelopen jaren is de ontwikkeling van adoptie celtherapie (ACT) met behulp van autologe tumor infiltrerende lymfocyten (TILs) de meest effectieve aanpak geworden voor bepaalde vormen van gevorderde kanker met extreem ongunstige prognose (bijv. gemetastaseerd melanoom, waarbij > 50% van de patiënten op de behandeling reageert en tot 24% van de patiënten volledige regressie heeft)13. Echter, TILs harkotteren voldoende antitumorale activiteit zijn moeilijk te genereren14. De uitgebreide proliferatie en stimulatie die TILs ondergaan tijdens de ex-vivo-expansie veroorzaken T-cel uitputting en senescentie die de antitumorale respons van de T-cel drastisch aantasten15. Belangrijk is dat de antitumorele capaciteit van de tils nauw verbonden is met hun metabolisme16,17 en benaderingen die gericht zijn op het moduleren van metabolisme door de remming van het PI3K/Akt-traject, positieve resultaten hebben opgeleverd18,19. Om deze reden vergelijken we de ΔΨm van T-cellen die zijn afgeleid van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) en TILs die afkomstig zijn van de patiënt, en laten zien dat minder gedifferentieerde PBMC-afgeleide T-cellen een lagere ΔΨm en mitochondriale massa hebben in vergelijking met terminaal gedifferentieerde TILs.
We stellen voor dat deze test kan worden gebruikt om nieuwe metabole modulatoren te identificeren die de functie HSC en T Cell verbeteren via de modulatie van ΔΨm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

Een fijne balans van quiescentie, zelf vernieuwing en differentiatie is de sleutel om de hematopoietische stamcel (HSC) pool te behouden en levenslange productie van alle volwassen bloedcellen te handhaven. In de afgelopen jaren is cellulaire metabolisme ontstaan als een cruciale regulator van HSC functie en het lot. We hebben eerder aangetoond dat modulatie van mitochondriale metabolisme invloed heeft op HSC Fate. Met name door chemisch ontkoppelen van de elektronentransport keten konden we de HSC-functie behouden in cultuuromstandigheden die normaliter een snelle differentiatie veroorzaken. Het beperken van HSC-nummers verzet zich echter vaak tegen het gebruik van Standaardtesten om het HSC-metabolisme te meten en daarom hun functie te voorspellen. Hier rapporteren we een eenvoudige Flowcytometrie assay die betrouwbare meting van het mitochondriale membraan potentieel en mitochondriale massa in schaarse cellen zoals HSCs mogelijk maakt. We bespreken de isolatie van HSCs van muis beenmerg en meting van de mitochondriale massa en membraan potentiële post ex vivo cultuur. Als voorbeeld tonen we de modulatie van deze parameters in HSCs via behandeling met een metabole modulator. Bovendien verlengen we de toepassing van deze methodologie op menselijk perifeer bloed-afgeleide T-cellen en humane tumor infiltrerende lymfocyten (TILs), met dramatische verschillen in hun mitochondriale profielen, mogelijk weerspiegelen verschillende T-cel Functionaliteit. Wij geloven dat deze assay kan worden gebruikt in screenings om modulatoren van mitochondriale metabolisme in verschillende celtypen in verschillende contexten te identificeren.

In Figuur 1 tonen we de gating strategie voor de isolatie van hematopoietische stamcellen uit het beenmerg van de muis en de lay-out van de plaat voor hun ex vivo cultuur. Figuur 1a toont de identificatie van de LYMFOCYTEN Fractie in de SSC-A/FSC-a plot. Doublets werden verwijderd in de singlet Gate gevolgd door de identificatie van levende cellen door de afwezigheid van DAPI-signaal. De LKS populatie, gedefinieerd door Lineage-Sca1+c...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Dit protocol is een eenvoudige flow cytometrie gebaseerde test waardoor meting van mitochondriale membraan potentieel en mitochondriale massa in levende cellen. Standaard metabolische testen mislukken bij het werken met zeldzame populaties zoals de hematopoietische stamcellen. Deze methode stelt gebruikers in staat mitochondriale membraanprofilering te gebruiken bij het werken met een laag aantal cellen en om nieuwe metabole modulatoren van cellen zoals de HSCs te bepalen.Bovendien u het combineren met downstream functionele tests zoals beenmergtransplantatie of kolonievormende testen om de functionaliteit van uw cellen na de cultuur te bepalen. Onze techniek kan worden benut voor de identificatie van nieuwe moleculen die de HSC-functie kunnen verbeteren in het kader van beenmergtransplantatie en hematopoietisch immuunherstel na ablatieve therapieën. Zoals beschreven in ons protocol, kan onze methode worden gebruikt om metabole geschiktheid van immuun T-cellen te evalueren.Het is zeer belangrijk dat de cellen hebben minimale blootstelling aan licht na vlekken. Bovendien moet het gebruik van pompremmer verapamil worden opgenomen om de bijdrage van pompeflux te evalueren. Gebruikers moeten zich er echter van bewust zijn dat verapamil het ionische evenwicht diepgaand verstoord en niet kan worden gebruikt om het effect van een metabole modulator op het mitochondriale membraanpotentieel te evalueren.Visuele demonstratie van deze methode is uiterst belangrijk omdat er een aantal kritieke stappen die men nodig heeft om in gedachten te houden bij het werken met een laag aantal cellen, en deze stappen zijn heel vaak ontbreekt in de reguliere kranten die gebruikers lezen op PubMed. Voor FAC sortering wordt de LKS-populatie, gedefinieerd door afstamming negatief, Sca1-positief, cKit-positief geïdentificeerd. Hematopoietische stamcellen van ongeveer vijf tot 10% van de cellen in de LKS-populatie worden geïdentificeerd door gating voor CD150 positieve, CD48 negatieve populatie, aangeduid als HSCs.Na het sorteren van heatopoietische stamcellen, centrifugeer de buizen op 300 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Verwijder voorzichtig het grootste deel van de supernatant zonder los te maken van de pellet, en laat 50 tot 80 microliters op de top van de cel pellet. Resuspend de celpellet in stamcelexpansiemedium tot een eindvolume van 200 microliters.Bereid een steriele weefselkweek behandeld 96 U-bottom goed plaat, en identificeren van de putten waar de cellen zullen worden gekweekt. Breng 100 microliter van 2x basaal medium eerder bereid in deze putten. In de NR goed gemarkeerd, voeg twee microliters van een 100x nicotinamide riboside oplossing.Breng 100 microliters van 2x basaal medium in putten voor kleurbeheersing. Zaad 100 microliters van bereide hematopoietische stamcellen bovenop de putten met 2x basaal medium. Zaad 100 microliter van hele beenmergcellen op putten gemarkeerd als kleuring controles.Voeg 200 microliters autoclaved water toe in alle omringende putten om verdamping van putten die cellen bevatten te verminderen. Plaats de plaat ongestoord in een couveuse op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende 72 uur. Neem de plaat om nicotinamide riboside aan te vullen om de 24 uur, en zet het terug in de couveuse.Voeg aan het einde van de cultuurperiode twee microliters van 100x TMRM-oplossing en twee microliters van 100x groene fluorescerende vlekoplossing toe in elk van de testputten. Voeg twee microliters van 100x TMRM in de TMRM kleuring controle goed. Voeg twee microliters van 100x groene fluorescerende vlek in de MitoTracker kleuring controle goed.Bedek de bovenkant van de plaat met aluminiumfolie. en plaats de plaat terug in een couveuse op 37 graden Celsius in 5%kooldioxide gedurende 45 minuten. Haal de plaat uit de couveuse en vercentrifuge het vijf minuten op 300 keer g.Omkeren van de plaat om de supernatant te verwijderen, en voeg 200 microliter van standaard FACS buffer om opnieuw tepenen. Bedek de plaat met folie. Centrifugeren de plaat op 300 keer g gedurende vijf minuten.Herhaal deze wasstap drie keer. Resuspend de cellen in 200 microliters van FACS buffer, en overdracht naar FACS buizen. Als u de monsters op de stroomcytometer wilt uitvoeren, laadt u eerst de enkele kleurregelaars in de machine en registreert u ten minste 5.000 gebeurtenissen in elke één voor één.Druk in de software op Acquire en vervolgens Record op het dashboard om enkele kleurbesturingselementen te verkrijgen en op te nemen. Druk op Compensatie-instelling en klik op Compensatie berekenen om de compensatie te berekenen. Zodra de compensatie is toegepast, verwerven van de hematopoietic stamcelmonster, en registreren zo veel mogelijk gebeurtenissen.Exporteer de FACS-bestanden van de cytometer en open het bestand op de analysesoftware. Gebruik op FlowJo voorwaartse spreiding en zijverstrooiingsgating om de celpopulatie te identificeren. Identificeer singlets in de volgende poorten en plot vervolgens de DAPI-negatieve fractie die levende cellen vertegenwoordigt.Maak in de live celpoort een contourplot in het TMRM en groen fluorescerend vlekkanaal om respectievelijk mitochondriaal membraanpotentieel en massa te meten. Exporteer de gemiddelde fluorescentieintensiteit van deze twee kanalen in de live celpoort. Exporteer vervolgens het aandeel cellen in de TMRM low gate in alle monsters.De nicotinamide riboside behandeling toonde een duidelijke toename van de TMRM lage bevolking. Het verhoogde ook aanzienlijk het aandeel cellen in de TMRM lage poort en toonde een significante verlaging van de TMRM fluorescentie intensiteit. Mitochondriale massa veranderde niet op nicotinamide riboside suppletie.Bovendien werd de kleuring van de stamcelmarkering gecombineerd met mitochondriale kleuring na de cultuur. Met de gating strategie om hematopoietische stamcellen te identificeren, blootstelling aan nicotinamide riboside toonde een aanzienlijke toename van de TMRM lage populatie en een aanzienlijke daling van de TMRM fluorescentie intensiteit in gated HSCs. De groene fluorescerende mitochondriale vlek groen signaal bleef ongewijzigd in de twee omstandigheden.Het is belangrijk om de kleurplaat te bedekken met aluminiumfolie om de blootstelling van licht aan gekleurde monsters te minimaliseren. Deze methode kan worden gecombineerd met downstream tests zoals beenmergtransplantatie en kolonievormende testen om de functionaliteit van uw stamcellen te bepalen. Dus deze techniek maakt een eenvoudige screening methode voor de identificatie van nieuwe metabole modulatoren van HSCs.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Kwantitatieve meting van GLUT4 translocatie naar de plasmamembraan door middel van flowcytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-dimensionale Tracking van hematopoietische stamcellen en progenitorcellen in volwassen muis calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosole Calcium Metingen in Renal epitheelcellen door flowcytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar cardiomyocyten en karakterisering door flowcytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Gelijktijdige meting van mitochondriale calcium en mitochondriale membraan potentieel in levende cellen door fluorescentie microscopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse van celsuspensies Geïsoleerd van vaste weefsels door Spectral flowcytometrie

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...