Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Wir danken der UNIL Flow Cytometry Core Facility für ihre Unterstützung, insbesondere Dr. Romain Bedel. Diese Arbeit wurde durch das Stipendium der Kristian Gerhard Jebsen Stiftung an N.V. und O.N. unterstützt.

Alle im Manuskript beschriebenen Experimente folgen den Richtlinien unserer Institution und wurden nach schweizerischem Tierversuchsrecht (Zulassung: VD3194) und für die Forschung an menschlichen Proben durchgeführt (Protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Hämatopoetische Stammzellextraktion
<ol><li>Kaufen Sie wilde Mäuse des Typs C57BL6/J und halten Sie sie mindestens eine Woche im Tierheim, um transportassoziierten Stress zu reduzieren.</li>
	<li>Am Tag des Experiments, euthanisieren ...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

Eine strenge Regulierung der HSC-Funktion ist wichtig, um eine stabile Hämatopoese während der Lebensdauer eines Organismus aufrechtzuerhalten. Wie verschiedene andere Zelltypen im Körper ist ein Schlüsselbestandteil, der zur Regulierung der HSC-Funktion beiträgt, der Zellstoffwechsel. Frühere Studien aus unserem Labor9 und anderen2,3 haben die Bedeutung von Mitochondrien für die Aufrechterhaltung eines ausgeprägten Stoffwechselzus...

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) sind eine kleine Population von Zellen, die im Knochenmark leben und die Blutproduktion und Homöostase während der gesamten Lebensdauer eines Organismus gewährleisten. HSCs vermitteln diesen Prozess, indem sie Vorläufer hervorrufen, die wiederum endlos differenzierte reife Blutzelllinien über mehrere Zellteilungsrunden und gut orchestrierte Differenzierungsschritte1erzeugen. Wichtig ist, dass HSCs ihre Energie über anaerobe Glykolykose erzeugen. Im Gegensatz dazu schalten engagiertere und aktive hämatopoetische Vorläufer ihren Stoffwechsel in Richtung mitochondrialer Stoffwechsel2,3,4. Dieser ausgeprägte Stoffwechselzustand wird geglaubt, um die HSCs vor zellulären Schäden durch reaktive Sauerstoffspezies (ROS) durch aktive Mitochondrien verursacht zu schützen, wodurch ihre langfristige in vivo Funktion5,6,7,8. Die direkte Messung des HSC-Stoffwechselzustands ist eine Herausforderung und aufgrund ihrer begrenzten Anzahl oft geringer Durchsatz. Hier beschreiben wir einen strömungszytometriebasierten Assay zur robusten Messung des mitochondrialen Membranpotentials (M) mit Tetramethylrhodinmethylester (TMRM) Fluoreszenz und mitochondrialer Masse unter Verwendung eines grünen fluoreszierenden mitochondrialen Flecks (Mitotracker Green) in HSCs. Wir haben bereits gezeigt, dass low 'm ein bona-fide funktioneller Marker von hochgereinigten HSCs9 und metabolischen Modulatoren ist, die in der Lage sind, die HSCs-Funktion9,10zu verbessern. Hier schlagen wir die Verwendung unserer Methode auf HSCs mitochondriale Profilierung als Strategie zur Identifizierung neuartiger Moleküle vor, die in der Lage sind, das langfristige Rekonstitutionspotenzial der HSCs zu verbessern.
Als Beispiel zeigen wir, dass dieser Assay zuverlässig die Senkung von HSC-M bei Exposition gegenüber Vitamin B3-analogem Nicotinamid-Ribosid (NR) misst. Dementsprechend zeigen wir in unserer kürzlich veröffentlichten Studie, dass NR die Blutrückgewinnung nach der Transplantation sowohl in Maus- als auch in humanisierten Maussystemen stark verbessert, indem es die hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferfunktionen direkt verbessert10. Die Kapazität solcher metabolischen Modulatoren ist von großem klinischen Wert, wenn man bedenkt, dass eine 25% Sterberate mit Verzögerungen bei der Blut- und Immunregeneration bei posttransplantierten Patienten verbunden ist11,12.
Darüber hinaus liefern wir Beweise dafür, dass diese Methode für die Charakterisierung des metabolischen Profils und der Funktion menschlicher T-Zellen angewendet werden kann. In den letzten Jahren ist die Entwicklung der Adoptivzelltherapie (ACT) mit autologen Tumorinfiltrierenden Lymphozyten (TILs) zum effektivsten Ansatz für bestimmte Arten von fortgeschrittenem Krebs mit extrem ungünstiger Prognose (z. B. metastasierendes Melanom, bei dem >50% der Patienten auf eine Behandlung ansprechen und bis zu 24% der Patienten eine vollständige Regression haben)geworden. TiLs, die eine ausreichende Antitumoraktivität haben, sind jedoch schwierig,14zu erzeugen. Die umfangreiche Proliferation und Stimulation, die TILs während der Ex-vivo-Expansion erfahren, verursacht T-Zell-Erschöpfung und Seneszenz, die die T-Zell-Antitumorreaktion dramatisch beeinträchtigen15. Wichtig ist, dass die antitumorale Kapazität der TILs eng mit ihrem Stoffwechsel16,17 verbunden ist und Ansätze, die darauf abzielen, den Stoffwechsel durch die Hemmung des PI3K/Akt-Signalwegs zu modulieren, ermutigende Ergebnisse hervorgebracht haben18,19. Aus diesem Grund vergleichen wir die von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) und patientenabgeleiteten TILs gewonnenen T-Zellen und zeigen, dass weniger differenzierte PBMC-abgeleitete T-Zellen eine niedrigere Und mitochondriale Masse aufweisen als endlos differenzierte TILs.
Wir stellen uns vor, dass dieser Assay verwendet werden kann, um neuartige metabolische Modulatoren zu identifizieren, die die HSC- und T-Zellfunktion durch die Modulation von m verbessern.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

Ein feines Gleichgewicht aus Ruhe, Selbsterneuerung und Differenzierung ist der Schlüssel, um den hämatopoetischen Stammzellpool (HSC) zu erhalten und die lebenslange Produktion aller reifen Blutkörperchen aufrechtzuerhalten. In den letzten Jahren hat sich der Zellstoffwechsel zu einem entscheidenden Regulator der HSC-Funktion und des Schicksals entwickelt. Wir haben bereits gezeigt, dass die Modulation des mitochondrialen Stoffwechsels das Schicksal des HSC beeinflusst. Insbesondere konnten wir durch die chemische Entkopplung der Elektronentransportkette die HSC-Funktion unter Kulturbedingungen aufrechterhalten, die normalerweise eine schnelle Differenzierung induzieren. Die Begrenzung der HSC-Zahlen schließt jedoch häufig die Verwendung von Standard-Assays aus, um den HSC-Stoffwechsel zu messen und daher ihre Funktion vorherzusagen. Hier berichten wir über einen einfachen Durchflusszytometrie-Assay, der eine zuverlässige Messung des mitochondrialen Membranpotenzials und der mitochondrialen Masse in knappen Zellen wie HSCs ermöglicht. Wir diskutieren die Isolierung von HSCs aus dem Knochenmark der Maus und die Messung von mitochondrialen Masse- und Membranpotenzialen nach ex vivo Kultur. Als Beispiel zeigen wir die Modulation dieser Parameter in HSCs über die Behandlung mit einem Metabolenmodulator. Darüber hinaus erweitern wir die Anwendung dieser Methode auf menschliche periphere, blutabgeleitete T-Zellen und menschliche Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TILs), die dramatische Unterschiede in ihren mitochondrialen Profilen aufweisen, die möglicherweise verschiedene T-Zellen widerspiegeln. Funktionalität. Wir glauben, dass dieser Assay in Screenings eingesetzt werden kann, um Modulatoren des mitochondrialen Stoffwechsels in verschiedenen Zelltypen in verschiedenen Kontexten zu identifizieren.

In Abbildung 1 zeigen wir die Gating-Strategie zur Isolierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Mausknochenmark und das Layout der Platte für ihre Ex-vivo-Kultur. Abbildung 1A zeigt die Identifizierung des Lymphozytenanteils im SSC-A/FSC-A-Diagramm. Doublets wurden im Singlet-Gate entfernt, gefolgt von der Identifizierung von lebenden Zellen durch das Fehlen eines DAPI-Signals. Die LKS-Population, definiert durch Abstammung - Sca1+</su...

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Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Hier beschreiben wir eine zuverlässige Methode zur Messung des mitochondrialen Massen- und Membranpotenzials in ex vivo kultivierten hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Dieses Protokoll ist ein einfacher, auf Flusszytometrie basierender Assay, der die Messung des mitochondrialen Membranpotentials und der mitochondrialen Masse in lebenden Zellen ermöglicht. Standard-Metabolische Assays scheitern bei der Arbeit mit seltenen Populationen wie den hämatopoetischen Stammzellen. Diese Methode ermöglicht es Benutzern, mitochondriale Membranprofilierung bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Zellen und neue metabolische Modulatoren von Zellen wie den HSCs zu bestimmen.Darüber hinaus können Sie es mit nachgelagerten funktionellen Assays wie Knochenmarktransplantation oder koloniebildenden Assays kombinieren, um die Funktionalität Ihrer Zellen nach der Kultur zu bestimmen. Unsere Technik kann zur Identifizierung neuartiger Moleküle genutzt werden, die in der Lage sind, die HSC-Funktion im Zusammenhang mit Knochenmarktransplantationen und hämatopoetischer Immunrückgewinnung nach ablativen Therapien zu verbessern. Wie in unserem Protokoll beschrieben, kann unsere Methode verwendet werden, um die metabolische Fitness von Immun-T-Zellen zu bewerten.Es ist sehr wichtig, dass die Zellen nach der Färbung nur minimal lichtdurchäuert werden. Darüber hinaus muss der Einsatz von Pumpeninhibitor verapamil einbezogen werden, um den Beitrag des Pumpenausflusses zu bewerten. Jedoch, Benutzer müssen sich bewusst sein, dass Verapamil zutiefst stört ionisches Gleichgewicht und kann nicht verwendet werden, um die Wirkung eines metabolischen Modulators auf mitochondriale MembranPotenzial zu bewerten.Visuelle Demonstration dieser Methode ist extrem wichtig, weil es einige kritische Schritte gibt, die man bei der Arbeit mit einer geringen Anzahl von Zellen beachten muss, und diese Schritte fehlen sehr oft in den regulären Papieren, die Benutzer auf PubMed lesen. Für die FAC-Sortierung wird die LKS-Population, definiert durch Abstammung negativ, Sca1-positiv, cKit-positiv identifiziert. Hämatopoetische Stammzellen aus etwa fünf bis zehn % der Zellen in der LKS-Population werden durch Gating für CD150-positive CD48-negative Population identifiziert, die als HSCs bezeichnet wird.Nach der hämatopoetischen Stammzellsortierung zentrieren Sie die Rohre bei 300 mal g für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entfernen Sie vorsichtig den größten Teil des Überstandes, ohne das Pellet zu lösen, und lassen Sie 50 bis 80 Mikroliter auf dem Zellpellet. Das Zellpellet im Stammzellausdehnungsmedium auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern aussetzen.Bereiten Sie eine sterile Gewebekultur behandelt 96 U-Boden-Brunnenplatte, und identifizieren Sie die Brunnen, in denen die Zellen kultiviert werden. Übertragen Sie 100 Mikroliter 2x Basalmedium, das zuvor in diesen Brunnen hergestellt wurde. In der nr markierten gut, fügen Sie zwei Mikroliter einer 100x Nicotinamid-Ribosi-Lösung.Übertragen Sie 100 Mikroliter 2x Basalmedium in Brunnen zur Färbekontrolle. Samen 100 Mikroliter vorbereiteter hämatopoetischer Stammzellen auf den Brunnen, die 2x Basalmedium enthalten. Samen 100 Mikroliter ganzer Knochenmarkzellen auf Brunnen, die als Fleckenkontrollen gekennzeichnet sind.Fügen Sie 200 Mikroliter autoklaviertes Wasser in alle umliegenden Brunnen hinzu, um die Verdunstung aus Brunnen, die Zellen enthalten, zu reduzieren. Legen Sie die Platte ungestört in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 72 Stunden. Nehmen Sie den Teller heraus, um Nicotinamid-Ribosi alle 24 Stunden aufzufüllen, und legen Sie ihn wieder in den Inkubator.Am Ende der Kulturperiode zwei Mikroliter 100x TMRM-Lösung und zwei Mikroliter 100x grüne fluoreszierende Fleckenlösung in jede der Testbrunnen geben. Fügen Sie zwei Mikroliter 100x TMRM in die TMRM-Färbungskontrolle gut ein. Fügen Sie zwei Mikroliter von 100x grünen fluoreszierenden Fleck in der MitoTracker Färbung Gut.Bedecken Sie die Oberseite der Platte mit Aluminiumfolie. und legen Sie die Platte wieder in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für 45 Minuten. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator, und zentrifugieren Sie sie bei 300 mal g für fünf Minuten.Invertieren Sie die Platte, um den Überstand zu entfernen, und fügen Sie 200 Mikroliter Standard-FACS-Puffer hinzu, um sie wieder aufzuhängen. Bedecken Sie die Platte mit Folie. Zentrifugieren Sie die Platte bei 300 mal g für fünf Minuten.Wiederholen Sie diesen Waschschritt dreimal. Setzen Sie die Zellen in 200 Mikroliter FACS-Puffer aus und übertragen Sie sie in FACS-Rohre. Um die Proben auf dem Durchflusszytometer auszuführen, laden Sie zuerst die einzelnen Farbsteuerelemente in das Gerät, und zeichnen Sie jeweils mindestens 5.000 Ereignisse auf.Drücken Sie in der Software Acquire and then Record auf dem Dashboard, um einzelne Farbsteuerelemente zu erfassen und aufzuzeichnen. Drücken Sie Compensation Setup, und klicken Sie auf Vergütung berechnen, um die Vergütung zu berechnen. Sobald die Kompensation angewendet wurde, erwerben Sie die hämatopoetische Stammzellprobe und zeichnen Sie so viele Ereignisse wie möglich auf.Exportieren Sie die FACS-Dateien aus dem Zytometer, und öffnen Sie die Datei auf der Analysesoftware. Verwenden Sie in FlowJo Vorwärtsstreuung und Seitenstreuung, um die Zellpopulation zu identifizieren. Identifizieren Sie Singlets in den nächsten Gates, und zeichnen Sie dann den negativen DAPI-Anteil, der lebende Zellen darstellt.Erstellen Sie im Live-Zell-Tor ein Konturdiagramm im TMRM- und grünen fluoreszierenden Fleckenkanal, um das mitochondriale Membranpotenzial bzw. die Masse zu messen. Exportieren Sie die mittlere Fluoreszenzintensität dieser beiden Kanäle im Live-Zell-Gate. Exportieren Sie dann den Anteil der Zellen im TMRM-Low-Gate in allen Proben.Die Behandlung mit Nicotinamid-Ribosi zeigte einen deutlichen Anstieg der TMRM-Armenpopulation. Es erhöhte auch signifikant den Anteil der Zellen im TMRM Low Gate und zeigte eine signifikante Senkung der TMRM-Fluoreszenzintensität. Mitochondriale Masse änderte sich nicht auf Nicotinamid Ribosid Supplementierung.Zusätzlich wurde die Mastzellmarkerfärbung mit der mitochondrialen Färbung nach der Kultur kombiniert. Mit der Gating-Strategie zur Identifizierung hämatopoetischer Stammzellen zeigte die Exposition gegenüber Nicotinamid-Ribosid einen signifikanten Anstieg der TMRM-Niedrigen Population und eine signifikante Abnahme der TMRM-Fluoreszenzintensität in gated HSCs. Das grüne fluoreszierende mitochondriale Fleckgrünsignal blieb in den beiden Bedingungen unverändert.Es ist wichtig, die Färbeplatte mit Aluminiumfolie zu bedecken, um die Lichteinwirkung von Fleckenproben zu minimieren. Diese Methode kann mit nachgelagerten Assays wie Knochenmarktransplantation und koloniebildenden Assays kombiniert werden, um die Funktionalität Ihrer Stammzellen zu bestimmen. Diese Technik ermöglicht eine einfache Screening-Methode zur Identifizierung neuartiger Metabolenmodulatoren von HSCs.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolierung und Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ)

Forschung

Biologie

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Quantitative Messung der GLUT4 Translokation an die Plasmamembran mittels Durchflusszytometrie

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Durchflusszytometrie Reinigung der Maus meiotischen Zellen

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Simultane Messung von Mitochondriale Calcium und mitochondrialen Membranpotentials in lebenden Zellen durch Fluoreszenzmikroskopie

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...