Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

אנו מודים לזרם UNIL Flow מתקן ליבה על תמיכתם במיוחד ד ר רומן Bedel. עבודה זו נתמכת על-ידי מלגת הקרן של כריסטיאן גרהרד בגין נ. ב. וO.N.

כל הניסויים המתוארים בכתב היד מתבצעים לפי ההנחיות של המוסד שלנו ובוצעו בהתאם לחוק השוויצרי לניסויים בבעלי חיים (אישור: VD3194) ולמחקר הכרוך בדגימות אנושיות (פרוטוקול: 235/14; מלצר 2017-00490)
1. שליפת תאי גזע
<ol><li>לרכוש פראי סוג C57BL6/J עכברים ולשמור אותם בבית בעלי חיים לפחות שבוע כדי להפח...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

התקנה הדוקה של הפונקציה HSC חשוב לשמור על המטפיאה יציבה במהלך חייו של אורגניזם. כמו סוגים שונים של תאים אחרים בגוף, רכיב מפתח שתורם לוויסות הפונקציה HSC הוא חילוף החומרים הסלולר. מחקרים קודמים מהמעבדה שלנו9 ואחרים 2,3 יש מעורבים את החשיבות שלהמיטומטר</s...

תאי גזע המטפאות (HSCs) הם אוכלוסייה קטנה של תאים המתגוררים במח העצם להבטיח ייצור דם הומאוסטזיס במהלך חייו של אורגניזם. HSCs מתווך תהליך זה על ידי מתן ושלתי כי בתורו לייצר סופני הבדיל תאי דם בוגרים באמצעות מספר סיבובים של החטיבה התא ו מאורגן היטב שלבים1. חשוב מכך, HSCs לייצר את האנרגיה שלהם באמצעות גליקוליזיס אנאירובית. לעומת זאת, מחויבים יותר פעיל המטפאות ושלתי להחליף את חילוף החומרים שלהם לכיוון חילוף החומרים מיטוכונדריאלי2,3,4. מצב זה מטבולית ברורים הוא האמין להגן על HSCs מפני נזק הסלולר שנגרמו על ידי מינים חמצן תגובתי (ROS) המיוצר על ידי active מיטוa, ובכך שמירה על הטווח הארוך שלהם בפונקציה vivo5,6,7,8. מדידה ישירה של מצב מטבולית HSC היא מאתגרת ולעתים קרובות תפוקה נמוכה בשל המספרים המוגבלים שלהם. כאן, אנו מתארים שיטת הזרימה cy, מבוסס על מדידה חזקה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (ΔΨm) באמצעות מתיל הטטרמתיל (TMRM) ניאון, ומסה מיטוכונדריאלי באמצעות כתם ירוק מיטוכונדריאלי ירוקה (Mitotracker גרין) ב HSCs. הדגמנו בעבר כי נמוך ΔΨm הוא סמן פונקציונלי בתום-בלבד של מטוהרים מאוד HSCs9 ו מודולים מטבולית מסוגל להוריד ΔΨm לשפר HSCs פונקציה9,10. כאן אנו מציעים להשתמש בשיטה שלנו על HSCs פרופיל מיטוכונדריאלי כמו אסטרטגיה כדי לזהות מולקולות הרומן מסוגל לשפר את הפוטנציאל לטווח ארוך של HSCs דם מחדש.
לדוגמה, אנו מדגימים כי האפשרות הזו מודדת באופן אמין את הורדת HSC ΔΨm בעת החשיפה לויטמין B3 באמצעות הריבוסייד (NR). לפיכך, במחקר שפורסם לאחרונה שלנו אנו מדגימים כי ע"נ בחוזקה התאוששות ההתאוששות דם בשני העכבר ההומניסטיים מערכות העכבר על ידי שיפור ישיר גזע המטתית ופונקציות מחולל הקדמון10. הקיבולת של מודולטורים כגון זה הוא בעל ערך קליני גדול בהתחשב בכך 25% שיעור התמותה מקושר לעיכוב בדם והתאוששות החיסונית בחולים מושתלים11,12.
יתר על כן, אנו מספקים ראיות כי מתודולוגיה זו ניתן להחיל על האפיון של פרופיל חילוף החומרים ותפקוד של תאי T האדם. בשנים האחרונות, התפתחות של טיפול בתאים המאמצת (ACT) באמצעות גידול אוטוולוגי החדירה לימפוציטים (TILs) הפך את הגישה היעילה ביותר עבור סוגים מסוימים של סרטן מתקדם עם פרוגנוזה שלילי מאוד (למשל, מלנומה גרורתית, שם > 50% של חולים להגיב לטיפול עד 24% מהחולים יש רגרסיה מלאה)13 עם זאת, TILs מחסה פעילות אנטי סרטניים מספיק קשה ליצור14. התפשטות נרחבת וגירוי כי TILs לעבור במהלך הרחבת לשעבר vivo לגרום לתשישות תא T והזדקנות כי לפגוע באופן דרמטי התגובה תא אנטי הגידול15. חשוב מכך, הקיבולת האנטי מוסרית TILs מקושרת הדוק לחילוף החומרים שלהם16,17 וגישות שמטרתן לווסת את חילוף החומרים באמצעות עיכוב של מסלול PI3K/akt הפיק לעודד תוצאות18,19. מסיבה זו, אנו משווים את ΔΨm של תאים שמקורם בתאי דם היקפיים מוניונקה (PBMCs) ואת החולה נגזר TILs, ולהראות כי הבדיל פחות PBMC-נגזר בתאי T יש ΔΨm נמוך יותר מסה מיטוכונדריאלי לעומת TILs הבדיל סופני.
אנו מסוגלים לדמיין שניתן להשתמש בתיקון זה כדי לזהות מאפטורים מטבולית חדשניים המשפרים את פונקציית התאים HSC ו-T באמצעות האפנון של ΔΨm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

איזון נאה של שקט, התחדשות עצמית, ובידול הוא המפתח כדי לשמר את תא גזע המטבית (HSC) הבריכה ולשמור על ייצור לכל החיים של כדוריות הדם הבוגרות. בשנים האחרונות מטבוליזם הסלולר התפתחה כרגולטור המכריע של הפונקציה HSC והגורל. בעבר הדגמנו כי אפנון של מטבוליזם מיטוכונדריאלי השפעות הגורל HSC. באופן ספציפי, על ידי ביטול צימוד כימית שרשרת התחבורה אלקטרון הצלחנו לשמור על תפקוד HSC בתנאי התרבות, כי בדרך כלל לגרום בידול מהיר. עם זאת, הגבלת מספרי hsc לעתים קרובות מונע את השימוש בבחני למדוד את מטבוליזם hsc ולכן לחזות את תפקידם. כאן, אנו מדווחים על שיטת זרימה פשוטה cy, המאפשרת מדידה אמינה של פוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי מסה מיטוכונדריאלי בתאים נדירים כגון HSCs. אנו דנים בבידוד של HSCs מתוך מח עצם העכבר ומדידה של מסה מיטוכונדריאלי, ממברנה פוטנציאל הפוסט לשעבר vivo התרבות. כדוגמה, אנו מציגים את האפנון של פרמטרים אלה ב HSCs באמצעות טיפול עם מאפנן מטבולית. יתר על כן, אנו להאריך את היישום של מתודולוגיה זו על הגוף האנושי הנגזר דם בתאי T ואת הגידול האנושי החדירה לימפוציטים (TILs), מראה הבדלים דרמטיים פרופילים מיטוכונדריאלי שלהם, אולי המשקף תא T שונים פונקציונליות. אנו מאמינים שניתן ליישם את האפשרות הזאת בהקרנות כדי לזהות מודולטורים של חילוף חומרים מיטוכונדריאלי בסוגי תאים שונים בהקשרים שונים.

באיור 1 , אנו מראים את אסטרטגיית הפריסה לבידוד של תאי גזע המטבטיים מתוך מח עצם העכבר והפריסה של הצלחת עבור תרבות vivo ex שלהם. איור 1A מראה את הזיהוי של שבר לימפוציט ב-אס. אס. אס/fsc-מזימה. כאשר הוסרו ממנו בשער הזינגטים ולאחריו זיהוי תאים חיים על-ידי היעדר א?...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

כאן אנו מתארים שיטה אמינה למדוד מסה מיטוכונדריאלי פוטנציאל קרום בתאי גזע vivo המטפאות לשעבר תאים T.

מדידת מיסת מיטוכונדריאלי ופוטנציאל ממברנה בתאי גזע ותאי T-תאים על ידי זרימה Cy,

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

פרוטוקול זה הוא מוצ"ש פשוט המבוסס על ציטומטריית זרימה המאפשר מדידה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית והמסה המיטוכונדרית בתאים חיים. מיסי מטבוליים סטנדרטיים נכשלים כאשר עובדים עם אוכלוסיות נדירות כגון תאי גזע hematopoietic. שיטה זו מאפשרת למשתמשים פרופיל קרום מיטוכונדריאלי בעת עבודה עם מספר נמוך של תאים ולקבוע אפנונים מטבוליים חדשניים של תאים כגון HSCs.יתר על כן, אתה יכול לשלב את זה עם בדיקות תפקודיות במורד הזרם כגון השתלת מח עצם או בדיקות יוצרות מושבה כדי לקבוע את הפונקציונליות של התאים שלך לאחר התרבות. הטכניקה שלנו יכולה להיות מנוצלת לזיהוי של מולקולות חדשות המסוגלות לשפר את תפקוד HSC בהקשר של השתלת מח עצם והתאוששות חיסונית hematopoietic לאחר טיפולים אבלטיביים. כפי שמתואר בפרוטוקול שלנו, השיטה שלנו יכולה לשמש להערכת כושר מטבולי של תאי T חיסוניים.חשוב מאוד כי התאים יש חשיפה מינימלית לאור לאחר הכתם. יתר על כן, השימוש verapamil מעכבי משאבה יש לכלול על מנת להעריך את התרומה של שפעת המשאבה. עם זאת, משתמשים צריכים להיות מודעים לכך verapamil עמוק מטריד שיווי משקל יוני ולא ניתן להשתמש בהם כדי להעריך את ההשפעה של אפנן מטבולי על פוטנציאל קרום המיטוכונדריאלי.הדגמה חזותית של שיטה זו חשובה ביותר מכיוון שיש כמה צעדים קריטיים שצריך לזכור בעת עבודה עם מספר נמוך של תאים, וצעדים אלה חסרים לעתים קרובות מאוד בעיתונים הרגילים שמשתמשים קוראים ב- PubMed. עבור מיון FAC, אוכלוסיית LKS, המוגדרת על-ידי שושלת שלילית, Sca1 חיובי, cKit חיובי מזוהה. תאי גזע hematopoietic מסביבות חמישה עד 10% מהתאים באוכלוסיית LKS מזוהים על ידי gating עבור CD150 חיובי, CD48 אוכלוסייה שלילית, שכותרתו HSCs.לאחר מיון תאי גזע hematopoietic, צנטריפוגה הצינורות ב 300 פעמים g במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. בעדינות להסיר את רוב supernatant מבלי לסלק את גלולה, ולהשאיר 50 עד 80 microliters על גבי גלולת התא. תן שימוש חוזר את גלולת התא בהרחבת תאי גזע בינוני לנפח סופי של 200 מיקרוליטרים.הכינו תרבות רקמה סטרילית שטופלה ב-96 צלחת בארות U-bottom, וזהו את בארות המקום שבו התאים יתורבו. העבר 100 microliters של מדיום בסיס 2x שהוכן בעבר בארות אלה. ב NR מסומן היטב, להוסיף שני microliters של פתרון ריבוזיד 100x nicotinamide.מעבירים 100 מיקרוליטרים של מדיום בסיס פי 2 לתוך בארות לבקרת כתמים. זרעים 100 microliters של תאי גזע hematopoietic מוכן על גבי הבארים המכילים מדיום בסיס 2x. זרעים 100 מיקרוליטרים של תאי מח עצם שלמים על בארות המסומנים כפקדי כתמים.הוסף 200 מיקרוליטרים של מים autoclaved בכל בארות שמסביב כדי להפחית אידוי מ בארות המכילות תאים. מניחים את הצלחת באין מפריע באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך 72 שעות. מוציאים את הצלחת כדי לחדש את הריבוזיד של הניקוטינמיד כל 24 שעות, ומכניסים אותו בחזרה לאנקובטור.בסוף תקופת התרבות, להוסיף שני microliters של פתרון TMRM 100x ושני microliters של פתרון כתם פלואורסצנטי ירוק 100x בכל בארות הבדיקה. הוסף שני מיקרוליטרים של TMRM 100x בבקרת הכתמים TMRM היטב. הוסיפו שני מיקרוליטרים של כתם פלואורסצנטי ירוק פי 100 בבקרת הכתמים של MitoTracker.מכסים את החלק העליון של הצלחת בנייר אלומיניום. ומ מניחים את הצלחת בחזרה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך 45 דקות. מוציאים את הצלחת מהאינקובטור, וצנטריפוגה אותו ב 300 פעמים גרם במשך חמש דקות.הפוך את הלוח כדי להסיר את העל-טבעי, והוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS סטנדרטי כדי לעשות שימוש חוזר. מכסים את הצלחת בנייר כסף. צנטריפוגה הצלחת ב 300 פעמים g במשך חמש דקות.חזור על שלב כביסה זה שלוש פעמים. תן שימוש חוזר בתאים ב- 200 מיקרוליטרים של מאגר FACS, והעבר לצינורות FACS. כדי להפעיל את הדגימות על ציטומטר הזרימה, טען תחילה את פקדי הצבע הבודדים למכונה והקליט לפחות 5,000 אירועים בכל אחד מהם.בתוכנה, הקש Acquire ולאחר מכן הקלט בלוח המחוונים כדי להשיג ולהקליט פקדי צבע בודדים. לחץ על הגדרת פיצוי ולחץ על חשב פיצוי כדי לחשב את הפיצוי. לאחר החלת הפיצוי, לרכוש את מדגם תאי גזע hematopoietic, ולתרשם אירועים רבים ככל האפשר.יצא את קבצי FACS מהציטרומטר, ופתח את הקובץ בתוכנת הניתוח. ב- FlowJo, השתמש פיזור קדימה פיזור בצד gating כדי לזהות את אוכלוסיית התא. זהה סינגלים בשערים הבאים ולאחר מכן התווה את השבר השלילי DAPI המייצג תאים חיים.בשער התא החי, ליצור חלקת מתאר בתעלת TMRM וכתם פלואורסצנטי ירוק כדי למדוד את הפוטנציאל המיטוכונדריאלי קרום מסה, בהתאמה. ייצוא עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת של שני ערוצים אלה בשער התא החי. לאחר מכן, יצא את חלקם של התאים בשער הנמוך TMRM בכל הדגימות.הטיפול בריבוזיד ניקוטינימיד הראה עלייה ברורה באוכלוסייה הנמוכה של TMRM. זה גם הגדיל באופן משמעותי את שיעור התאים בשער הנמוך TMRM והראה ירידה משמעותית של עוצמת פלואורסצנטיות TMRM. מסה מיטוכונדרית לא השתנה על תוספי ריבוזיד nicotinamide.בנוסף, כתמי סמן תאי גזע שולבו עם כתמים מיטוכונדריאליים לאחר התרבות. עם אסטרטגיית gating לזיהוי תאי גזע hematopoietic, חשיפה ריבוזיד nicotinamide הראה עלייה משמעותית באוכלוסייה נמוכה TMRM וירידה משמעותית בעוצמת פלואורסצנטיות TMRM ב- HSCs מגודרים. האות הירוק של כתם המיטוכונדריה הירוק נותר ללא שינוי בשני התנאים.חשוב לכסות את צלחת הכתמים בנייר אלומיניום על מנת למזער את החשיפה של אור לדגימות מוכתמות. שיטה זו יכולה להיות משולבת עם מיסי במורד הזרם כגון השתלת מח עצם ו assays יוצרי המושבה כדי לקבוע את הפונקציונליות של תאי הגזע שלך. אז טכניקה זו מאפשרת שיטת הקרנה פשוטה לזיהוי אפנונים מטבוליים חדשניים של HSCs.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

בידוד והשתלות של בתאי גזע hematopoietic (HSCs)

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

בידול יעילות גבוה של תאי גזע pluripotent האדם לשריר לב ואפיון על ידי cytometry הזרימה

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

מדידה בו זמנית של סידן מיטוכונדריאלי מיטוכונדריאלי ממברנה פוטנציאלית בתאים חיים באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

ניתוח של המתלים תא מבודד מרקמות Solid ידי זרימת cytometry ספקטרלי

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...