Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

हम उनके समर्थन के लिए यूनिल फ्लो साइटोमेट्री कोर सुविधा विशेष रूप से डॉ रोमेन बेडेल का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को क्रिस्टियन गेरहार्ड जेबसेन फाउंडेशन ग्रांट ने एनवी और ओएन को सपोर्ट किया था ।

पांडुलिपि में वर्णित सभी प्रयोग हमारी संस्था के दिशा-निर्देशों का पालन करते हैं और पशु प्रयोग (प्राधिकरण: VD3194) के लिए स्विस कानून के अनुसार और मानव नमूनों (प्रोटोकॉल: 235/14) से जुड़े अनुसंधान के लिए किए गए थे...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

जीव के जीवनकाल के दौरान स्थिर हेमेटोपोइसिस को बनाए रखने के लिए एचएससी फ़ंक्शन का एक तंग विनियमन महत्वपूर्ण है। शरीर में विभिन्न अन्य सेल प्रकारों की तरह, एचएससी फ़ंक्शन के नियमन में योगदान देने वाला ए...

हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) अस्थि मज्जा में रहने वाली कोशिकाओं की एक छोटी आबादी है जो एक जीव के जीवनकाल में रक्त उत्पादन और होमोस्टोसिस सुनिश्चित करती है। एचएससी ने इस प्रक्रिया को जनकों को जन्म देकर मध्यस्थता की कि बदले में सेल डिवीजन के कई दौरों और अच्छी तरह से करवाया भेदभाव कदम1के माध्यम से मरणासन्न विभेदित परिपक्व रक्त कोशिका वंश का उत्पादन । महत्वपूर्ण बात, एचएससी एनारोबिक ग्लाइकोलाइसिस के माध्यम से अपनी ऊर्जा का उत्पादन करते हैं। इसके विपरीत, अधिक प्रतिबद्ध और सक्रिय हेमेटोपोइटिक जनक अपने चयापचय को माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म2,3,4की ओर स्विच करते हैं। माना जाता है कि यह अलग मेटाबोलिक राज्य एचएससी को सक्रिय माइटोकॉन्ड्रिया द्वारा उत्पादित प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) द्वारा दिए गए सेलुलर नुकसान से बचाता है, जिससे वीवो फ़ंक्शन5,6,7,8में उनकी दीर्घकालिक अवधि को बनाए रखा जाता है। एचएससी मेटाबोलिक राज्य का प्रत्यक्ष माप चुनौतीपूर्ण है और अक्सर उनकी सीमित संख्या के कारण कम थ्रूपुट होता है। यहां, हम एचएससी में हरे फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग (माइटोट्रैकर ग्रीन) का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (टीएमआरएम) फ्लोरेसेंस का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (टीएमआरएम) फ्लोरेसेंस के मजबूत माप नप के लिए प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परख का वर्णन करते हैं। हमने पहले यह दर्शाया है कि कम शुद्ध एचएससी9 और मेटाबोलिक मॉड्यूलर का एक सदाशयी कार्यात्मक मार्कर है जो एचएससी कार्य9,10को कम करने में सक्षम है। यहां हम एचएससी की दीर्घकालिक रक्त पुनर्गठन क्षमता में सुधार करने में सक्षम उपन्यास अणुओं की पहचान करने के लिए रणनीति के रूप में एचएससी माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइलिंग पर अपनी विधि के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं ।
एक उदाहरण के रूप में, हम प्रदर्शित करते हैं कि यह परख विटामिन बी 3 एनालॉग निकोटिनमाइड राइबोसाइड (एनआर) के संपर्क में आने पर एचएससी को कम करने के लिए मज़बूती से मापता है। तदनुसार, हमारे हाल ही में प्रकाशित अध्ययन में हम प्रदर्शित करते हैं कि एनआर सीधे हेमेटोपोइटिक स्टेम और जनककार्यों 10में सुधार करके माउस और मानवीकृत माउस सिस्टम दोनों में रक्त वसूली पोस्टट्रांसप्लांट में सुधार करता है। इस तरह के मेटाबोलिक मॉड्यूलर की क्षमता महान नैदानिक मूल्य की है , यह देखते हुए कि 25% मृत्यु दर11,12के बाद के रोगियों में रक्त और प्रतिरक्षा वसूली में देरी से जुड़ी हुई है ।
इसके अलावा, हम सबूत प्रदान करते हैं कि इस पद्धति को मेटाबोलिक प्रोफाइल और मानव टी कोशिकाओं के कार्य के लक्षण वर्णन के लिए लागू किया जा सकता है। हाल के वर्षों में, ऑटोलोगस ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (TILs) का उपयोग करके दत्तक सेल थेरेपी (अधिनियम) का विकास बेहद प्रतिकूल पूर्वानुमान (जैसे, मेटास्टैटिक मेलानोमा, जहां और 50% रोगियों के उपचार का जवाब देते हैं)13के साथ कुछ प्रकार के उन्नत कैंसर के लिए सबसे प्रभावी दृष्टिकोण बन गया है। हालांकि, पर्याप्त एंटीट्यूमर गतिविधि को शरण देने वाले टीआईएलएसको 14उत्पन्न करना मुश्किल है। पूर्व वीवो विस्तार के दौरान टीआईएल द्वारा किए जाने वाले व्यापक प्रसार और उत्तेजना के कारण टी सेल थकावट और सेनेसेंस होता है जो नाटकीय रूप से टी सेल एंटीट्यूमर प्रतिक्रिया15को ख़राब करता है । महत्वपूर्ण बात यह है कि टीआईएलएस की एंटीट्यूमरल क्षमता उनके मेटाबोलिज्म16,17 से कसकर जुड़ी हुई है और PI3K/Akt मार्ग के अवरोध के माध्यम से चयापचय को मिलाने के उद्देश्य से दृष्टिकोण ने उत्साहजनक परिणाम18,19का उत्पादन किया है । इस कारण से, हम परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) और रोगी-व्युत्पन्न टीएलएस से प्राप्त टी कोशिकाओं की तुलना करते हैं, और बताते हैं कि कम विभेदित पीबीएमसी-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं में मरणासन्न विभेदित टीआईएल की तुलना में कम और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान होता है।
हम कल्पना करते हैं कि इस परख का उपयोग उपन्यास मेटाबोलिक मॉड्यूलर्स की पहचान करने के लिए किया जा सकता है जो एचएससी और टी सेल फ़ंक्शन को बेहतर बनाते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

quiescence, आत्म नवीकरण, और भेदभाव का एक अच्छा संतुलन हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल (एचएससी) पूल को संरक्षित करने और सभी परिपक्व रक्त कोशिकाओं के आजीवन उत्पादन को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । हाल के वर्षों में सेलुलर चयापचय एचएससी समारोह और भाग्य के एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में उभरा है । हमने पहले यह दर्शाया है कि माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म का मॉड्यूलेशन एचएससी भाग्य को प्रभावित करता है। विशेष रूप से, रासायनिक रूप से इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला को अनकपलिंग करके हम संस्कृति की स्थिति में एचएससी फ़ंक्शन को बनाए रखने में सक्षम थे जो आम तौर पर तेजी से भेदभाव को प्रेरित करते हैं। हालांकि, एचएससी संख्या सीमित अक्सर एचएससी चयापचय को मापने के लिए मानक परख के उपयोग को रोकना और इसलिए उनके समारोह की भविष्यवाणी । यहां, हम एक साधारण प्रवाह साइटोमेट्री परख की रिपोर्ट करते हैं जो एचएससी जैसी दुर्लभ कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान के विश्वसनीय माप की अनुमति देता है। हम माउस बोन मैरो से एचएससी के अलगाव और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली संभावित पोस्ट पूर्व वीवो संस्कृति के माप पर चर्चा करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम एक मेटाबोलिक मॉड्यूलर के साथ उपचार के माध्यम से एचएससी में इन मापदंडों का मॉड्यूलेशन दिखाते हैं। इसके अलावा, हम मानव परिधीय रक्त-व्युत्पन्न टी कोशिकाओं और मानव ट्यूमर घुसपैठ लिम्फोसाइट्स (TILs) पर इस पद्धति के आवेदन का विस्तार करते हैं, जो उनके माइटोकॉन्ड्रियल प्रोफाइल में नाटकीय अंतर दिखाते हैं, संभवतः विभिन्न टी सेल को दर्शाती है कार्यक्षमता. हमारा मानना है कि इस परख को विभिन्न संदर्भों में विभिन्न सेल प्रकारों में माइटोकॉन्ड्रियल मेटाबोलिज्म के मॉड्यूलर की पहचान करने के लिए स्क्रीनिंग में नियोजित किया जा सकता है।

चित्रा 1 में हम माउस बोन मैरो से हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल के अलगाव और उनके पूर्व वीवो संस्कृति के लिए प्लेट के लेआउट के लिए गेटिंग रणनीति दिखाते हैं। चित्रा 1ए एसएससी-ए/एफएससी...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

यहां हम पूर्व वीवो सुसंस्कृत हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान और झिल्ली क्षमता को मापने के लिए एक विश्वसनीय विधि का वर्णन करते हैं।

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और टी-सेल में माइटोकॉन्ड्रियल मास और झिल्ली क्षमता का मापन

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

यह प्रोटोकॉल एक साधारण प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित परख है जो जीवित कोशिकाओं में माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान की माप की अनुमति देता है। मानक मेटाबोलिक परखें इस तरह के हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल के रूप में दुर्लभ आबादी के साथ काम करते समय विफल । यह विधि कोशिकाओं की कम संख्या के साथ काम करते समय और एचएससी जैसी कोशिकाओं के उपन्यास मेटाबोलिक मॉड्यूलर निर्धारित करने के लिए उपयोगकर्ताओं को माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली प्रोफाइलिंग में सक्षम बनाती है।इसके अलावा, आप इसे अपनी कोशिकाओं के बाद संस्कृति की कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए बोन मैरो प्रत्यारोपण या कॉलोनी बनाने परख जैसे डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक परख के साथ जोड़ सकते हैं। हमारी तकनीक का दोहन अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण और ablative चिकित्सा के बाद हेमेटोपोइटिक प्रतिरक्षा वसूली के संदर्भ में एचएससी समारोह में सुधार करने में सक्षम उपन्यास अणुओं की पहचान के लिए किया जा सकता है । जैसा कि हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित है, हमारी विधि का उपयोग प्रतिरक्षा टी कोशिकाओं की मेटाबोलिक फिटनेस का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।यह बहुत महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं को धुंधला करने के बाद प्रकाश के लिए कम से कम जोखिम है। इसके अलावा, पंप अवरोधक वेरापमिल के उपयोग को पंप एफ्लक्स के योगदान का मूल्यांकन करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए। हालांकि, उपयोगकर्ताओं को पता होना चाहिए कि वेरापमिल आयनिक संतुलन को गहराई से परेशान करता है और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता पर मेटाबोलिक मॉड्यूलर के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इसका उपयोग नहीं किया जा सकता है।इस विधि का दृश्य प्रदर्शन अत्यंत महत्वपूर्ण है क्योंकि कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें कम संख्या में कोशिकाओं के साथ काम करते समय ध्यान में रखने की आवश्यकता होती है, और ये कदम अक्सर नियमित कागजात में गायब होते हैं जो उपयोगकर्ता PubMed पर पढ़ते हैं। एफएसी छंटाई के लिए, एलकेएस आबादी, वंश नकारात्मक, Sca1 सकारात्मक, cKit सकारात्मक द्वारा परिभाषित की पहचान की है। एलकेएस आबादी में लगभग पांच से 10% कोशिकाओं से हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल की पहचान सीडी 150 सकारात्मक, सीडी 48 नकारात्मक आबादी के लिए गेटिंग द्वारा की जाती है, जिसे एचएससी के रूप में लेबल किया जाता है।हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल छंटाई के बाद, सेंट्रलाइज ट्यूबों को चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर करें। धीरे-धीरे गोली को उखाड़ फेंके बिना अधिकांश सुपरनेट को हटा दें, और सेल पेलेट के शीर्ष पर 50 से 80 माइक्रोलीटर छोड़ दें। स्टेम सेल विस्तार माध्यम में सेल गोली को 200 माइक्रोलीटर की अंतिम मात्रा तक फिर से रीसुस्ल करें।एक बाँझ ऊतक संस्कृति ९६ यू-बॉटम अच्छी तरह से थाली का इलाज तैयार करें, और कुओं की पहचान करें जहां कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया जाएगा । इन कुओं में पहले से तैयार 2x बेसल मीडियम के 100 माइक्रोलीटर ट्रांसफर करें। एनआर में अच्छी तरह से चिह्नित, एक 100x निकोटिनामाइड राइबोसाइड समाधान के दो माइक्रोलीटर जोड़ें।धुंधला नियंत्रण के लिए कुओं में 2x बेसल माध्यम के 100 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करें। 2x बेसल माध्यम वाले कुओं के शीर्ष पर तैयार हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल के बीज 100 माइक्रोलीटर। बीज 100 कुओं पर अस्थि मज्जा कोशिकाओं के माइक्रोलीटर धुंधला नियंत्रण के रूप में चिह्नित।कोशिकाओं वाले कुओं से वाष्पीकरण को कम करने के लिए आसपास के सभी कुओं में ऑटोक्लेवित पानी के २०० माइक्रोलीटर जोड़ें । थाली को 72 घंटे के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में अव्यवस्थित रखें। हर 24 घंटे में निकोटिनामाइड रिबोसाइड की भरपाई करने के लिए प्लेट को बाहर निकालें, और इसे वापस इनक्यूबेटर में डाल दें।संस्कृति अवधि के अंत में, प्रत्येक परीक्षण कुओं में 100x टीएमआरएम समाधान के दो माइक्रोलीटर और 100x हरे फ्लोरोसेंट दाग समाधान के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। टीएमआरएम स्टेनिंग कंट्रोल में 100x टीएमआरएम के दो माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें। माइटोट्रैकर स्टेनिंग कंट्रोल में 100x ग्रीन फ्लोरोसेंट दाग के दो माइक्रोलीटर अच्छी तरह से जोड़ें।एल्यूमीनियम पन्नी के साथ थाली के शीर्ष को कवर करें। और 45 मिनट के लिए 5% कार्बन डाइऑक्साइड में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में वापस प्लेट रखें। इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें, और इसे पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें।सुपरनैंट को हटाने के लिए प्लेट को उलटें, और पुनर्उडपेंड करने के लिए मानक एफएएफएस बफर के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। पन्नी के साथ थाली को कवर करें। पांच मिनट के लिए 300 बार जी पर प्लेट को सेंट्रलाइज करें।इस वाशिंग स्टेप को तीन बार दोहराएं। FACS बफर के 200 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें, और FACS ट्यूबों में स्थानांतरित करें। प्रवाह साइटोमीटर पर नमूनों को चलाने के लिए, पहले एकल रंग नियंत्रण को मशीन में लोड करें, और प्रत्येक एक-एक करके कम से कम 5, 000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।सॉफ्टवेयर में, एकल रंग नियंत्रण प्राप्त करने और रिकॉर्ड करने के लिए डैशबोर्ड पर प्रेस अधिग्रहण और फिर रिकॉर्ड करें। मुआवजा सेटअप दबाएँ, और मुआवजे की गणना करने के लिए मुआवजे की गणना पर क्लिक करें। एक बार मुआवजा लागू हो जाने के बाद, हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल नमूना प्राप्त करें, और यथासंभव अधिक से अधिक घटनाओं को रिकॉर्ड करें।साइटोमीटर से FACS फ़ाइलों का निर्यात करें, और विश्लेषण सॉफ्टवेयर पर फ़ाइल खोलें। फ्लोजो पर, सेल आबादी की पहचान करने के लिए आगे के स्कैटर और साइड स्कैटर गेटिंग का उपयोग करें। अगले द्वार में सिंगल्स की पहचान करें, और फिर लाइव कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करने वाले DAPI नकारात्मक अंश को प्लॉट करें।लाइव सेल गेट में, क्रमशः माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता और द्रव्यमान को मापने के लिए टीएमआरएम और ग्रीन फ्लोरोसेंट दाग चैनल में एक समोच्च साजिश बनाएं। लाइव सेल गेट में इन दोनों चैनलों की औसत फ्लोरेसेंस तीव्रता का निर्यात करें। इसके बाद सभी नमूनों में टीएमआरएम लो गेट में कोशिकाओं के अनुपात का निर्यात करें।निकोटिनमाइड रिबोसाइड ट्रीटमेंट से टीएमआरएम कम आबादी में स्पष्ट वृद्धि दिखाई दी । यह भी काफी TMRM कम फाटक में कोशिकाओं के अनुपात में वृद्धि हुई है और TMRM फ्लोरेसेंस तीव्रता का एक महत्वपूर्ण कम दिखाया । माइटोकॉन्ड्रियल द्रव्यमान निकोटिनामाइड रिबोसाइड पूरकता पर नहीं बदलता था।इसके अतिरिक्त, स्टेम सेल मार्कर धुंधला माइटोकॉन्ड्रियल धुंधला के बाद संस्कृति के साथ संयुक्त किया गया था । हेमेटोपोइटिक स्टेम कोशिकाओं की पहचान करने के लिए गेटिंग रणनीति के साथ, निकोटिनामाइड रिबोसाइड के संपर्क में टीएमआरएम कम आबादी में उल्लेखनीय वृद्धि और गेटेड एचएससी में टीएमआरएम फ्लोरेसेंस तीव्रता में उल्लेखनीय कमी दिखाई गई। ग्रीन फ्लोरोसेंट माइटोकॉन्ड्रियल दाग ग्रीन सिग्नल दो स्थितियों में अपरिवर्तित रहे ।दाग नमूनों के लिए प्रकाश के जोखिम को कम करने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ धुंधला प्लेट को कवर करना महत्वपूर्ण है। इस विधि को आपके स्टेम सेल की कार्यक्षमता निर्धारित करने के लिए बोन मैरो प्रत्यारोपण और कॉलोनी बनाने वाले परख जैसे डाउनस्ट्रीम परखों के साथ जोड़ा जा सकता है। इसलिए यह तकनीक एचएससी के उपन्यास मेटाबोलिक मॉड्यूलर्स की पहचान के लिए एक सरल स्क्रीनिंग विधि की अनुमति देती है।

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

अलगाव और hematopoietic स्टेम सेल का प्रत्यारोपण (HSCs)

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

GLUT4 स्थानान्तरण के मात्रात्मक प्रवाह cytometry द्वारा प्लाज्मा झिल्ली मापन

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

माउस meiotic कक्ष का फ्लो Cytometry शोधन

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

प्ररूपी और murine hematopoietic स्टेम सेल और वंश प्रतिबद्ध progenitors के विश्लेषण से अलगाव

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

सेल डिवीजन ट्रैकिंग सेल रंजक का उपयोग करने की निगरानी के लिए अनुकूलित धुंधला और प्रसार मॉडलिंग तरीकों

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

वयस्क माउस Calvarial अस्थि मज्जा में hematopoietic स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के Vivo 4 आयामी ट्रैकिंग में

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

फ्लो से गुर्दे उपकला कोशिकाओं में साइटोसोलिक कैल्शियम माप

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

फ्लो द्वारा उच्च क्षमता cardiomyocytes को मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव और विशेषता

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Mitochondrial कैल्शियम और mitochondrial झिल्ली के साथ माप फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं में संभावित

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

स्पेक्ट्रल प्रवाह cytometry द्वारा ठोस ऊतकों से पृथक सेल निलंबन का विश्लेषण

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...