Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Ringraziamo l'UNIL Flow Cytometry Core Facility per il loro sostegno, in particolare il Dr. Romain Bedel. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Kristian Gerhard Jebsen a N.V e O.N.

Tutti gli esperimenti descritti nel manoscritto seguono le linee guida della nostra istituzione e sono stati effettuati in conformità con la legge svizzera per la sperimentazione animale (Autorizzazione: VD3194) e per la ricerca su campioni umani (Protocollo: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. Estrazione di cellule staminali ematopoietiche
<ol><li>Acquistare topi di tipo selvatico C57BL6/J e tenerli nella casa degli animali per almeno una settimana per ridurre lo stress associato al trasporto.</...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

Una stretta regolazione della funzione HSC è importante per mantenere l'ematopoiesi stabile durante la vita di un organismo. Come vari altri tipi di cellule nel corpo, un componente chiave che contribuisce alla regolazione della funzione HSC è il metabolismo cellulare. Studi precedenti dal nostro laboratorio9 e altri2,3 hanno implicato l'importanza dei mitocondri nel mantenere uno stato metabolico distinto negli HSC. A causa del numero e...

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono una piccola popolazione di cellule che risiedono nel midollo osseo che assicurano la produzione di sangue e l'omeostasi per tutta la vita di un organismo. Gli HSC mediano questo processo dando origine a progenitori che a loro volta producono lignaggi di cellule del sangue mature differenziate terminalmente tramite diversi cicli di divisione cellulare e passaggi di differenziazione ben orchestrati1. È importante sottolineare che gli HSC producono la loro energia attraverso la glicolisi anaerobica. Al contrario, i progenitori ematopoietici più impegnati e attivi cambiano il loro metabolismo verso il metabolismo mitocondriale2,3,4. Si ritiene che questo stato metabolico distinto protegga gli HSC dai danni cellulari inflitti dalle specie reattive dell'ossigeno (ROS) prodotte dai mitocondri attivi, mantenendo così la loro funzione in vivo a lungo termine5,6,7,8. La misurazione diretta dello stato metabolico HSC è impegnativa e spesso bassa produttività a causa del loro numero limitato. In questo caso, descriviamo un saggio basato sulla citometria di flusso per una misurazione robusta del potenziale della membrana mitocondriale (m) usando la fluorescenza di tetrametilrhodamie (TMRM) e la massa mitocondriale usando una macchia mitocondriale verde (Mitotracker Green) negli HSC. In precedenza abbiamo dimostrato che il basso zofm è un marcatore funzionale in buona fede di HSC9 altamente purificati e modulatori metabolici in grado di abbassare lafunzioneHSC, 9,10. Qui proponiamo l'uso del nostro metodo sulla profilazione mitocondriale degli HSC come strategia per identificare nuove molecole in grado di migliorare il potenziale di ricostituzione del sangue a lungo termine degli HSC.
Ad esempio, dimostriamo che questo test misura in modo affidabile l'abbassamento dell'HSC , che si snoda dopo l'esposizione al riboside alla nicotina analogico di vitamina B3 (NR). Di conseguenza, nel nostro studio recentemente pubblicato dimostriamo che NR migliora fortemente il recupero del sangue posttrapianto in entrambi i sistemi murini e minorati migliorando direttamente le funzioni di stelo e progenitore ematopoietico10. La capacità di tali modulatori metabolici è di grande valore clinico considerando che un tasso di mortalità del 25% è legato al ritardo nel sangue e al recupero immunitario nei pazienti post-trapiantati11,12.
Inoltre, forniamo la prova che questa metodologia può essere applicata per la caratterizzazione del profilo metabolico e della funzione delle cellule T umane. Negli ultimi anni, lo sviluppo della terapia cellulare adottiva (ACT) utilizzando l'infiltrazione autologica del tumore dei linfociti (TIL) è diventato l'approccio più efficace per alcuni tipi di cancro avanzato con prognosi estremamente sfavorevole (ad esempio, melanoma metastatico, dove >50% dei pazienti risponde al trattamento e fino al 24% dei pazienti ha una regressione completa)13. Tuttavia, i TIL che ospitano un'attività antitumorale sufficiente sono difficili da generare14. L'estesa proliferazione e stimolazione che i TIL subiscono durante l'espansione ex vivo causano l'esaurimento e la senescenza delle cellule T che compromettono drammaticamente la risposta antitumorale delle cellule T15. È importante sottolineare che la capacità antitumorale dei TIL è strettamente legata al loro metabolismo16,17 e approcci volti a modulare il metabolismo attraverso l'inibizione del percorso PI3K/Akt hanno prodotto risultati incoraggianti18,19 . Per questo motivo, confrontiamo le cellule T derivate dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) e i TIL derivati dal paziente, e mostriamo che le cellule T derivate da PBMC meno differenziate hanno una massa t-m e mitocondriale inferiore rispetto ai TIL differenziati terminalmente.
Ipotichiamo che questo assaggio possa essere utilizzato per identificare nuovi modulatori metabolici che migliorano la funzione delle cellule HSC e T attraverso la modulazione di zm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

Un raffinato equilibrio di quiescenza, auto-rinnovamento e differenziazione è fondamentale per preservare il pool di cellule staminali ematopoietiche (HSC) e mantenere la produzione permanente di tutte le cellule del sangue mature. Negli ultimi anni il metabolismo cellulare è emerso come un regolatore cruciale della funzione ESC e del destino. Abbiamo dimostrato in precedenza che la modulazione del metabolismo mitocondriale influenza il destino HSC. In particolare, sganciando chimicamente la catena di trasporto degli elettroni siamo stati in grado di mantenere la funzione HSC in condizioni di coltura che normalmente inducono una rapida differenziazione. Tuttavia, limitare i numeri HSC spesso preclude l'uso di saggi standard per misurare il metabolismo hSC e quindi prevedere la loro funzione. Qui, segnaliamo un semplice saggio di citometria di flusso che consente la misurazione affidabile del potenziale della membrana mitocondriale e della massa mitocondriale in cellule scarse come gli HSC. Discutiamo l'isolamento degli HSC dal midollo osseo del topo e la misurazione della massa mitocondriale e della membrana potenziale cultura post ex vivo. Ad esempio, mostriamo la modulazione di questi parametri in HSC tramite il trattamento con un modulatore metabolico. Inoltre, estendiamo l'applicazione di questa metodologia sulle cellule T derivate dal sangue periferico umano e sui linfociti infiltranti del tumore umano (TIL), mostrando differenze drammatiche nei loro profili mitocondriali, probabilmente riflettendo diverse cellule T Funzionalità. Crediamo che questo saggio possa essere impiegato negli screening per identificare i modulatori del metabolismo mitocondriale in vari tipi di cellule in contesti diversi.

Nella Figura 1 mostriamo la strategia di gating per l'isolamento delle cellule staminali ematopoietiche dal midollo osseo del topo e il layout della piastra per la loro cultura ex vivo. La figura 1A mostra l'identificazione della frazione dei linfociti nel grafico SSC-A/FSC-A. I doppietti sono stati rimossi nel cancello singolo seguito dall'identificazione delle cellule vive dall'assenza di segnale DAPI. È stata identificata la popolazione LKS,...

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Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Qui descriviamo un metodo affidabile per misurare la massa mitocondriale e il potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche coltivate nell'ex vivo e nelle cellule T.

Misurazione della massa mitocondriale e del potenziale della membrana nelle cellule staminali ematopoietiche e t-cellule da parte della citometria di flusso

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Questo protocollo è un semplice saggio basato sulla citometria a flusso che consente di misurare il potenziale della membrana mitocondriale e la massa mitocondriale nelle cellule viventi. I test metabolici standard falliscono quando si lavora con popolazioni rare come le cellule staminali ematopoietiche. Questo metodo consente agli utenti di profilare la membrana mitocondriale quando lavorano con un basso numero di cellule e di determinare nuovi modulatori metabolici di cellule come gli HSC.Inoltre, puoi combinarlo con saggi funzionali a valle come il trapianto di midollo osseo o test di formazione della colonia per determinare la funzionalità delle tue cellule dopo la coltura. La nostra tecnica può essere sfruttata per l'identificazione di nuove molecole in grado di migliorare la funzione HSC nel contesto del trapianto di midollo osseo e del recupero immunitario ematopoietico dopo terapie ablative. Come descritto nel nostro protocollo, il nostro metodo può essere utilizzato per valutare la forma metabolica delle cellule T immunitarie.È molto importante che le cellule abbiano una minima esposizione alla luce dopo la colorazione. Inoltre, l'uso dell'inibitore della pompa verapamil deve essere incluso per valutare il contributo dell'efflux della pompa. Tuttavia, gli utenti devono essere consapevoli del fatto che il verapamil perturba profondamente l'equilibrio ionico e non può essere utilizzato per valutare l'effetto di un modulatore metabolico sul potenziale della membrana mitocondriale.La dimostrazione visiva di questo metodo è estremamente importante perché ci sono alcuni passaggi critici che è necessario tenere a mente quando si lavora con un numero ridotto di celle e questi passaggi sono molto spesso mancanti nei documenti regolari che gli utenti leggono su PubMed. Per lo smistamento FAC, viene identificata la popolazione LKS, definita da lignaggio negativo, Sca1 positivo, cKit positivo. Le cellule staminali ematopoietiche provenienti da circa il cinque al 10% delle cellule della popolazione LKS sono identificate dalla gating per la popolazione positiva cd150, CD48 negativa, etichettata come HSC.Dopo lo smistamento delle cellule staminali ematopoietiche, centrifugare i tubi a 300 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere delicatamente la maggior parte del supernatante senza sganciare il pellet e lasciare da 50 a 80 microlitri sopra il pellet cellulare. Resuspend il pellet cellulare nel mezzo di espansione delle cellule staminali fino ad un volume finale di 200 microlitri.Preparare una coltura tissutale sterile trattata con 96 piastre del pozzo a U-bottom e identificare i pozzi in cui verranno coltivate le cellule. Trasferire 100 microlitri di mezzo basale 2x precedentemente preparato in questi pozzi. Nella NR contrassegnata bene, aggiungere due microlitri di una soluzione di riboside di nicotinammide 100x.Trasferire 100 microlitri di mezzo basale 2x in pozzi per il controllo della colorazione. Seme 100 microlitri di cellule staminali ematopoietiche preparate sopra i pozzi contenenti 2x mezzo basale. Sementi 100 microlitri di cellule intere del midollo osseo su pozzi contrassegnati come controlli di colorazione.Aggiungere 200 microlitri di acqua autoclavata in tutti i pozzi circostanti per ridurre l'evaporazione da pozzi contenenti cellule. Posizionare la piastra indisturbata in un'incubatrice a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 72 ore. Estraere il piatto per reintegrare il riboside di nicotinammide ogni 24 ore e rimetterlo nell'incubatrice.Alla fine del periodo di coltura, aggiungere due microlitri di soluzione TMRM 100x e due microlitri di soluzione di macchia fluorescente verde 100x in ciascuno dei pozzi di prova. Aggiungere due microlitri di TMRM 100x nel pozzo di controllo della colorazione TMRM. Aggiungere due microlitri di colorazione fluorescente verde 100x nel pozzo di controllo della colorazione MitoTracker.Coprire la parte superiore della piastra con un foglio di alluminio. e riposizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per 45 minuti. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e centrifugarla a 300 volte g per cinque minuti.Invertire la piastra per rimuovere il supernatante e aggiungere 200 microlitri del buffer FACS standard per rimescolare. Coprire il piatto con un foglio. Centrifugare la piastra a 300 volte g per cinque minuti.Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte. Rimospendare le cellule in 200 microlitri di tampone FACS e trasferire ai tubi FACS. Per eseguire i campioni sul citometro di flusso, caricare prima i singoli controlli colore nella macchina e registrare almeno 5.000 eventi in ciascuno per uno.Nel software premere Acquisisci e quindi Registra nel dashboard per acquisire e registrare controlli a colori singoli. Premere Setup retribuzione e fare clic su Calcola retribuzione per calcolare la retribuzione. Una volta applicata la compensazione, acquisire il campione di cellule staminali ematopoietiche e registrare il maggior numero possibile di eventi.Esportare i file FACS dal citometro e aprire il file sul software di analisi. In FlowJo, utilizzare la dispersione in avanti e la dispersione laterale per identificare la popolazione cellulare. Identificare i singoletti nei gate successivi, quindi tracciare la frazione negativa DAPI che rappresenta le celle vive.Nel cancello della cellula viva, creare un appezzamento di contorno nel canale di macchie fluorescenti TMRM e verde per misurare rispettivamente il potenziale e la massa della membrana mitocondriale. Esportare l'intensità media di fluorescenza di questi due canali nel cancello della cellula viva. Quindi, esportare la proporzione di celle nel cancello basso TMRM in tutti i campioni.Il trattamento con riboside nicotinammide ha mostrato un chiaro aumento della bassa popolazione di TMRM. Ha anche aumentato significativamente la proporzione di cellule nel cancello basso TMRM e ha mostrato un significativo abbassamento dell'intensità di fluorescenza TMRM. La massa mitocondriale non cambiò con l'integrazione della nicotinammide riboside.Inoltre, la colorazione marcatore delle cellule staminali è stata combinata con la colorazione mitocondriale post-coltura. Con la strategia di gating per identificare le cellule staminali ematopoietiche, l'esposizione al riboside nicotinammide ha mostrato un aumento significativo della bassa popolazione di TMRM e una significativa diminuzione dell'intensità di fluorescenza TMRM negli HSC gated. Il segnale verde fluorescente mitocondriale verde è rimasto invariato nelle due condizioni.È importante coprire la piastra di colorazione con foglio di alluminio al fine di ridurre al minimo l'esposizione della luce a campioni macchiati. Questo metodo può essere combinato con saggi a valle come il trapianto di midollo osseo e test di formazione della colonia per determinare la funzionalità delle cellule staminali. Quindi questa tecnica consente un semplice metodo di screening per l'identificazione di nuovi modulatori metabolici degli HSC.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e trapianto di cellule staminali emopoietiche (CSE)

Ricerca

Biologia

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