Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
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UNILフローサイトメトリーコア施設は、特にロマン・ベデル博士の支援に感謝します。この作品は、クリスチャン・ゲルハルト・ジェブセン財団がN.VとO.N.に助成金を受け取りました。

原稿に記載されているすべての実験は、当社の機関のガイドラインに従い、動物実験(認証:VD3194)およびヒトサンプルを含む研究のためのスイスの法律に従って行われました(プロトコル:235/14;CER-VD 2017-00490)
1. 造血幹細胞抽出
<ol><li>野生型C57BL6/Jマウスを購入し、輸送関連のストレスを軽減するために、少なくとも1週間動物の家に保管してください。</li>
	<li>実験当日?...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

HSC機能の厳しい調節は、生物の生涯の間に安定した造馬を維持するために重要である。体内の様々な他の細胞タイプと同様に、HSC機能の調節に寄与する重要な成分は細胞代謝である。私たちの研究室9および他の2、3からの以前の研究は、HSCにおける明確な代謝状態を維持する上でミトコンドリアの重要性を含んでいた。マウス骨髄から分離されたHS...

造血幹細胞(HSC)は、生物の生涯を通じて血液産生と恒常性を確保する骨髄に存在する細胞の小さな集団である。HSCは、末端分化した成熟血系統を数ラウンドの細胞分裂および十分に調整された分化ステップ1を介して末端分化した成熟血統を生成する前駆体を生じさせることによって、このプロセスを仲介する。重要なことに、HSCは嫌気性糖分析を介してエネルギーを生成します。対照的に、よりコミットされ、活性造血前駆者は、ミトコンドリア代謝2、3、4に向けて代謝を切り替える。この明確な代謝状態は、活性ミトコンドリアによって産生される活性酸素種(ROS)によって生じた細胞損傷からHSCを保護すると考えられており、それによって、その長期インビボ機能5、6、7、8を維持する。HSC代謝状態の直接測定は困難であり、多くの場合、その限られた数のために低スループットです。ここでは、HSCにおける緑色蛍光ミトコンドリア染色(ミトトラッカーグリーン)を用いたテトラメチルロウダミンメチルエステル(TMRM)蛍光を用いたミトコンドリア膜電位(ΔΔμm)の堅牢測定のためのフローサイトメトリー系アッセイとミトコンドリア塊について説明する。我々は、低ΔΔmが高度に精製されたHSC9のボナフィード機能マーカーであり、ΔΔmを下げることができる代謝モジュレーターがHSC機能9、10を増強することを以前に実証した。ここでは、HSCの長期血液再構成電位を向上させることができる新規分子を同定する戦略として、HSCミトコンドリアプロファイリングに関する手法の利用を提案する。
一例として、このアッセイは、ビタミンB3アナログニコチンアミドリボシド(NR)への曝露時にHSC ΔΔΜmの低下を確実に測定することを実証した。従って、最近発表された研究では、造血幹および前駆体機能10を直接改善することにより、NRがマウスとヒト化マウスシステムの両方で血液回収後移植を強く改善することを実証した。このような代謝調節剤の能力は、25%の死亡率が移植後の患者11、12における血液および免疫回復の遅延に関連していることを考慮すると、大きな臨床的価値がある。
さらに、この方法論がヒトT細胞の代謝プロファイルおよび機能の特徴付けに適用され得る証拠を提供する。近年、自己腫瘍浸潤リンパ球(TI)を用いた養子細胞療法(ACT)の開発は、非常に不利な予後を有する特定のタイプの進行癌に対して最も効果的なアプローチとなっている(例えば、転移性黒色腫、患者の50%が治療に反応し、患者の24%が完全に退行している)13。しかしながら、十分な抗腫瘍活性を有するTLSは14を生成することが困難である。ex vivo膨張の間にTLSが受ける広範な増殖および刺激は、T細胞抗腫瘍応答15を劇的に損なうT細胞の枯渇および老化を引き起こす。重要なことに、TLSの抗腫瘍能は、それらの代謝16、17と密接に関連しており、PI3K/Akt経路の阻害を介して代謝を調節することを目的としたアプローチは、励ましの結果18、19を生み出している。このため、末梢血単核細胞(PBMC)および患者由来TCAL由来のT細胞のΔΔmを比較し、末端分化TLと比較してPBMC由来T細胞の分化が少ないΔΔmおよびミトコンドリア質量が低いことを示しています。
このアッセイは、ΔΔmの変調を介してHSCおよびT細胞機能を改善する新規代謝モジュレーターを同定するために使用できることを想定しています。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

静止、自己再生、分化の微妙なバランスは、造血幹細胞(HSC)プールを維持し、すべての成熟した血液細胞の生涯産生を維持するための鍵です。近年、細胞代謝はHSC機能と運命の重要な調節装置として浮上している。ミトコンドリア代謝の変調がHSCの運命に影響を与えることを以前に実証しました。具体的には、電子輸送鎖を化学的に結合させることで、通常は急速な分化を誘発する培養条件下でHSC機能を維持することができた。しかし、HSC数を制限すると、多くの場合、HSC代謝を測定するために標準アッセイを使用することを妨げ、したがって、その機能を予測します。ここでは、HSCなどの希少細胞におけるミトコンドリア膜電位とミトコンドリア質量の信頼性の高い測定を可能にする簡単なフローサイトメトリーアッセイを報告する。マウス骨髄からのHSCの分離とミトコンドリア質量および膜電位ポストex vivo培養の測定について議論する。一例として、代謝モジュレーターによる治療を介してHSCにおけるこれらのパラメータの変調を示す。さらに、ヒト末梢血由来T細胞およびヒト腫瘍浸潤リンパ球(TI)に対するこの方法論の適用を拡張し、ミトコンドリアプロファイルに劇的な違いを示し、異なるT細胞を反映している可能性がある機能。このアッセイは、様々な細胞型のミトコンドリア代謝の調節剤を異なる文脈で同定するスクリーニングに用いることができると考えています。

図1では、マウス骨髄からの造血幹細胞の分離と、そのex生体内培養のためのプレートのレイアウトに対するゲーティング戦略を示す。図1Aは、SSC-A/FSC-Aプロットにおけるリンパ球画分の同定を示す。ダブレットはシングルトゲートで除去され、続いてDAPIシグナルの不在による生細胞の同定を行った。系統-Sca1+cKit+によって定義される<sup...

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Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

ここでは、生体内培養造血幹細胞およびT細胞におけるミトコンドリア質量および膜電位を測定する信頼性の高い方法について説明する。

造血幹細胞とT細胞におけるミトコンドリア質量と膜電位の測定

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

このプロトコルは、生細胞におけるミトコンドリア膜電位およびミトコンドリア質量の測定を可能にする単純なフローサイトメトリーベースのアッセイである。標準的な代謝アッセイは、造血幹細胞などの稀な集団で働くときに失敗する。この方法により、細胞数が少ない場合にミトコンドリア膜プロファイリングを行い、HSCなどの細胞の新規代謝モジュレーターを決定することができます。また、骨髄移植やコロニー形成アッセイなどの下流機能アッセイと組み合わせて、培養後の細胞の機能性を決定することができます。我々の技術は、骨髄移植およびアブレーション療法後の造血免疫回復の文脈においてHSC機能を改善することができる新しい分子の同定に利用することができる。我々のプロトコルで述べたように、我々の方法は免疫T細胞の代謝適合性を評価するために使用することができる。細胞が染色後に光への暴露を最小限に抑えることを非常に重要です。また、ポンプエフラックスの寄与を評価するためにポンプ阻害剤ベラパミルの使用を含める必要がある。しかし、ユーザーは、ベラパミルがイオン平衡を深く摂動し、ミトコンドリア膜電位に対する代謝変調器の効果を評価するために使用できないことを認識する必要があります。この方法の視覚的なデモンストレーションは、セル数が少ない場合に注意が必要な重要な手順がいくつかあり、ユーザーが PubMed で読む通常の文書では、これらの手順が非常に多く欠けているため、非常に重要です。FAC分類の場合、LKS集団は、リネージュネガティブ、Sca1陽性、cKit陽性によって定義される。LKS集団の約5〜10%の造血幹細胞は、HSCとして標識されたCD150陽性、CD48陰性集団の格言によって同定される。造血幹細胞の選別後、摂氏4度で5分間300倍gのチューブを遠心分離する。ペレットを外さずに上清の大部分を静かに取り除き、細胞ペレットの上に50〜80マイクロリットルを残します。幹細胞拡張培地中の細胞ペレットを200マイクロリットルの最終体積まで再懸濁する。96 U-底ウェルプレートを処理した滅菌組織培養を準備し、細胞が培養されるウェルを特定します。これらのウェルであらかじめ調製した2倍基底培地の100マイクロリットルを移す。よくマークされたNRで、100xニコチンアミドリボシド溶液の2マイクロリットルを追加します。2x基底培地100マイクロリットルを染色制御用のウェルに移します。2x基底培地を含むウェルの上に調製された造血幹細胞の種子100マイクロリットル。染色制御としてマークされた井戸の全体骨髄細胞の種子100マイクロリットル。細胞を含む井戸からの蒸発を減らすために、すべての周囲の井戸に200マイクロリットルのオートクレーブ水を加えます。プレートをインキュベーターに37°Cの2酸化炭素5%で72時間放置します。プレートを取り出して24時間ごとにニコチンアミドリボシドを補充し、インキュベーターに戻します。培養期間の終わりに、100x TMRM溶液の2マイクロリットルと100x緑色蛍光染色液の2マイクロリットルを各試験井戸に加えます。TMRM染色制御に100x TMRMの2マイクロリットルを加えます。MitoTracker染色制御によく100x緑色蛍光染色の2マイクロリットルを加えます。プレートの上部にアルミホイルを覆います。プレートを5%の二酸化炭素で摂氏37度のインキュベーターに45分間戻します。インキュベーターからプレートを取り出し、5分間300回gで遠心分離します。プレートを反転して上清を除去し、200マイクロリットルの標準FACSバッファを追加して再中断します。プレートをホイルで覆います。プレートを300回gで5分間遠心します。この洗浄工程を3回繰り返します。FACSバッファーの200マイクロリットルで細胞を再懸濁し、FACSチューブに移します。フローサイトメーターでサンプルを実行するには、まず単一のカラーコントロールをマシンにロードし、各イベントに少なくとも5,000個のイベントを1つずつ記録します。ソフトウェアで、ダッシュボードの取得と記録を押して、単一のカラーコントロールを取得して記録します。[報酬の設定] を押し、[報酬の計算] をクリックして報酬を計算します。補償が適用されたら、造血幹細胞サンプルを取得し、できるだけ多くのイベントを記録します。サイトメーターからFACSファイルをエクスポートし、解析ソフトウェア上のファイルを開きます。FlowJo では、前方散乱と側面散布のゲージを使用して、細胞の母集団を識別します。次のゲートでシングルを識別し、ライブセルを表すDAPI負の分数をプロットします。生細胞ゲートでは、TMRMと緑色蛍光染色チャネルで輪郭プロットを行い、それぞれミトコンドリア膜電位と質量を測定します。ライブセルゲート内のこれら2つのチャネルの平均蛍光強度をエクスポートします。次に、TMRM 低ゲート内のセルの割合をすべてのサンプルにエクスポートします。ニコチンアミドリボシド治療は、TMRM低集団の明らかな増加を示した。また、TMRM低ゲートにおける細胞の割合を有意に増加させ、TMRM蛍光強度の著しい低下を示した。ミトコンドリア質量はニコチンアミドリボシド補充時に変化しなかった。さらに、幹細胞マーカー染色をミトコンドリア染色ポスト培養と組み合わせた。造血幹細胞を同定するゲーティング戦略では、ニコチンアミドリボシドへの曝露は、TMRMの低集団の有意な増加およびゲート化されたHSCにおけるTMRM蛍光強度の有意な減少を示した。緑色蛍光ミトコンドリア染色グリーンシグナルは、2つの条件で変化しないままであった。染色したサンプルへの光の露出を最小限に抑えるために、染色板をアルミ箔で覆うことが重要です。この方法は、骨髄移植やコロニー形成アッセイなどの下流アッセイと組み合わせて、幹細胞の機能を決定することができます。したがって、この技術は、HSCの新規代謝変調器の同定のための簡単なスクリーニング方法を可能にする。

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

造血幹細胞の分離と移植（造血幹細胞）

生物学

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる細胞膜へのGLUT4転の定量的測定

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

マウス減数分裂細胞のフローサイトメトリーの精製

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

細胞トラッキング染料を使用して細胞分裂監視のための最適化された染色と増殖モデリング方法

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる腎上皮細胞における細胞質ゾルカルシウム測定

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

フローサイトメトリーによる高効率心筋細胞へのヒト多能性幹細胞の分化と特性

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

スペクトラルフローサイトメトリーにより固形組織から単離された細胞懸濁液の分析

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...