Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

우리는 UNIL 흐름 세포 분석 코어 시설의 지원에 특히 로메인 베델 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 N.V와 O.N.에 크리스티안 게르하르트 제브슨 재단 보조금에 의해 지원되었다.

원고에 기재된 모든 실험은 우리 기관의 지침을 따르며 동물 실험에 대한 스위스 법(승인: VD3194) 및 인간 시료와 관련된 연구에 따라 수행되었다(프로토콜: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. 조혈 줄기 세포 추출
<ol><li>야생 형 C57BL6/J 마우스를 구입하고 운송 관련 스트레스를 줄이기 위해 적어도 일주일 동안 동물의 집에 보관하십시오.</li>
	<li>실험 당일,CO2 질식을 사용하여 마?...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

HSC 기능의 엄격한 조절은 유기체의 일생 동안 안정적인 조혈을 유지하는 것이 중요합니다. 본문에 다양 한 다른 세포 유형 처럼, HSC 기능의 조절에 기여 하는 주요 구성 요소는 세포 대사. 우리의 실험실에서 이전 연구9 그리고 다른사람 2,3 HSC에서 뚜렷한 대사 상태를 유지에 미토 콘 드리 아의 중요성을 연루 했다. murine 골수에서 분리 ...

조혈 줄기 세포 (HSCs)는 유기체의 일생 내내 혈액 생산 및 항상성을 지키는 골수에 거주하는 세포의 작은 인구입니다. HSCs는 세포 분열및 잘 조율된 분화 단계1을통해 말단분화 된 성숙한 혈액 세포 혈통을 생성하는 선조를 초래함으로써 이러한 과정을 중재한다. 중요한 것은, HSC는 혐기성 glycolysis를 통해 그들의 에너지를 생성합니다. 대조적으로, 더 헌신적이고 적극적인 조혈 선조는 미토콘드리아 물질 대사를 향해 그들의 신진 대사를 전환2,3,4. 이러한 뚜렷한 대사 상태는 활성 미토콘드리아에 의해 생성된 반응성 산소 종(ROS)에 의해 가해지는 세포 손상으로부터 HSC를 보호하는 것으로 여겨지며, 이에 따라 생체 내에서 장기간 의 기능5,6,7,8을유지한다. HSC 대사 상태의 직접 측정은 그들의 제한된 수로 인해 도전적이고 종종 낮은 처리량입니다. 여기서, 우리는 HSCs에서 녹색 형광 미토콘드리아 스테인(Mitotracker Green)을 이용한 테트라메틸호다민 메틸 에스테르(TMRM) 형광 및 미토콘드리아 질량을 이용한 미토콘드리아 막 전위(ΔΘm)의 강력한 측정을 위한 유세포분석기반 분석기를 기술한다. 우리는 이전에 낮은 ΔΔm이 고도로 정제 된 HSCs9및 ΔΘm을 낮출 수있는 대사 변조기의 보나 - 선의 기능 마커가 HSC 기능9,10을향상시키는 것을 입증했습니다. 여기에서 우리는 HSC의 장기 혈액 재구성 잠재력을 향상할 수 있는 새로운 분자를 확인하기 위한 전략으로 HSCs 미토콘드리아 프로파일링에 대한 우리의 방법을 제안합니다.
일례로, 우리는 이 분석이 비타민 B3 아날로그 니코틴아미드 리보사이드(NR)에 노출될 때 HSC ΔΘm의 하강을 안정적으로 측정한다는 것을 입증한다. 따라서, 최근 발표된 연구에서 NR은 조혈줄기 및 전구 기능을 직접 개선하여 마우스 및 인간화된 마우스 시스템 모두에서 혈액 회복 후 이식을 강력하게 개량한다는 것을 입증한다10. 이러한 대사 조절제의 용량은 이식 후 환자에서 25%의 사망률이 혈액 및 면역 회복의 지연과 관련이 있다는 점을 고려할 때 임상적 가치가크다(11,12).
더욱이, 우리는 이 방법론이 인간 T 세포의 신진 대사 단면도 및 기능의 특성화를 위해 적용될 수 있다는 증거를 제공합니다. 최근 몇 년 동안, 자가 종양 침윤 림프구 (TILs)를 이용한 입양 세포 치료 (ACT)의 개발은 매우 불리한 예후를 가진 특정 유형의 고급 암에 가장 효과적인 접근법이되었습니다 (예를 들어, 전이성 흑색종, 환자의 >50 %가 치료에 반응하고 환자의 최대 24 %가 완전한 회귀를 가지고있습니다). 그러나, 충분한 항종양 활성을 수용하는 TILs는14를생성하기 어렵다. EX 생체 확장 동안 TIL이 겪는 광범위한 증식 및 자극은 T 세포 항종양 반응을 극적으로 손상시키는 T 세포 고갈 및 노화를 야기한다15. 중요한 것은, TILs의 항종양 용량은 그들의 신진대사에 밀접하게 연결되어있으며, 17및 PI3K/Akt 통로의 억제를 통해 신진대사를 조절하기 위한 접근법은 고무적인 결과를18,19로생성했다. 이러한 이유로, 우리는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 환자 유래 TiLs에서 파생 된 T 세포의 ΔΘm을 비교하고, 덜 분화 된 PBMC 유래 T 세포가 말기 분화 된 TiLs에 비해 더 낮은 ΔΔ및 미토콘드리아 질량을 가지고 있음을 보여줍니다.
우리는 이 분석이 ΔΘm의 변조를 통해 HSC와 T 세포 기능을 향상시키는 새로운 대사 조절기를 식별하는 데 사용될 수 있다는 것을 구상합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

정지, 자기 재생 및 분화의 미세 한 균형은 조혈 줄기 세포를 보존하는 열쇠 (HSC) 풀과 모든 성숙한 혈액 세포의 평생 생산을 유지. 최근 몇 년 동안 세포 대사HSC 기능과 운명의 중요 한 레 귤 레이 트로 등장 했다. 우리는 이전에 미토콘드리아 대사의 변조가 HSC 운명에 영향을 미친다는 것을 입증했습니다. 특히, 전자 수송 사슬을 화학적으로 분리함으로써 우리는 일반적으로 급속한 분화를 유도하는 배양 조건에서 HSC 기능을 유지할 수 있었습니다. 그러나, HSC 수를 제한하는 것은 수시로 HSC 물질 대사를 측정하고 그러므로 그들의 기능을 예측하기 위하여 표준 측정법의 사용을 배제합니다. 여기에서, 우리는 HSC와 같은 희소한 세포에 있는 미토콘드리아 막 전위 그리고 미토콘드리아 질량의 믿을 수 있는 측정을 허용하는 간단한 교류 세포 분석분석서를 보고합니다. 우리는 마우스 골수에서 HSC의 격리 및 미토 콘 드리 아 질량 및 막 잠재적인 포스트 생체 배양의 측정을 논의. 예를 들어, 우리는 대사 변조기로 치료를 통해 HSC에서 이러한 매개 변수의 변조를 보여줍니다. 더욱이, 우리는 인간 말초 혈액 유래 T 세포 및 인간 종양침투 림프구 (TILs)에 이 방법의 응용 프로그램을 확장하여 미토콘드리아 프로필에 극적인 차이를 보이며 아마도 다른 T 세포를 반영합니다. 기능. 우리는 이 분석이 다른 문맥에 있는 각종 세포 모형에 있는 미토콘드리아 물질 대사의 변조기를 확인하기 위하여 검열에서 채택될 수 있다는 것을 믿습니다.

도 1에서 우리는 마우스 골수로부터 조혈 줄기 세포의 분리를 위한 게이팅 전략과 그들의 생체 배양에 대한 플레이트의 레이아웃을 보여준다. 도 1A는 SSC-A/FSC-A 플롯에서 림프구 분획의 식별을 나타낸다. 더블ts는 DAPI 신호의 부재에 의해 살아있는 세포의 식별에 이어 단일 게이트에서 제거되었다. 계보-Sca1+cKit+로정의된 LKS ?...

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Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

여기서 우리는 생체배양조 조혈줄기세포 및 T세포에서 미토콘드리아 질량 및 막 전위를 측정하는 신뢰할 수 있는 방법을 설명한다.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

이 프로토콜은 살아있는 세포에서 미토콘드리아 막 전위 및 미토콘드리아 질량을 측정할 수 있는 간단한 유동 세포계 기반 분석입니다. 표준 신진 대사 분석은 조혈 줄기 세포와 같은 희소한 인구로 일할 때 실패합니다. 이 방법은 사용자가 세포의 낮은 수로 작업 할 때 미토콘드리아 막 프로파일링을 가능하게하고 HSC와 같은 세포의 새로운 대사 변조기를 결정할 수 있습니다.더욱이, 당신은 당신의 세포 포스트 배양의 기능을 결정하기 위해 골수 이식 또는 식민지 형성 소와 같은 다운스트림 기능적 작용과 결합 할 수 있습니다. 우리의 기술은 골수 이식및 조혈 면역 회복의 맥락에서 HSC 기능을 향상할 수 있는 새로운 분자의 식별을 위해 이용될 수 있습니다. 우리의 프로토콜에 설명 된 바와 같이, 우리의 방법은 면역 T 세포의 신진 대사 적 적합성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다.세포가 염색 한 후 빛에 최소한의 노출을 갖는 것이 매우 중요합니다. 더욱이, 펌프 억제제 베라파밀의 사용은 펌프 efflux의 기여를 평가하기 위해 포함되어야 한다. 그러나, 사용자는 verapamil 심오닉 평형을 심오하게 perturbs 하 고 미토 콘 드리 아 막 잠재력에 대사 변조기의 효과 평가 하기 위해 사용할 수 없습니다 알고 있어야.이 방법의 시각적 데모는 셀 수가 적은 작업할 때 염두에 두어야 할 몇 가지 중요한 단계가 있기 때문에 매우 중요하며 이러한 단계는 사용자가 PubMed에서 읽는 일반 논문에서 매우 자주 누락됩니다. FAC 정렬의 경우, 계보 네거티브, Sca1 양성, cKit 양성으로 정의된 LKS 모집단이 식별됩니다. LKS 인구에 있는 세포의 약 5에서 10%에서 조혈 줄기 세포는 HSC로 표지된 CD150 양성, CD48 음성 인구에 대한 게이팅에 의해 확인됩니다.조혈 줄기 세포 분류 후, 원심 분리는 섭씨 4도에서 5 분 동안 300 배 g에서 튜브를 분리합니다. 펠릿을 손상시키지 않고 대부분의 상체를 부드럽게 제거하고 셀 펠릿 위에 50~80마이크로리터를 둡니다. 줄기 세포 팽창 매체에서 세포 펠릿을 200 마이크로리터의 최종 부피로 재중단한다.멸균 조직 배양을 준비하여 96U-바닥 우물 플레이트를 처리하고 세포가 배양될 우물을 식별한다. 이전에 이러한 우물에서 제조 된 2 배 기저 배지의 100 마이크로 리터를 전송합니다. NR에서 잘 표시, 100 x 니코틴 아미드 리보 사이드 솔루션의 두 마이크로 리터를 추가합니다.염색 제어를 위해 2배 기저 배지의 100마이크로리터를 우물로 옮기다. 2배 기저매질을 함유한 우물 위에 준비된 조혈 줄기세포의 100마이크로리터를 시드한다. 스테인링 컨트롤로 표시된 우물에 전체 골수 세포의 100 마이크로 리터를 시드.모든 주변 우물에 200 마이크로리터의 오토클레이터를 추가하여 세포가 함유된 우물의 증발을 줄입니다. 72시간 동안 5%의 이산화탄소를 37도의 인큐베이터에 보관하십시오. 24시간마다 니코티나미드 리보사이드를 보충하기 위해 접시를 꺼내 인큐베이터에 다시 넣습니다.배양 기간이 끝나면 각 테스트 웰에 100x TMRM 용액의 마이크로리터 2개와 100x 녹색 형광 얼룩 용액 2개를 추가합니다. TMRM 염색 제어에 100x TMRM의 마이크로리터 2개를 잘 추가합니다. MitoTracker 염색 컨트롤에 100x 녹색 형광 얼룩의 두 개의 마이크로리터를 잘 추가합니다.알루미늄 호일로 접시 의 상단을 덮습니다. 접시를 37°C의 인큐베이터에 다시 놓고 이산화탄소를 5%에서 45분간 조리합니다. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 원심분리기를 300배 g에서 5분간 분리합니다.플레이트를 반전하여 상체를 제거하고 표준 FACS 버퍼 200 마이크로리터를 추가하여 다시 일시 중지합니다. 호일로 접시를 덮습니다. 접시를 300배 g에서 5분간 원심분리합니다.이 세탁 단계를 세 번 반복하십시오. FACS 버퍼의 200 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 FACS 튜브로 전송합니다. 유량 사이토미터에서 샘플을 실행하려면 먼저 단일 색상 컨트롤을 컴퓨터에 로드하고 각각 5, 000개 이상의 이벤트를 하나씩 기록합니다.소프트웨어에서 다운로드를 누르고 대시보드에 기록하여 단일 색상 컨트롤을 획득하고 기록합니다. 보상 설정을 누르고 보상 계산을 클릭하여 보상을 계산합니다. 보상이 적용되면 조혈 줄기 세포 샘플을 획득하고 가능한 한 많은 이벤트를 기록하십시오.사이토미터에서 FACS 파일을 내보내고 분석 소프트웨어에서 파일을 엽니다. FlowJo에서, 세포 인구를 확인하기 위해 전방 산란 및 측면 산란 게이팅을 사용합니다. 다음 게이트에서 싱글을 식별한 다음 라이브 셀을 나타내는 DAPI 음수 분수를 플롯합니다.살아있는 세포 게이트에서, 각각 미토콘드리아 막 전위와 질량을 측정하기 위해 TMRM 및 녹색 형광 얼룩 채널에서 윤곽 플롯을 합니다. 라이브 셀 게이트에서 이 두 채널의 평균 형광 강도를 내보냅니다. 그런 다음 모든 샘플에서 TMRM 로우 게이트에서 셀의 비율을 내보냅니다.니코틴아미드 리보사이드 치료는 TMRM 낮은 인구에 있는 명확한 증가를 보여주었습니다. 또한 TMRM 낮은 게이트에서 세포의 비율을 크게 증가시키고 TMRM 형광 강도의 현저한 저하를 보였다. 미토콘드리아 질량은 니코틴아미드 리보사이드 보충제에 따라 변하지 않았다.또한, 줄기 세포 마커 염색은 미토콘드리아 염색 후 배양과 결합되었다. 조혈 줄기 세포를 식별하는 게이팅 전략으로 니코틴아미드 리보사이드에 대한 노출은 TMRM 저인구의 현저한 증가와 게이트 HSC의 TMRM 형광 강도의 현저한 감소를 보였다. 녹색 형광 미토콘드리아 얼룩 녹색 신호는 두 가지 조건에서 변경되지 않았습니다.염색된 시료에 대한 빛의 노출을 최소화하기 위해 알루미늄 호일로 염색 판을 덮는 것이 중요합니다. 이 방법은 골수 이식 및 콜로니 형성 소법과 같은 다운스트림 소법과 결합하여 줄기 세포의 기능을 결정할 수 있습니다. 따라서 이 기술은 HSC의 새로운 신진 대사 변조기의 식별을위한 간단한 스크리닝 방법을 허용합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

분리 및 조혈 줄기 세포의 이식 (HSCs)

연구

생물학

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

유동세포계측법에 의해 플라즈마 막에 GLUT4 Translocation의 양적 측정

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

마우스 Meiotic 셀 유동세포계측법의 정제

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Murine 조혈 줄기 세포와 리니지 - 헌신 Progenitors의 Phenotypic 분석 및 절연

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

셀 추적 염료를 사용하여 전지 부문 모니터링에 최적화 된 착색 및 확산 모델링 방법

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

유동 세포 계측법에 의한 고효율 심근에 인간 다 능성 줄기 세포의 분화 및 특성

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

형광 현미경으로 살아있는 세포의 잠재적 인 미토콘드리아의 칼슘과 미토콘드리아 막의 동시 측정

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

스펙트럼 유동 세포 계측법에 의해 고체 조직에서 분리 한 세포 현탁액의 분석

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...