Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi takker UNIL Flow flowcytometri Core Facility for deres støtte spesielt Dr. Romain Bedel. Dette arbeidet ble støttet av Kristian Gerhard Jebsen stiftelse stipend til N. V og O.N.

Alle eksperimenter som er beskrevet i manuskriptet følger retningslinjene for institusjonen vår og ble utført i samsvar med sveitsisk lov for dyr eksperimentering (Authorization: VD3194) og for forskning som involverer menneskelige prøver (protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. blodkreft Stem Cell utvinning
<ol><li>Kjøp Wild type C57BL6/J mus og holde dem i dyre huset i minst en uke for å redusere transport-assosiert stress.</li>
	<li>På dagen for eksperimentet, euthanize musen ved ...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

En stram regulering av HSC-funksjonen er viktig for å opprettholde stabile hematopoiesen under kroppens levetid. Som ulike andre celletyper i kroppen, en viktig komponent som bidrar til regulering av HSC-funksjonen er cellulær metabolisme. Tidligere studier fra vår Lab9 og andre2,3 har innblandet viktigheten av mitokondrier i å opprettholde en distinkt metabolske tilstand i HSCs. på grunn av det ekstremt lave antallet HSCs isolert fra...

Blodkreft stamceller (HSCs) er en liten populasjon av celler som er bosatt i benmargen sikre blod produksjon og homeostase gjennom en organisme liv. HSCs megle denne prosessen ved å gi opphav til forfedre som i sin tur produsere uhelbredelig differensiert modne blodlegemer linjene via flere runder med celledeling og godt orkestrert differensiering trinn1. Viktigere, HSCs produsere sin energi via anaerob Glykolysen. I kontrast, mer engasjerte og aktive blodkreft forfedre slå sine metabolisme mot mitokondrie metabolisme2,3,4. Denne distinkte metabolske tilstanden antas å beskytte HSCs fra cellulære skader påført av reaktive oksygen arter (ros) produsert av aktiv mitokondrier, og dermed opprettholde sin langsiktige in vivo-funksjon5,6,7,8. Direkte måling av HSC metabolske tilstand er utfordrende og ofte lav gjennomstrømning på grunn av deres begrensede tall. Her beskriver vi en Flow flowcytometri-basert analyse for robust måling av mitokondrie membran potensial (ΔΨm) bruker tetramethylrhodamine metyl Ester (TMRM) fluorescens, og mitokondrie massen ved hjelp av en grønn fluorescerende mitokondrie flekken (Mitotracker Green) i HSCs. Vi har tidligere vist at lav ΔΨm er en bona-fide funksjonell markør av høyt renset HSCs9 og metabolske modulatorer i stand til å senke ΔΨm forbedre HSCs funksjon9,10. Her foreslår vi bruk av vår metode på HSCs mitokondrie profilering som strategi for å identifisere romanen molekyler i stand til å forbedre HSCs ' langsiktige blod rekonstituering potensial.
Som et eksempel, viser vi at denne analysen pålitelig måler senking av HSC ΔΨm upon eksponering for vitamin B3 analoge nikotinamid riboside (NR). Følgelig, i vår nylig publiserte studien viser vi at NR sterkt ameliorates blod utvinning posttransplant i både mus og humanisert mus systemer ved direkte å forbedre blodkreft stammen og stamfar funksjoner10. Kapasiteten til slike metabolske modulatorer er av stor klinisk verdi med tanke på at en 25% dødsrate er knyttet til forsinkelse i blod og uimottakelig utvinning hos posttransplanted pasienter11,12.
Videre gir vi bevis for at denne metodikken kan anvendes for karakterisering av metabolsk profil og funksjon av menneskelige T-celler. I de senere årene har utviklingen av adoptiv celle terapi (ACT) ved hjelp av autologous tumor infiltrere lymfocytter (TILs) blitt den mest effektive tilnærmingen for visse typer av avansert kreft med ekstremt ugunstig prognose (for eksempel metastatisk melanom, der > 50% av pasientene reagerer på behandling og opptil 24% av pasientene har fullstendig regresjon)13. Men TILs harboring tilstrekkelig antitumor aktivitet er vanskelig å generere14. Den omfattende spredning og stimulering som TILs gjennomgår under ex vivo ekspansjon forårsake T celle utmattelse og senescence som dramatisk svekker T celle antitumor respons15. Viktigere er TILs ' antitumoral kapasitet tett knyttet til metabolismen16,17 og tilnærminger som tar sikte på å modulere metabolisme gjennom hemming av PI3K/akt veien har produsert oppmuntrende resultater18,19. Av denne grunn, sammenligner vi ΔΨm av T-celler avledet fra perifere blod mononukleære celler (Pbmc) og pasient-avledet TILs, og viser at mindre differensiert PBMC-avledet T-celler har lavere ΔΨm og mitokondrie masse i forhold til uhelbredelig differensiert TILs.
Vi ser for oss at denne analysen kan brukes til å identifisere romanen metabolske modulatorer som forbedrer HSC og T celle funksjon via modulering av ΔΨm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

En fin balanse mellom fredfulle omgivelser, selv-fornyelse, og differensiering er nøkkelen til å bevare blodkreft stilk cellen (HSC) basseng og opprettholde livslang produksjon av alle eldre blodlegemer. I de senere årene cellulære metabolisme har dukket opp som en avgjørende regulator av HSC funksjon og skjebne. Vi har tidligere demonstrert at modulering av mitokondrie metabolisme påvirker HSC skjebne. Spesielt ved kjemisk frakobling av elektron transport kjeden var vi i stand til å opprettholde HSC funksjon i kultur forhold som normalt induserer rask differensiering. Men begrenser HSC tall ofte utelukker bruk av standard analyser for å måle HSC metabolisme og derfor forutsi deres funksjon. Her rapporterer vi en enkel flyt flowcytometri analysen som gir pålitelig måling av mitokondrie membran potensial og mitokondrie masse i knappeceller som HSCs. Vi diskuterer isolering av HSCs fra mus benmarg og måling av mitokondrie masse og membran potensial post ex vivo kultur. Som et eksempel, viser vi modulering av disse parametrene i HSCs via behandling med en metabolsk modulator. Videre utvider vi anvendelsen av denne metodikken på menneskelige perifere blod-avledet T celler og menneskelige tumor infiltrere lymfocytter (TILs), viser dramatiske forskjeller i deres mitokondrie profiler, muligens reflekterer ulike T-celle Funksjonalitet. Vi tror denne analysen kan være ansatt i screenings for å identifisere modulatorer av mitokondrie metabolisme i ulike celletyper i ulike sammenhenger.

I figur 1 viser vi gating strategi for isolering av blodkreft stamceller fra musen benmargen og utformingen av platen for deres ex vivo kultur. Figur 1A viser identifisering av LYMFOCYTTER brøkdel i SSC-en/FSC-et plott. Doublets ble fjernet i singlet gate etterfulgt av identifisering av levende celler ved fravær av DAPI signal. LKS-populasjonen, definert av slektslinje-Sca1+cKit+, ble identifisert. Denne populasjonen er k...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Her beskriver vi en pålitelig metode for å måle mitokondrie masse og membran potensial i ex vivo kultivert blodkreft stamceller og T-celler.

Måling av mitokondrie masse og membran potensial i blodkreft stamceller og T-celler ved Flow flowcytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Denne protokollen er en enkel strømningscytometribasert analyse som tillater måling av mitokondriemembranpotensial og mitokondriemasse i levende celler. Standard metabolske analyser mislykkes når du arbeider med sjeldne populasjoner som hematopoetiske stamceller. Denne metoden gjør det mulig for brukere mitokondriemembran profilering når de arbeider med lavt antall celler og å bestemme nye metabolske modulatorer av celler som HSCs.Videre kan du kombinere den med nedstrøms funksjonelle analyser som benmargstransplantasjon eller kolonidannende analyser for å bestemme funksjonaliteten til cellene dine etter kulturen. Vår teknikk kan utnyttes for identifisering av nye molekyler som er i stand til å forbedre HSC-funksjonen i sammenheng med benmargstransplantasjon og hematopoetisk immunutvinning etter ablative terapier. Som beskrevet i vår protokoll, kan vår metode brukes til å evaluere metabolsk kondisjon av immun T-celler.Det er svært viktig at cellene har minimal eksponering for lys etter farging. Videre må bruk av pumpehemmer verapamil inkluderes for å evaluere bidraget fra pumpens effluks. Brukere må imidlertid være klar over at verapamil dypt perturbs ionisk likevekt og ikke kan brukes for å evaluere effekten av en metabolsk modulator på mitokondriemembran potensial.Visuell demonstrasjon av denne metoden er ekstremt viktig fordi det er noen kritiske trinn som man må huske på når man arbeider med lavt antall celler, og disse trinnene mangler svært ofte i de vanlige papirene som brukerne leser på PubMed. For FAC-sortering identifiseres LKS-populasjonen, definert av avstamning negativ, Sca1 positiv, cKit positiv. Hematopoetiske stamceller fra rundt fem til 10% av cellene i LKS-populasjonen identifiseres ved gating for CD150-positiv, CD48 negativ populasjon, merket som HSCer.Etter hematopoetisk stamcellesortering sentrifugerer rørene på 300 ganger g i fem minutter ved fire grader Celsius. Fjern forsiktig det meste av det overnaturlige uten å løsne pelleten, og la 50 til 80 mikroliter på toppen av cellepellet. Resuspend cellepellet i stamcelleekspansjonsmedium til et endelig volum på 200 mikroliter.Forbered en steril vevskultur behandlet 96 U-bunn brønnplate, og identifiser brønnene der cellene vil bli dyrket. Overfør 100 mikroliter 2x basalmedium som tidligere var forberedt i disse brønnene. I NR merket godt, legg til to mikroliter av en 100x nikotinamid riboside løsning.Overfør 100 mikroliter 2x basal medium til brønner for fargekontroll. Frø 100 mikroliter av forberedte hematopoetiske stamceller på toppen av brønnene som inneholder 2x basal medium. Frø 100 mikroliter av hele benmargsceller på brønner merket som farging kontroller.Tilsett 200 mikroliter autoklavet vann i alle omkringliggende brønner for å redusere fordampning fra brønner som inneholder celler. Plasser platen uforstyrret i en inkubator ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i 72 timer. Ta ut platen for å fylle nikotinamid riboside hver 24 timer, og legg den tilbake i inkubatoren.På slutten av kulturperioden legger du til to mikroliter på 100x TMRM-oppløsning og to mikroliter med 100x grønn fluorescerende flekkløsning i hver av testbrønnene. Legg til to mikroliter på 100x TMRM i TMRM-fargekontrollen godt. Tilsett to mikroliter med 100x grønn fluorescerende flekk i MitoTracker-fargekontrollen godt.Dekk toppen av platen med aluminiumsfolie. og plasser platen tilbake i en inkubator ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksid i 45 minutter. Fjern platen fra inkubatoren, og sentrifuger den ved 300 ganger g i fem minutter.Inverter platen for å fjerne det overnaturlige, og tilsett 200 mikroliter standard FACS-buffer for å gjenbruke. Dekk platen med folie. Sentrifuger platen ved 300 ganger g i fem minutter.Gjenta dette vasketrinnet tre ganger. Resuspend cellene i 200 mikroliter facs buffer, og overføre til FACS rør. Hvis du vil kjøre prøvene på strømningssytometeret, må du først laste inn enkeltfargekontrollene i maskinen og registrere minst 5000 hendelser i hver en etter en.Trykk På Hent og deretter Ta opp på instrumentbordet i programvaren for å hente og registrere enkeltfargekontroller. Trykk Kompensasjonsoppsett, og klikk Beregn kompensasjon for å beregne kompensasjonen. Når kompensasjonen er brukt, erverve hematopoetisk stamcelleprøve, og registrere så mange hendelser som mulig.Eksporter FACS filer fra cytometer, og åpne filen på analyseprogramvaren. På FlowJo bruker du scatter- og sidespedspga for å identifisere cellepopulasjonen. Identifiser singleter i de neste portene, og plott deretter dapi-negative fraksjonen som representerer levende celler.I den levende celleporten lager du et konturplott i TMRM og grønn fluorescerende flekkkanal for å måle henholdsvis mitokondriemembranpotensial og masse. Eksporter den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten til disse to kanalene i den levende celleporten. Deretter eksporterer du andelen celler i TMRM lav gate i alle prøver.Den nikotinamid riboside behandling viste en klar økning i TMRM lav befolkning. Det økte også signifikant andelen celler i TMRM lav gate og viste en betydelig senking av TMRM fluorescens intensitet. Mitokondriemasse endret seg ikke ved nikotinamid riboside tilskudd.I tillegg ble stamcellemarkørfarging kombinert med mitokondriefarging etter kultur. Med gating strategien for å identifisere hematopoetiske stamceller, eksponering for nikotinamid riboside viste en betydelig økning i TMRM lav befolkning og en betydelig reduksjon i TMRM fluorescens intensitet i inngjerdet HSCs. Det grønne fluorescerende mitokondrieflekkens grønne signal forble uendret under de to forholdene.Det er viktig å dekke fargeplaten med aluminiumsfolie for å minimere eksponeringen av lys til fargede prøver. Denne metoden kan kombineres med nedstrøms analyser som benmargstransplantasjon og kolonidannende analyser for å bestemme funksjonaliteten til stamcellene dine. Så denne teknikken tillater en enkel screening metode for identifisering av nye metabolske modulatorer av HSCer.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimalisert flekker og spredning modellering Metoder for Celledeling Overvåking hjelp Cell Tracking Fargestoffer

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Sporing av Hematopoietiske Stem og stamceller i Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosolisk Kalsium Målinger i nyre Epitelceller med flowcytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differensiering of Human Pluripotent stamceller til Cardiomyocytes og karakterisering med flowcytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig Måling av mitokondrie Kalsium og Mitokondriell membranpotensialet i levende celler med fluorescerende mikros

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analyse av cellesuspensjoner Isolert fra solid vev ved Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...