Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Мы благодарим основной фонд ЦИтометрии UNIL Flow за их поддержку, особенно д-ра Ромена Беделя. Эта работа была поддержана грантом Фонда Кристиана Герхарда Джебсена N.V и O.N.

Все эксперименты, описанные в рукописи, следуют руководящим принципам нашего учреждения и проводились в соответствии со швейцарским законодательством для экспериментов на животных (Авторизация: VD3194) и для исследований с участием образцов человека (Протокол: 235/14; CER-VD 2017-00490)
<p class="jove_ti...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

Строгое регулирование функции HSC важно для поддержания стабильного гематопоеза в течение жизни организма. Как и различные другие типы клеток в организме, ключевым компонентом, который способствует регуляции функции HSC является клеточный метаболизм. Предыдущие исследования из нашей л?...

Гематопоитические стволовые клетки (ГСК) представляют собой небольшую популяцию клеток, проживающих в костном мозге, обеспечивающих выработку крови и гомеостаза на протяжении всей жизни организма. HSCs посредника этот процесс, порождая прародителей, которые, в свою очередь, производят неизлечимо дифференцированных зрелых линий клеток крови через несколько раундов деления клеток и хорошо организованных шагов дифференциации1. Важно отметить, что HSCs производят свою энергию с помощью анаэробного гликолиза. В отличие от этого, более совершенные и активные гематопоитетические прародители переключают свой метаболизм в сторону митохондриального метаболизма2,3,4. Это четкое метаболическое состояние, как полагают, для защиты HSCs от клеточного повреждения, нанесенного реактивных видов кислорода (ROS), производимых активными митохондриями, тем самым сохраняя их долгосрочные функции in vivo5,6,7,8. Прямое измерение метаболического состояния HSC является сложной задачей и часто низкой пропускной всей связи из-за их ограниченного числа. Здесь мы описываем поток цитометрии на основе анализ для надежного измерения митохондриальной мембраны потенциал (зм) с использованием тетраметилходамамина метил-эфира (TMRM) флуоресценции, и митохондриальной массы с использованием зеленого флуоресцентного митохондриального пятна (MitoGreentracker) в HSCs. Ранее мы продемонстрировали, что низкий йм является добросовестным функциональным маркером высокоочищенных HSCs9 и метаболических модуляторов, способных снижать зм повышения функции HSCs9,10. Здесь мы предлагаем использовать наш метод на HSCs митохондриального профилирования в качестве стратегии для выявления новых молекул, способных улучшить долгосрочный потенциал восстановления крови HSCs.
В качестве примера мы демонстрируем, что этот асссеможно достоверно измеряет снижение HSC-m при воздействии витамина B3 аналогового никотинамида рибозида (NR). Соответственно, в нашем недавно опубликованном исследовании мы демонстрируем, что NR сильно улучшает восстановление крови посттрансплантации в мышиных и гуманизированных систем мыши путем непосредственного улучшения гематопоэтиных стволовых и прародителей функций10. Емкость таких метаболических модуляторов имеет большое клиническое значение, учитывая, что 25% смертности связано с задержкой в крови и иммунного восстановления у пациентов после трансплантации11,12.
Кроме того, мы предоставляем доказательства того, что эта методология может быть применена для характеристики метаболического профиля и функции т-клеток человека. В последние годы, развитие приемной клеточной терапии (ACT) с использованием аутологичных опухолей инфильтрации лимфоцитов (TILs) стала наиболее эффективным подходом для некоторых видов запущенного рака с крайне неблагоприятным прогнозом (например, метастатической меланомы, где йgt;50% пациентов реагируют на лечение и до 24% пациентов имеют полную регрессию)13. Тем не менее, TILs укрывательство достаточной противоопухолевой активности трудно генерировать14. Обширное пролиферация и стимуляция, что TILs проходят во время расширения ex vivo причиной истощения Т-клеток и сенесценции, которые резко ухудшают противоопухолевую реакцию Т-клеток15. Важно отметить, что противоопухолевые способности TILs тесно связаны с ихметаболизмом 16,17 и подходы, направленные на модулирование метаболизма через ингибирование PI3K/ Akt путь дали обнадеживающие результаты18,19. По этой причине мы сравниваем м-м Т-клеток, полученных из периферических моноядерных клеток крови (ПБМК) и ТЭЛ, полученных от пациента, и показываемому, что менее дифференцированные Т-клетки, полученные из PBMC, имеют более низкую и митохондриальную массу по сравнению с неизлечимо дифференцированными Тилами.
Мы предвидим, что этот асссможно использовать для определения новых метаболических модуляторов, которые улучшают функцию HSC и Т-клеток с помощью модуляции км.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

Тонкий баланс покоя, самообновления и дифференциации является ключом к сохранению гематопоитической стволовых клеток (HSC) бассейн и поддерживать пожизненное производство всех зрелых клеток крови. В последние годы клеточный метаболизм стал важнейшим регулятором функции и судьбы HSC. Ранее мы продемонстрировали, что модуляция митохондриального метаболизма влияет на судьбу HSC. В частности, путем химического разъединения цепи транспортировки электронов мы смогли сохранить функцию HSC в культурных условиях, которые обычно вызывают быструю дифференциацию. Однако ограничение числа HSC часто исключает использование стандартных анализов для измерения метаболизма HSC и, следовательно, прогнозирования их функции. Здесь мы сообщаем о простом анализе цитометрии потока, который позволяет надежно измерять потенциал митохондриальной мембраны и митохондриальной массы в дефицитных клетках, таких как ГХК. Мы обсуждаем изоляцию ГХК от костного мозга мыши и измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала после экс-виво культуры. В качестве примера мы показываем модуляцию этих параметров в ГХК с помощью лечения метаболическим модулятором. Кроме того, мы расширяем применение этой методологии на периферической крови человека полученных Т-клеток и опухоли человека проникают лимфоцитов (TILs), показывая значительные различия в их митохондриальных профилей, возможно, отражая различные Т-клетки Функциональность. Мы считаем, что этот анализ может быть использован в скринингах для выявления модуляторов митохондриального метаболизма в различных типах клеток в различных контекстах.

На рисунке 1 мы показываем стратегию gating для изоляции гематопоитических стволовых клеток из костного мозга мыши и макет пластины для их ex vivo культуры. На рисунке 1А показано определение фракции лимфоцитов на участке SSC-A/FSC-A. Даблты были удалены в ...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Здесь мы описываем надежный метод измерения митохондриальной массы и мембранного потенциала в ex vivo культивированных гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках.

Измерение митохондриальной массы и мембранного потенциала в гематопоитических стволовых клетках и Т-клетках по цитометрии потока

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Этот протокол представляет если таков простой анализ цитометрии потока, позволяющий измерять митохондриальный мембранный потенциал и митохондриальную массу в живых клетках. Стандартные метаболические анализы терпят неудачу при работе с редкими популяциями, такими как гематопоэтические стволовые клетки. Этот метод позволяет пользователям митохондриального профилирования мембран при работе с низким количеством клеток и определить новые метаболические модуляторы клеток, таких как HSCs.Кроме того, вы можете объединить его с вниз по течению функциональных анализов, таких как трансплантация костного мозга или колонии формирования анализов для определения функциональности ваших клеток пост-культуры. Наша техника может быть использована для выявления новых молекул, способных улучшить функцию HSC в контексте трансплантации костного мозга и гематопоэтического иммунного восстановления после абляционной терапии. Как описано в нашем протоколе, наш метод может быть использован для оценки метаболической пригодности иммунных Т-клеток.Очень важно, чтобы клетки имеют минимальное воздействие света после окрашивания. Кроме того, использование ингибитора насоса verapamil должны быть включены для того, чтобы оценить вклад насоса эффлюкса. Тем не менее, пользователи должны знать, что верапамил глубоко возмущает ионическое равновесие и не может быть использован для оценки влияния метаболического модулятора на митохондриальный мембранный потенциал.Визуальная демонстрация этого метода чрезвычайно важна, потому что есть некоторые важные шаги, которые нужно иметь в виду при работе с низким количеством ячеек, и эти шаги очень часто отсутствуют в обычных документах, которые пользователи читают на PubMed. Для сортировки FAC определяется популяция LKS, определяемая отрицательными линиями, Sca1 положительными, cKit-положительными. Гематопоэтические стволовые клетки от 5 до 10% клеток в популяции LKS идентифицируются путем gating для CD150 положительные, CD48 отрицательной популяции, помечены как HSCs.После сортировки гематопоэтических стволовых клеток, Центрифуга труб при 300 раз г в течение пяти минут при четырех градусах по Цельсию. Аккуратно удалите большую часть супернатанта, не вытеснив гранулы, и оставьте от 50 до 80 микролитров поверх клеточной гранулы. Повторное распространение клеточных гранул в среде расширения стволовых клеток до конечного объема 200 микролитров.Подготовка стерильной культуры ткани лечение 96 U-дно хорошо пластины, и определить колодцы, где клетки будут культурны. Передача 100 микролитров 2x базальной среды, ранее подготовленной в этих скважинах. В NR отмечены хорошо, добавить два микролитера 100x никотинамид рибозидный раствор.Передача 100 микролитров 2x базальной среды в скважины для контроля окрашивания. Семя 100 микролитров подготовленных гематопоэтических стволовых клеток на верхней части скважин, содержащих 2x базальной среды. Семена 100 микролитров целых клеток костного мозга на скважинах отмечены как окрашивание элементов управления.Добавьте 200 микролитров автоматической воды во все окружающие скважины, чтобы уменьшить испарение из колодцев, содержащих клетки. Поместите пластину спокойно в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 72 часов. Вынул тарелку, чтобы пополнить никотинамид рибозид каждые 24 часа, и положил его обратно в инкубатор.В конце периода культуры добавьте два микролитера 100x TMRM раствора и два микролитера 100x зеленого флуоресцентного раствора пятна в каждой из испытательных скважин. Добавьте два микролитров 100x TMRM в TMRM окрашивания управления хорошо. Добавить два микролитров 100x зеленый флуоресцентные пятна в MitoTracker окрашивания контроля хорошо.Обложка верхней части пластины с алюминиевой фольгой. и поместите пластину обратно в инкубатор при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение 45 минут. Удалить пластину из инкубатора, и центрифуга его в 300 раз г в течение пяти минут.Переверните пластину, чтобы удалить супернатант, и добавьте 200 микролитров стандартного буфера FACS для повторного перерасхода. Накройте тарелку фольгой. Центрифуга пластины в 300 раз г в течение пяти минут.Повторите этот шаг стирки три раза. Повторное использование ячеек в 200 микролитров буфера FACS и передача в трубки FACS. Для запуска образцов на цитометре потока сначала загрузите элементы управления одним цветом в машину и замечьте не менее 5 000 событий в каждом по одному.В программном обеспечении нажмите Acquire, а затем завестите на приборной панели, чтобы приобрести и записать одиночные элементы управления цветом. Нажмите Компенсационая настройка и нажмите Рассчитайте компенсацию для расчета компенсации. После того, как компенсация была применена, приобрести образец гематопоэтических стволовых клеток, и записывать как можно больше событий, как это возможно.Экспорт файлов FACS из цитометра, и открыть файл на анализ программного обеспечения. На FlowJo используйте вперед рассеяние и боковые рассеяния gating для идентификации популяции ячейки. Определите синглеты в следующих воротах, а затем навемит отрицательную фракцию DAPI, представляющую живые ячейки.В живых клеточных ворот, сделать контурный участок в TMRM и зеленый флуоресцентный канал пятна для измерения митохондриальной мембраны потенциал и массу, соответственно. Экспорт средняя интенсивность флуоресценции этих двух каналов в живых ворот ячейки. Затем экспорт доли ячеек в низких воротах TMRM во всех образцах.Никотинамид рибозид лечение показало явное увеличение ТМРМ низкой популяции. Он также значительно увеличил долю клеток в низких воротах TMRM и показал значительное снижение интенсивности флуоресценции TMRM. Митохондриальная масса не меняться при никотинамиде рибозидных добавок.Кроме того, окрашивание маркеров стволовых клеток было объединено с митохондриальным окрашиванием пост-культуры. С gating стратегии для выявления гематопоэтических стволовых клеток, воздействие никотинамида рибозид показал значительное увеличение ТМРм низкой популяции и значительное снижение интенсивности флуоресценции TMRM в закрытых HSCs. Зеленый флуоресцентный митохондриальный пятно зеленый сигнал остался неизменным в двух условиях.Важно, чтобы покрыть окрашивание пластины алюминиевой фольгой, с тем чтобы свести к минимуму воздействие света на окрашенные образцы. Этот метод может быть объединен с вниз по течению анализы, такие как трансплантация костного мозга и колонии формирования анализов для определения функциональности стволовых клеток. Таким образом, этот метод позволяет простой метод скрининга для выявления новых метаболических модуляторов HSCs.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Выделение и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Количественное измерение GLUT4 транслокации к плазматической мембраны с помощью проточной цитометрии

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Проточной цитометрии Очистка мыши мейоза клетки

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Фенотипический анализ и выделение мышей гемопоэтических стволовых клеток и Lineage, совершенных прародителей

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Оптимизирован Окрашивание и распространения методов моделирования для деления клеток Мониторинг использования красителей сотовых слежения

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

В Vivo 4-мерном Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников в взрослой мыши свода черепа костного мозга

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Цитозольные Измерения кальция в почечных эпителиальных клеток методом проточной цитометрии

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

Высокая эффективность Дифференциация человека плюрипотентные стволовые клетки, чтобы кардиомиоцитов и характеристика цитометрическим

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Одновременное измерение митохондриальной кальция и митохондриальной мембраны Потенциал в живых клетках с помощью флуоресцентной микроскопии

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Анализ Суспензии клеток, выделенная из твердых тканей с помощью спектральной проточной цитометрии

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...