Name: measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry
Uploaded: 2019-12-26T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Vi tackar UNIL Flow Cytometry Core facility för deras stöd särskilt Dr Romain Bedel. Detta arbete stöddes av Kristian Gerhard Jebsen Foundation Grant till N. V och O.N.

Alla experiment som beskrivs i manuskriptet följer riktlinjerna från vår institution och genomfördes i enlighet med schweizisk lag för djurförsök (tillstånd: VD3194) och för forskning som inbegriper mänskliga prover (protokoll: 235/14; CER-VD 2017-00490)
1. hematopoietisk stamcells utvinning
<ol><li>Köp Wild Type C57BL6/J möss och förvara dem i djur huset i minst en vecka för att minska transportrelaterad stress.</li>
	<li>På dagen för experimentet, euthanize musen med hjälp...

<ol>
	<li>Busch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+properties+of+unperturbed+haematopoiesis+from+stem+cells+in+vivo.">Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo.</a> Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).</li><li>Simsek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distinct+metabolic+profile+of+hematopoietic+stem+cells+reflects+their+location+in+a+hypoxic+niche.">The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche.</a> Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).</li><li>Takubo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+glycolysis+by+Pdk+functions+as+a+metabolic+checkpoint+for+cell+cycle+quiescence+in+hematopoietic+stem+cells.">Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).</li><li>Yu, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+regulation+by+the+mitochondrial+phosphatase+PTPMT1+is+required+for+hematopoietic+stem+cell+differentiation.">Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation.</a> Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TSC-mTOR+maintains+quiescence+and+function+of+hematopoietic+stem+cells+by+repressing+mitochondrial+biogenesis+and+reactive+oxygen+species.">TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species.</a> Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oxidative+stress+by+ATM+is+required+for+self-renewal+of+haematopoietic+stem+cells.">Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells.</a> Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).</li><li>Ito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+act+through+p38+MAPK+to+limit+the+lifespan+of+hematopoietic+stem+cells.">Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells.</a> Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).</li><li>Tothova, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxOs+are+critical+mediators+of+hematopoietic+stem+cell+resistance+to+physiologic+oxidative+stress.">FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress.</a> Cell. 128 (2), 325-339 (2007).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+haematopoietic+stem+cell+fate+via+modulation+of+mitochondrial+activity.">Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>Vannini, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NAD-Booster+Nicotinamide+Riboside+Potently+Stimulates+Hematopoiesis+through+Increased+Mitochondrial+Clearance.">The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 405 (2019).</li><li>Gratwohl, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+score+for+outcome+after+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation:+a+retrospective+analysis.">Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis.</a> Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).</li><li>Gooley, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+Mortality+after+Allogeneic+Hematopoietic-Cell+Transplantation.">Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation.</a> New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Durable+complete+responses+in+heavily+pretreated+patients+with+metastatic+melanoma+using+T+cell+transfer+immunotherapy.">Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).</li><li>Aranda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trial+Watch:+Adoptive+cell+transfer+for+anticancer+immunotherapy.">Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy.</a> Oncoimmunology. 3, 28344 (2014).</li><li>Wherry, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+exhaustion.">T cell exhaustion.</a> Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).</li><li>Ho, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoenolpyruvate+Is+a+Metabolic+Checkpoint+of+Anti-tumor+T+Cell+Responses.">Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses.</a> Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).</li><li>Chang, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+Competition+in+the+Tumor+Microenvironment+Is+a+Driver+of+Cancer+Progression.">Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression.</a> Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).</li><li>van der Waart, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Akt+signaling+promotes+the+generation+of+superior+tumor-reactive+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy.</a> Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).</li><li>Crompton, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Akt+inhibition+enhances+expansion+of+potent+tumor-specific+lymphocytes+with+memory+cell+characteristics.">Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics.</a> Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).</li><li>de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dye-Independent+Methods+Reveal+Elevated+Mitochondrial+Mass+in+Hematopoietic+Stem+Cells.">Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).</li><li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Conditional+Reporter+Mouse+Lines+at+ROSA26+Locus+For+Live+Cell+Imaging.">Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Membrane+Potential+Identifies+Cells+with+Enhanced+Stemness+for+Cellular+Therapy.">Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy.</a> Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).</li><li>Sukumar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+glycolytic+metabolism+enhances+CD8++T+cell+memory+and+antitumor+function.">Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).</li></ol>

En stram reglering av HSC-funktion är viktigt att upprätthålla stabila hematopoies under en organism livstid. Liksom olika andra celltyper i kroppen, en viktig komponent som bidrar till regleringen av HSC funktion är cellulär metabolism. Tidigare studier från vår Lab9 och andra2,3 har inblandad betydelsen av mitokonskerna att upprätthålla en distinkt metabolisk tillstånd i hscs. på grund av det extremt låga antalet hscs isolera...

Hematopoietiska stamceller (HSCs) är en liten population av celler som är bosatta i benmärgen och säkerställer blod produktion och homeostas under hela organismens livstid. Hscs medla denna process genom att ge upphov till föregångare som i sin tur producerar obotligt differentierade mogna blodkroppar linjer via flera omgångar av celldelning och väl iscensätta differentiering steg1. Viktigare, HSCs producera sin energi via anaerob glykolys. Däremot, mer engagerade och aktiva hematopoietiska stamceller byta sin metabolism mot mitokondriell metabolism2,3,4. Denna distinkta metaboliska tillstånd tros skydda hscs från cellulära skador orsakade av reaktiva syreradikaler (ros) som produceras av aktiva mitokona, och därigenom bibehålla sin långsiktiga in vivo funktion5,6,7,8. Direkt mätning av HSC metaboliska tillstånd är utmanande och ofta låg genomströmning på grund av deras begränsade antal. Här beskriver vi ett flödescytometri-baserat test för robust mätning av mitokondriell membran potential (ΔΨm) med hjälp av tetrametylrodamin metyl Ester (tmrm) fluorescens, och mitokondriell massa med hjälp av en grön fluorescerande mitokondriell fläck (mitotracker grön) i hscs. Vi har tidigare visat att Low ΔΨm är en bona-fide funktionell markör för höggradigt renade hscs9 och metaboliska modulatorer som kan sänka ΔΨm förbättra hscs funktion9,10. Här föreslår vi användning av vår metod på HSCs mitokondriell profilering som strategi för att identifiera nya molekyler som kan förbättra HSCs långsiktiga blodrekonstituering potential.
Som ett exempel visar vi att denna analys på ett tillförlitligt sätt mäter sänkningen av HSC ΔΨm vid exponering för vitamin B3 analog nikotinamid riboside (NR). Följaktligen, i vår nyligen publicerade studie visar vi att nr starkt Ameliorates blod återhämtning transplantation i både mus och humaniserade mus system genom att direkt förbättra hematopoietiska Stem och progenitorfunktioner10. Kapaciteten hos sådana metaboliska modulatorer är av stort kliniskt värde med tanke på att en 25% döds frekvens är kopplad till försening i blod och immun återhämtning hos posttransplanterade patienter11,12.
Dessutom ger vi belägg för att denna metod kan användas för karakterisering av den metaboliska profilen och funktionen hos mänskliga T-celler. Under de senaste åren, utvecklingen av adoptiv cellterapi (ACT) använder autolog tumör infiltrerande lymfocyter (TILs) har blivit den mest effektiva metoden för vissa typer av avancerad cancer med extremt ogynnsamma prognos (t. ex., metastaserande melanom, där > 50% av patienterna svarar på behandling och upp till 24% av patienterna har fullständig regression)13. Men TILs hyser tillräcklig antitumöraktivitet är svåra att generera14. Den omfattande spridning och stimulering som TILs genomgår under ex vivo expansion orsak t cell utmattning och åldras som dramatiskt försämrar t-cell antitumörrespons15. Viktigt, TILs ' antitumöreffekt kapacitet är tätt kopplad till deras metabolism16,17 och metoder som syftar till att modulera metabolism genom hämning av PI3K/akt vägen har producerat uppmuntrande resultat18,19. Av denna anledning, vi jämför ΔΨm av T-celler som härrör från perifera blod mononukleära celler (pbmcs) och patient-derived tils, och visar att mindre differentierade PBMC-härledda T-celler har lägre ΔΨm och mitokondriell massa jämfört med obotligt differentierade TILs.
Vi föreställa att denna analys kan användas för att identifiera nya metaboliska modulatorer som förbättrar HSC och T-cells funktion via modulering av ΔΨm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mL FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-U bottom plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3799</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoMACS pro separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Automatic Cell separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACS AriaIII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Cell sorting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD IMag mouse hematopoietic progenitor cell enrichment kit</td>
			<td>BD</td>
			<td>558451</td>
			<td>Lineage depletion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD LSRII</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>FACS acquisition machine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD-DIVA</td>
			<td>Becton and Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>Acquisition software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115904</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD150 PE-Cy5</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>115912</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD48 PB</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103418</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge- 5810R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Centrifugation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ckit PeCy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>105814</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow jo</td>
			<td>FlowJo LLC</td>
			<td></td>
			<td>FACS Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad-Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td></td>
			<td>Plotting data into graphs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitotracker Green</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>M7514</td>
			<td>Green-fluorescent mitocondrial stain to measure mitochondrial mass; working concentration = 100 nM; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide Riboside (NR)</td>
			<td>Custom synthesized in house</td>
			<td></td>
			<td>Metabolic modulator; working concentration = 500 &#181;M; stock concentration = 50 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>CHUV</td>
			<td>1000324</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep (P/S)</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 1x; stock concentration = 1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420301</td>
			<td>Lysing Red blood cells; working concentration = 1x; stock concentration = 10x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Mouse Flt-3 Ligand (FLT3)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>427-FL-005/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 2 ng/mL; stock concentration = 10 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse stem cell factor (SCF)</td>
			<td>RnD</td>
			<td>455-MC-010/CF</td>
			<td>Ex vivo culture; working concentration = 100 ng/mL; stock concentration = 50 &#181;g/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sca1 APC</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17-5981-82</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemlineII Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>S0192</td>
			<td>Ex vivo culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Pac orange</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S32365</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin Tx red</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>S872</td>
			<td>Antibody staining mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMRM</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T668</td>
			<td>Staining mitochondrial membrane potential; working concentration = 200 nM; stock concentration = 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra pure EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td>Buffer preparation; working concentration = 0.5 M; stock concentration = 1 mM</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial mass and membrane potential in hematopoietic stem cells and t-cells by flow cytometry

En fin balans av quiescence, självförnyelse, och differentiering är nyckeln till att bevara den hematopoietiska stamcells (HSC) pool och upprätthålla livslångt produktion av alla mogna blodkroppar. Under de senaste åren cellulär metabolism har uppstått som en avgörande regulator av HSC funktion och öde. Vi har tidigare visat att modulering av mitokondriell metabolism påverkar HSC ödet. I synnerhet genom att kemiskt avkoppla elektrontransportkedjan kunde vi bibehålla HSC-funktionen i odlingsförhållanden som normalt inducerar en snabb differentiering. Men begränsar HSC-nummer ofta utesluter användning av standardanalyser för att mäta HSC metabolism och därför förutsäga deras funktion. Här rapporterar vi ett enkelt flödescytometri-test som möjliggör tillförlitlig mätning av mitokondriell membranpotential och mitokondriell massa i knappa celler som HSCs. Vi diskuterar isolering av HSCs från mus benmärg och mätning av mitokondriell massa och membran potentiell post ex vivo kultur. Som ett exempel visar vi moduleringen av dessa parametrar i HSCs via behandling med en metabolisk modulator. Dessutom utökar vi tillämpningen av denna metod på mänskliga perifera blod-härledda T-celler och mänsklig tumör infiltrerande lymfocyter (TILs), visar dramatiska skillnader i deras mitokondriella profiler, möjligen återspeglar olika T-cell Funktionalitet. Vi tror att denna analys kan användas i screening för att identifiera modulatorer av mitokondriell metabolism i olika celltyper i olika sammanhang.

I figur 1 visar vi den gating strategi för isolering av hematopoietiska stamceller från mus benmärgen och layouten på plattan för sin ex vivo kultur. Figur 1a visar identifieringen av lymfocytfraktionen i SSC-A/FSC-en komplott. Doublets togs bort i linne Gate följt av identifiering av levande celler av avsaknaden av DAPI signal. LKS-populationen, definierad av Lineage-Sca1+ckit+, identifierades. Denna population är k...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

Här beskriver vi en tillförlitlig metod för att mäta mitokondriell massa och membran potential i ex vivo odlade hematopoietiska stamceller och T-celler.

Mätning av mitokondriell massa och membran potential i hematopoietiska stamceller och T-celler med flödescytometri

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

Detta protokoll är ett enkelt flöde cytometri-baserade analysen möjliggör mätning av mitokondriellt membran potential och mitokondriell massa i levande celler. Standard metabola analyser misslyckas när man arbetar med sällsynta populationer såsom hematopoietiska stamceller. Denna metod gör det möjligt för användare mitokondriellt membran profilering när du arbetar med lågt antal celler och att bestämma nya metaboliska modulatorer av celler som HSCs.Dessutom kan du kombinera det med nedströms funktionella analyser såsom benmärgstransplantation eller koloninbildande analyser för att bestämma funktionaliteten hos dina celler efter kultur. Vår teknik kan utnyttjas för identifiering av nya molekyler som kan förbättra HSC funktion i samband med benmärg transplantation och hematopoietic immun återhämtning efter ablativ terapier. Som beskrivs i vårt protokoll, vår metod kan användas för att utvärdera metabolisk lämplighet av immun-T-celler.Det är mycket viktigt att cellerna har minimal exponering för ljus efter färgning. Dessutom måste användningen av pumphämmare verapamil inkluderas för att utvärdera bidraget från pumpen efflux. Emellertid, användare måste vara medvetna om att verapamil djupt perturbs joniska jämvikt och kan inte användas för att utvärdera effekten av en metabolisk modulator på mitokondriellt membran potential.Visuell demonstration av denna metod är oerhört viktig eftersom det finns några kritiska steg som man måste ha i åtanke när man arbetar med lågt antal celler, och dessa steg saknas mycket ofta i de vanliga papper som användarna läser på PubMed. För FAC-sortering identifieras LKS-populationen, definierad av härstamningsnegativ, Sca1-positiv, cKit positiv. Hematopoetiska stamceller från omkring fem till 10% av cellerna i LKS-populationen identifieras genom gating för CD150 positiva, CD48 negativ population, märkt som HSCs.Efter hematopoietiska stamcellssortering, Centrifug rören på 300 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta försiktigt bort det mesta av supernatanten utan att lossa pelleten och låt 50 till 80 mikroliter vara ovanpå cellpelleten. Resuspend cell pelleten i stamceller expansionsmedium till en slutlig volym av 200 mikroliter.Förbered en steril vävnadskultur behandlad 96 U-botten brunnsplatta, och identifiera brunnarna där cellerna kommer att odlas. Överför 100 mikroliter av 2x basalt medium som tidigare framställts i dessa brunnar. I NR-märkta väl, tillsätt två mikroliter av en 100x nikotinamid riboside lösning.Överför 100 mikroliter av 2x basalt medium i brunnar för färgningskontroll. Frö 100 mikroliter av beredda hematopoitiska stamceller ovanpå brunnarna som innehåller 2x basalt medium. Frö 100 mikroliter av hela benmärgsceller på brunnar som är markerade som färgningskontroller.Tillsätt 200 mikroliter av autoklaverat vatten i alla omgivande brunnar för att minska avdunstning från brunnar som innehåller celler. Placera plattan ostört i en inkubator på 37 grader Celsius i 5%koldioxid i 72 timmar. Ta ut plattan för att fylla på nikotinamid riboside var 24 timmar, och lägg tillbaka den i inkubatorn.I slutet av odlingsperioden, tillsätt två mikroliter av 100x TMRM lösning och två mikroliter av 100x grön fluorescerande fläcklösning i var och en av test brunnarna. Lägg till två mikroliter av 100x TMRM i TMRM-infärgningskontrollen väl. Lägg till två mikroliter av 100x grön fluorescerande fläck i MitoTracker färgning kontroll väl.Täck överdelen av plattan med aluminiumfolie. och placera plattan tillbaka i en inkubator på 37 grader Celsius i 5%koldioxid i 45 minuter. Ta bort plattan från inkubatorn, och centrifugera den vid 300 gånger g i fem minuter.Invertera plattan för att ta bort supernatanten, och tillsätt 200 mikroliter av standard FACS-buffert till resuspend. Täck plattan med folie. Centrifugera plattan vid 300 gånger g i fem minuter.Upprepa detta tvättsteg tre gånger. Resuspend cellerna i 200 mikroliter av FACS buffert, och överföring till FACS rör. För att köra proverna på flödescytometern, först ladda den enda färgkontroller i maskinen, och spela in minst 5, 000 händelser i var och en efter en.I programvaran trycker du på Acquire och sedan Spela in på instrumentpanelen för att skaffa och spela in kontroller med enstaka färger. Tryck på Kompensationsinställning och klicka på Beräkna kompensation för att beräkna kompensationen. När ersättningen har tillämpats, förvärva det hematopoetiska stamcellsprovet, och registrera så många händelser som möjligt.Exportera FACS-filerna från cytometern, och öppna filen på analysprogramvaran. På FlowJo använder du framåtspridning och sidospridningsgreating för att identifiera cellpopulationen. Identifiera entorna i nästa grindar och rita sedan in den negativa fraktionen FÖR DAPI som representerar levande celler.I levande cell gate, gör en kontur tomt i TMRM och gröna fluorescerande fläck kanal för att mäta mitokondriellt membran potential och massa, respektive. Exportera medelvärdet fluorescens intensitet av dessa två kanaler i levande cell gate. Sedan exporterar du andelen celler i TMRM-låggrinden i alla prover.Den nikotinamid riboside behandling visade en tydlig ökning av TMRM låg befolkningen. det ökade också signifikant andelen celler i TMRM låg gate och visade en betydande sänkning av TMRM fluorescens intensitet. Mitokondriellt massa inte ändras vid nikotinamid riboside tillskott.Dessutom, stamcellsmarkören färgning kombinerades med mitokondriellt färgning post-kultur. Med den gating strategi för att identifiera hematopoietic stamceller, exponering för nikotinamid riboside visade en betydande ökning av TMRM låg befolkningen och en betydande minskning av TMRM fluorescens intensiteten i gated HSCs. Den gröna fluorescerande mitokondriell fläcken grön signalen förblev oförändrad i de två villkoren.Det är viktigt att täcka infärgningsplattan med aluminiumfolie för att minimera exponeringen av ljus för färgade prover. Denna metod kan kombineras med nedströms analyser såsom benmärgstransplantation och koloninbildande analyser för att bestämma funktionaliteten hos dina stamceller. Så denna teknik möjliggör en enkel screeningmetod för identifiering av nya metaboliska modulatorer av HSCs.

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolering och transplantation av hematopoetiska stamceller (HSCs)

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Kvantitativ mätning av GLUT4 Translokation till plasmamembranet med flödescytometri

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosoliska Kalcium Mätningar i Renal epitelceller med flödescytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

High Efficiency Differentiering av Human pluripotenta stamceller till Cardiomyocytes och karakterisering av flödescytometri

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Samtidig mätning av mitokondrie kalcium och mitokondriell membranpotential i levande celler genom fluorescensmikroskopi

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Analys av cellsuspensioner Isolerade från fasta vävnader från Spectral flödescytometri

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...